Name: Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Lernen Sie die Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays mit Eigelb-Antikörpern für die Antigendetektion. Diese Methode nutzt Latexperlen und Durchflusszytometrie zur zuverlässigen Analyse von Immunoassays.

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Wir danken dem FIOCRUZ ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), dem Postgraduiertenprogramm in Biotechnologie (PPGBIOTEC an der Universidade Federal do Amazonas - UFAM), der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) und der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) für die Bereitstellung der Stipendien. Abbildung 2 und Abbildung 4 wurden mit biorender.com erstellt.

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Extraktion von IgY aus Eigelb
<ol><li>Hygienisierung der Eier<ol><li>Tauchen Sie die Eier (frisch gelegt oder bis 4 Tage nach der Lege, aus der Linie Gallus gallus Dekalb White) in eine 0,2%ige verdünnte Lösung von Natriumhypochlorit, spülen Sie sie schnell unter fließendem Wasser ab und wischen Sie sie für eine spätere oder sofortige Verwendung vorsichtig ab. HINWEIS: Bei nicht sofortiger Anwendung bis zu 15 Tage bei 4 °C aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Trennung des Eigelbs<ol><li>Das Ei vorsichtig aufschlagen und das Eigelb mit Hilfe eines Dotterseparators vom Eiweiß trennen.</li>
		<li>Entfernen Sie das überschüssige Weiß mit Hilfe von Filterpapier. Stechen Sie das Eigelb ein und sammeln Sie sein Inneres in einem konischen 50-ml-Röhrchen. Lagern Sie das Eigelb vor Gebrauch mindestens 24 Stunden bei −20 °C. ANMERKUNG: Während dieser Experimente (Daten nicht gezeigt) wurde beobachtet, dass die Verwendung von Eigelb, das zuvor nicht eingefroren worden war, die Isolierung von Immunglobulinen aus dem Lipidanteil des Eigelbs behinderte.</li>
	</ol></li>
	<li>Ansäuerung des Eigelbs<ol><li>Tauen Sie das gelagerte Eigelb auf und verdünnen Sie es im Verhältnis 1:10 in 1 mM PBS. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 1 N HCl auf 5 ein und inkubieren Sie die Lösung bei 4 °C für 6-24 Stunden.</li>
		<li>Die Lösung wird 40 min lang bei 3.000 × g zentrifugiert, der Überstand zurückgewonnen und mit einem 0,7-mm-Zellulosefilter filtriert.</li>
	</ol></li>
	<li>Ausfällung von Lipiden mit Caprylsäure<ol><li>Man stellt den pH-Wert der Überstände wieder auf 5 ein und gibt die Caprylsäure (≥98 % Anfangskonzentration) unter ständigem Rühren 30 min bei 4 °C auf eine Endkonzentration von 8,7 %. ANMERKUNG: Das Volumen des Überstandes kann in Abhängigkeit von der in Schritt 1.3.2 ausgefällten Lipidmasse variieren. So sollten beispielsweise 3,107 ml Caprylsäure zu 35 ml des nach der Filtration erhaltenen Überstandes gegeben werden.</li>
		<li>Die Proben werden 15 min lang bei 18.600 × g zentrifugiert und der Überstand vom gefällten Material getrennt.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 1 M NaOH auf 7,4 um, quantifizieren Sie die Antikörper mit dem Bradford-Assay8 und lagern Sie die Antikörper bis zum Zeitpunkt der Anwendung bei −20 °C. HINWEIS: Die Antikörper wurden in einer Konzentration von 1 μg/μl erhalten, die mit einem 12%igen SDS-PAGE-Gel verifiziert wurde.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sättigungskurve von IgY-Antikörpern gegen Latexkügelchen
<ol><li>Kopplung der Beads an die IgY-Antikörper<ol><li>21 μl 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Anfangskonzentration von 367 mM) und 21 μl N-Hydroxysuccinimid (NHS, Anfangskonzentration von 50 mM) zu 21 μl Latexkügelchen (4 % w/v) zugeben und mit gefiltertem 10 mM PBS auf ein Endvolumen von 2,1 ml einstellen. ANMERKUNG: Der pH-Bereich der PBS-Lösung sollte zwischen 7,2 und 7,4 liegen, da in dieser Arbeit eine negative Änderung der Kopplung und anderer Schritte beobachtet wurde, wenn eine Lösung außerhalb dieses Bereichs verwendet wurde.</li>
		<li>Bei 22 °C unter schnellem Schütteln 3 h inkubieren.</li>
		<li>Man gibt 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0,5 μg, 0,25 μg, 0,125 μg und 0 μg des zuvor extrahierten Fängerantikörpers IgY-Pf HRP2 (siehe Schritt 1.4.3) zu verschiedenen Mikroröhrchen, die 100 μl der in Schritt 2.1.1 beschriebenen Lösung (0,04 % endgültige Kügelchenkonzentration) enthalten, und inkubiert unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 2.1.2 für 16 Stunden.</li>
		<li>Die Proben werden bei 857 × g bei 15 °C für 5 min zentrifugiert, die Überstände verworfen und die Latexkügelchen zweimal mit 500 μl gefiltertem 10 mM PBS (0,008 % Endkonzentration der Kügelchen) unter Verwendung von Zentrifugations- und Resuspensionszyklen gewaschen. ANMERKUNG: Überschreiten Sie nicht 857 × g, da in dieser Arbeit beobachtet wurde, dass die Perlen oberhalb dieser Geschwindigkeit Verformungen erfahren, die das Testergebnis negativ beeinflussen.</li>
	</ol></li>
	<li>Blockieren der Perlen<ol><li>Die Proben werden in 1 ml Blockierungspuffer (0,004 % endgültige Kügelchenkonzentration) (filtriert 10 mM PBS + Rinderserumalbumin, BSA, 5 %) resuspendiert und 2 h lang unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 2.1.2 beschrieben inkubiert.</li>
		<li>Nach dem Blockieren wie in Schritt 2.1.4 beschrieben waschen und in 10 mM PBS-Puffer resuspendieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubation mit Anti-Hühner-Sekundärantikörpern, markiert mit Alexa Fluor 488<ol><li>Zu jedem Mikroröhrchen werden 100 μl fluoreszierender Anti-Hühner-Antikörper (2 mg/ml), verdünnt auf 1:2.000 in 10 mM PBS + 0,5 % BSA, in jedes Mikroröhrchen gegeben, wie in Schritt 2.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Die Proben werden wie in Schritt 2.1.2 beschrieben 30 Minuten lang im Dunkeln inkubiert.</li>
		<li>Die Kügelchen werden wie in Schritt 2.1.4 gewaschen und mit 250 μl (0,016 % Endkonzentration der Kügelchen) gefilterten 10 mM PBS resuspendiert. Führen Sie die Durchflusszytometerablesung wie in Abschnitt 5 beschrieben durch. HINWEIS: Anhand der erhaltenen Fluoreszenzprozentdaten ist der Anfangspunkt der Plateaubildung zu beobachten (1 μg, wie in dieser Studie beobachtet). Wir empfehlen, den zweiten Punkt des Plateaus (2 μg, wie hier beobachtet) für die nächsten Schritte zu verwenden (Abbildung 1).</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig01.jpg"> Abbildung 1: Grafik der Durchflusszytometrie-Analyse zur Bestimmung des Sättigungspunktes der IgY-Pf HRP2 Antikörper-Kopplung an die Latexkügelchen. Die x-Achse stellt die Antikörperkonzentration dar, und die Y-Achse stellt die prozentuale Fluoreszenz dar. Kruskal-Wallis-Test, S. &lt; 0,0033. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65123/65123fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
3. Durchflusszytometrie-Assay auf Basis von Latexkügelchen zum Antigennachweis
<ol><li>Nachdem Sie den Sättigungspunkt der IgY-Antikörper gegen die Latexkügelchen bestimmt haben, führen Sie den Bead-Aktivierungsprozess gemäß Schritt 2.1.1 erneut durch.<ol><li>Die Kügelchen werden bei der beobachteten Sättigungskonzentration (wie in Schritt 2.1.3 beschrieben) gekoppelt und gemäß Schritt 2.1.2 inkubiert. HINWEIS: In den Assays, die mit dem IgY-PfHRP2-Antikörper durchgeführt wurden, betrug die Sättigungsbedingung 2 μg pro 1 μl Latexkügelchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Blockieren und waschen Sie die Perlen gemäß Schritt 2.2.</li>
	<li>Inkubation mit dem Antigen<ol><li>Um die Nachweisgrenze zu bestimmen, wird das Äquivalent von 100 μl der blockierten Kügelchenzubereitung in Röhrchen verteilt, die unterschiedliche Mengen des rekombinanten Proteins Pf HRP2 (1 μg/ml) (rPfHRP2, 10 μg, 1 μg, 0,1 μg, 0,01 μg, 0,001 μg, 0,0001 μg und 0 μg) enthalten, verdünnt in 10 mM PBS + 0,5% BSA in dreifacher Ausführung. HINWEIS: Dieses rekombinante Protein wurde in der Arbeit von Sousa et al.9 entwickelt.</li>
		<li>Die Kügelchenlösungen werden mit dem Protein rPfHRP2 wie in Schritt 2.1.2 beschrieben für 1 h inkubiert.</li>
		<li>Führen Sie Waschvorgänge wie in Schritt 2.1.4 beschrieben durch und entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubation mit dem Primärantikörper<ol><li>2 μg Maus-IgG-Antikörper gegen das Protein rPfHRP2, verdünnt in 10 mM PBS + 0,5 % BSA, zu einem Endvolumen von 100 μl in jeder Probe zugeben. Die Proben werden wie in Schritt 2.1.2 beschrieben inkubiert und der Überstand nach der letzten Zentrifugation verworfen. HINWEIS: Dieser Antikörper wurde in der Arbeit von Sousa et al.9 entwickelt.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubation mit dem Sekundärantikörper<ol><li>Zu jeder Probe werden 100 μl fluoreszierender Anti-Maus-Antikörper (2 mg/ml), verdünnt auf 1:2.000 in 10 mM PBS + 0,5 % BSA, gegeben. Es wird wie in Schritt 2.1.2 beschrieben inkubiert und in 250 μl (0,016 % endgültige Kügelchenkonzentration) filtriertem 10 mM PBS resuspendiert. Führen Sie die Ablesung gemäß Abschnitt 5 durch.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Durchflusszytometerablesung der Proben
<ol><li>Zytometrie-Einstellung: Ausrichtung der optischen Parameter des an einen Computer gekoppelten Zytometers<ol><li>Schalten Sie den Computer und das Durchflusszytometer ein und warten Sie einige Minuten, bis das Gerät eine Verbindung zum Computer hergestellt hat.</li>
		<li>Klicken Sie auf die auf dem Computer installierte Zytometrie-Software und melden Sie sich an. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software die Option Zytometer | Inbetriebnahme | Sauberer Modus | SIT-Flüssigkeiten. HINWEIS: Luftblasen und Verstopfungen sollten während des Zytometer-Initiierungsprozesses vor der Probenentnahme entfernt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Qualitätskontrolle<ol><li>Verwenden Sie das Reagenz zur Qualitätskontrolle, um die Spannungen der Photomultiplier-Röhrchen zu überprüfen und die Empfindlichkeit des Zytometers zu beurteilen.</li>
		<li>Platzieren Sie das Zytometer-Setup-Reagenz und die Tracking-Kügelchen in einem 12 mm x 75 mm großen Styroporröhrchen.</li>
		<li>Mischen Sie das Röhrchen vorsichtig durch Vortexen.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Suspensionsperlen<ol><li>Um den Ausgangswert zu definieren, geben Sie 0,5 ml Verdünnungsmittel (10 mM gefiltertes PBS, pH 7) und drei Tropfen Kügelchen in das 12 mm x 75 mm große Styroporröhrchen. Den Schlauch vor Gebrauch vorsichtig abziehen.</li>
		<li>Wählen Sie im Arbeitsbereich der Zytometer-Software Zytometer | CST und warten Sie, bis das Zytometer von der Zytometer-Softwareschnittstelle getrennt und eine Verbindung zur CS&amp;T-Schnittstelle hergestellt hat. Beachten Sie die folgende Meldung in der Statusleiste der Zytometer-Software am unteren Bildschirmrand: Zytometer getrennt.</li>
		<li>Verwenden Sie das 12 mm x 75 mm große Polystyrolröhrchen mit dem Reagenz für die Qualitätskontrolle und befestigen Sie es an der Durchflusszytometersonde.</li>
	</ol></li>
	<li>Verifizierung der Zytometerkonfiguration<ol><li>Überprüfen Sie im Fenster Systemübersicht , ob die Zytometerkonfiguration für das Experiment geeignet ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Setup für eine Leistungsprüfung<ol><li>Wählen Sie die ID der Setup-Perlen aus, die der Charge der CS&amp;T-Forschungsperlen entspricht.</li>
	</ol></li>
	<li>Leistungsprüfung<ol><li>Befestigen Sie das Röhrchen an der Durchflusszytometersonde und klicken Sie auf das Fenster Setup-Steuerung . Wählen Sie Leistung überprüfen und klicken Sie auf Ausführen.</li>
		<li>Sobald die Leistungsüberprüfung abgeschlossen ist, warten Sie, bis ein Dialogfeld geöffnet wird. Führen Sie einen der folgenden Schritte aus:<ol><li>Um den Zytometer-Leistungsbericht anzuzeigen, klicken Sie auf Bericht anzeigen.</li>
			<li>Um die Leistungsprüfung abzuschließen und zur Setup-Ansicht des Arbeitsbereichs zurückzukehren, klicken Sie auf Fertig stellen.</li>
			<li>Sehen Sie sich das Endergebnis der morphometrischen und Fluoreszenz-Sensitivitätsanalyse an, das in der Systemzusammenfassung | Zytometer-Leistungsergebnis mit dem Status PASSED.</li>
			<li>Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Zytometer. Überprüfen Sie die Leistungsergebnisse des Zytometers, die im Fenster "Systemübersicht" angezeigt werden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>5. Probenanalyse mittels Durchflusszytometrie
<ol><li>Melden Sie sich bei der Zytometer-Software an.<ol><li>Wählen Sie im Arbeitsbereich der Zytometer-Software die Option Zytometer | Sauberer Modus | SIT-Flüssigkeiten.</li>
		<li>Passen Sie sich an den Arbeitsbereich der Software an.</li>
		<li>Definieren Sie die Gating-Strategie basierend auf den morphometrischen und Fluoreszenzeigenschaften der Negativkontrollpartikel (Kügelchen ohne Fluoreszenz).</li>
		<li>Um die Zellmorphometrie zu bestimmen, wählen Sie Dot-Plot-Grafik für die Analyse der FSC-A-Parameter mit SSC-A (Ergänzende Abbildung 1A). </li>
		<li>Bestimmen Sie einzelne Zellen mit SSC unter Verwendung der Dot-Plot-Grafik für die Analyse von SSC-H auf der y-Achse und SSC-W auf der x-Achse (Ergänzende Abbildung 1B) und bestimmen Sie einzelne Zellen durch FSC mit der Dot-Plot-Grafik für die Analyse von FSC-H auf der y-Achse und FSC-W auf der x-Achse (Ergänzende Abbildung 1C).</li>
		<li>Für die Fluoreszenzanalysen wählen Sie FL1 Dot Plot Plots mit FCS-A. Verwenden Sie ein 12 mm x 75 mm großes Polystyrolröhrchen mit Stopfen und Proben mit unmarkierten Proben und Proben, die zuvor mit einfarbigem Alexa Fluor 488 gekennzeichnet wurden (ergänzende Abbildung 1D, E).</li>
	</ol></li>
	<li>Erfassen Sie die Probe in der Durchflusszytometrie.<ol><li>Verwenden Sie ein 12 mm x 75 mm großes Styroporröhrchen mit Stopfen, das die zuvor markierten Proben enthält. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens sorgfältig, befestigen Sie das Röhrchen an der Durchflusszytometersonde und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Erfassen.</li>
		<li>Um die Leistung der Laser einzustellen, klicken Sie auf Parameter und stellen Sie in den folgenden Optionen die Spannung des FSC auf 182 V und die Spannung des SSC auf 236 V ein. Um den Schwellenwert einzustellen, klicken Sie auf Zytometer | Schwellenwert und stellen Sie in den folgenden Optionen die Kolzov-Platte auf 500 V ein.</li>
		<li>Stellen Sie das Analysegatter ein, um Partikel nach Größe und Komplexität zu charakterisieren und Einzelzellanalysen durchzuführen.</li>
		<li>Um die Autofluoreszenz zu entfernen, analysieren Sie die farbstofffreie Probe, die nur die Latexkügelchen enthält, und passen Sie die Spannungen des Detektors an: Stellen Sie in den folgenden Optionen die Spannung des FL1 (FITC) auf 332 V ein.</li>
		<li>Stellen Sie das Fluoreszenzanalyse-Gate im viereckigen Format von dem negativen Punkt aus, der im Punktdiagramm angezeigt wird.</li>
		<li>Nachdem die morphometrischen und fluoreszierenden Analysen angepasst wurden, konfigurieren Sie das Gerät für 50.000 Ereignisse: Klicken Sie unter Erfassung auf Aufzeichnen.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine potenziellen Interessenkonflikte in Bezug auf die Forschung, die Autorenschaft und die Veröffentlichung dieses Artikels bestehen.

Die Methode der Fällung des IgY-Antikörpers durch pH-Reduktion mit anschließender Lipidtrennung mit Caprylsäure ist effizient bei der Isolierung von Gesamtantikörpern ohne Funktionsverlust. Die hier vorgeschlagene Methode ist einfacher und billiger als die von Redwan et al.11 beschriebene, die ebenfalls eine Ausfällung durch Versauerung und Caprylsäure verwendeten, jedoch mit einem komplexeren und mühsameren Protokoll. Diese Methode bietet auch Vorteile gegenüber häufig verwendeten Methoden zur Is...

Unter den Immunoassay-Techniken zur Diagnose von Krankheiten hat sich der zytometrische Bead-Assay als hochempfindlicher und zuverlässiger Ansatz herausgestellt, da er die Analyse von Tausenden von Partikeln in einem einzigen Assay ermöglicht1. Diese Technik bietet nicht nur eine hohe Produktivität und die Verwendung kleinerer Probenvolumina, sondern auch eine große Flexibilität, da sie den Nachweis mehrerer Moleküle wie Zytokine, Adhäsionsmoleküle, Antikörperisotypen und Proteine ermöglicht 2,3.
Für die Entwicklung dieser Assays werden verschiedene Partikel verwendet, darunter Latexperlen, die ein effektiver und kostengünstiger Input sind. Diese können Modifikationen auf ihrer Oberfläche aufweisen, wie z. B. das Vorhandensein funktioneller Gruppen oder Proteine, die die kovalente oder nicht-kovalente Kopplung bestimmter Moleküle ermöglichen 3,4,5.
Diese Immunoassays verwenden Komponenten wie Antigene und Antikörper, um den Nachweis von Krankheitsmarkern durchzuführen, und erfordern in der Regel Antikörper von Säugetieren wie Mäusen, Kaninchen und Ziegen. Dies führt zu ethischen Problemen, da die Immunisierung von Säugetieren in der Regel viele Tiere erfordert, um einen guten Ertrag zu erzielen, sowie die häufige Durchführung von Verfahren, die zum Leiden der Tiere führen 6,7. Eine Alternative dazu ist die Verwendung von IgY-Antikörpern, die aus dem Eigelb immunisierter Hühner isoliert wurden, da im Eigelb hohe Konzentrationen der spezifischen Antikörper gegen die inokulierten Antigene zu finden sind; Die Produktion eines Huhns entspricht der Produktion von 4,3 Kaninchen im Laufe eines Jahres 6,7.
Daher ist es das Ziel dieses Protokolls, eine Methode zur Bewertung von IgY-Antikörpern bereitzustellen, die aus Hühnereigelb mittels Durchflusszytometrie mit Latexkügelchen gewonnen wurden. Zu diesem Zweck schlagen wir eine Standardisierungsmethode für einen zytometrischen Bead-Immunoassay im Sandwich-Format unter Verwendung von Latex-Beads vor. Als Modell haben wir IgY-Antikörper verwendet, die gegen das histidinreiche Protein-II-Antigen Plasmodium falciparum (IgY-Pf HRP2) gerichtet sind. Wir beschreiben eine Methode zur Extraktion der Antikörper, diskutieren die kritischen Schritte zur Bestimmung der Kopplungskonzentration dieser Antikörper an die Latexkügelchen und präsentieren eine Bewertung der Nachweisgrenze des Antigens. Die hohe Genauigkeit der Durchflusszytometrie, gepaart mit den niedrigen Kosten von Latexkügelchen, machen diese Technik für die Analyse von Immunoassay-Werkzeugen wie Antikörpern und Antigenen anwendbar. Diese Methode kann für die Detektion verschiedener Ziele verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Anti-Hühner-IgY (H+L), stark kreuzadsorbiert, CF&nbsp; 488A-Antikörper, hergestellt in Esel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG (H+L), F(ab&prime;)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600388</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td>BF-FACSC2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva CS& T Forschungsperlen (CS& BD</td> <td>Biosciences</td><td>655050</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software 7.0</td><td>BD Biosciences</td><td>655677</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Farbstoffreagenzkonzentrat</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Caprilsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3907</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td>Z606936</td><td></td></tr><tr><td>Chlorid 37% Säure</td><td>Molekularqualität NEON</td><td>02618 NEON</td><td></td></tr><tr><td>CML Latex, 4% w/v</td><td>Invitrogen</td><td>C37253</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 8R</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-HM8R</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime;-ethylcarbodiimide Hydrochlorid Pulver (EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7750-1G</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid (NHS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672-25G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1003335620</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Acs Cientifica</td><td>P.10.0594.024.00.27</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit</td><td>Acs Cientifica</td><td>R09211000</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer Heat/Cool</td><td>KASVI</td><td>K80-120R</td><td></td></tr></tbody></table>

standardisierung eines zytometrischen bead-assays auf basis von eigelb-antikörpern

Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies

Immunoassays sind wichtige Tests für den Nachweis zahlreicher molekularer Ziele. Unter den derzeit verfügbaren Methoden hat der zytometrische Bead-Assay in den letzten Jahrzehnten an Bedeutung gewonnen. Jede Mikrosphäre, die vom Gerät gelesen wird, stellt ein Analyseereignis der Wechselwirkungskapazität zwischen den zu testenden Molekülen dar. Tausende dieser Ereignisse werden in einem einzigen Assay abgelesen, wodurch eine hohe Assaygenauigkeit und Reproduzierbarkeit gewährleistet wird. Diese Methodik kann auch bei der Validierung neuer Inputs, wie z. B. IgY-Antikörper, für die Diagnose von Krankheiten eingesetzt werden. Diese Antikörper werden gewonnen, indem Hühner mit dem interessierenden Antigen immunisiert und dann das Immunglobulin aus dem Eigelb der Tiere extrahiert wird. Daher ist dies eine schmerzfreie und hochproduktive Methode zur Gewinnung der Antikörper. Neben einer Methodik zur hochpräzisen Validierung der Antikörpererkennungskapazität dieses Assays wird in dieser Arbeit auch eine Methode zur Extraktion dieser Antikörper, zur Bestimmung der besten Kopplungsbedingungen für die Antikörper und Latexkügelchen und zur Bestimmung der Sensitivität des Tests vorgestellt.

Abbildung 2 zeigt eine grafische Darstellung des Extraktionsprozesses von IgY-Antikörpern durch Ansäuerung und anschließende Trennung mit Caprylsäure (Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65123/65123fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung des Extraktionsschritts von IgY-Antikörpern und der Trennung...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Herstellung von Latexkügelchen für Assays mit IgY-Antikörpern für den Antigennachweis.

Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern

Immunoassays are important tests for the detection of numerous molecular targets. Among the methods currently available, the cytometric bead assay has ...

Unter den Immunoassay-Techniken, die auf die Diagnose von Krankheiten abzielen, hat sich der zytometrische Bead-Assay als hochempfindlicher und zuverlässiger Ansatz erwiesen, der Tausende von Partikeln in einem einzigen Assay analysiert. Die hohe Genauigkeit der Durchflusszytometrie, gepaart mit den niedrigen Kosten von Latexkügelchen, machen unsere Technik für die Analyse von Immunoassays-Werkzeugen wie Antikörpern und Antigenen anwendbar. IgY-Antikörper haben niedrige Kosten und ethische Vorteile bei ihrer Herstellung und können als Nachweisinstrument für seltene Krankheiten verwendet werden.Beginnen Sie damit, die frisch gelegten oder vier Tage alten Eier der Linie Gallus gallus Deckle White in eine 0,2%ige verdünnte Lösung von Natriumhypochlorit zu tauchen. Spülen Sie sie schnell unter fließendem Wasser ab und wischen Sie sie vorsichtig ab. Das Ei vorsichtig aufschlagen, das Eigelb mit Hilfe eines Eigelbabscheiders vom Eiweiß trennen.Und entfernen Sie das überschüssige Weiß mit Filterpapier. Stechen Sie das Eigelb ein und sammeln Sie sein Inneres in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Lagern Sie das Eigelb vor der Anwendung mindestens 24 Stunden bei minus 20 Grad Celsius.Nachdem Sie das gelagerte Eigelb aufgetaut haben, verdünnen Sie es im Verhältnis eins zu 10 in einem millimolaren PBS. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einer normalen Salzsäure auf fünf ein und inkubieren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius für sechs bis 24 Stunden. Die Lösung wird 40 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert und der zurückgewonnene Überstand mit einem 0,7-Millimeter-Zellulosefilter filtriert, bevor der pH-Wert des Überstands auf fünf eingestellt wird.Caprylsäure wird unter ständigem Rühren 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bis zu einer Endkonzentration von 8,7 % zugegeben. Nachdem Sie die Proben 15 Minuten lang zentrifugiert haben, trennen Sie den Überstand vom gefällten Material. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem molaren Natriumhydroxid auf 7,4 um.Und quantifizieren Sie die Antikörper mit dem Bradford-Assay, bevor Sie sie bei minus 20 Grad Celsius lagern. Füge 21 Mikroliter EDC und 21 Mikroliter NHS zu 21 Mikrolitern Latexkügelchen hinzu. Und stellen Sie sich auf ein Endvolumen von 2,1 Millilitern ein, mit gefiltertem 10 Millimolar PBS.Die Lösung wird bei 22 Grad Celsius unter schnellem Schütteln drei Stunden lang inkubiert. Geben Sie den zuvor extrahierten Fängerantikörper IgY PfHRP2 in verschiedene Mikroröhrchen, die 100 Mikroliter dieser Lösung enthalten. Und erneut 16 Stunden inkubieren.Nach dem Zentrifugieren der Proben und dem Verwerfen der Überstände werden die Latexkügelchen zweimal mit 500 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS gewaschen, wobei Zentrifugations- und Resuspensionszyklen verwendet werden. Für die Blockierung der Kügelchen werden die Proben in einem Milliliter Blockierungspuffer resuspendiert und befolgen Sie das gleiche zuvor gezeigte Verfahren, um sie zwei Stunden lang zu inkubieren. Nachdem Sie die Kügelchen mit PBS gewaschen haben, resuspendieren Sie sie erneut in 10 Millimolar PBS-Puffer.In jedes Mikroröhrchen werden 100 Mikroliter fluoreszierender Anti-Hühner-Antikörper, verdünnt auf eins zu 2000 in einer 10-millimolaren Mischung aus PBS und BSA, gegeben. Inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln. Nachdem Sie die Perlen gewaschen haben, resuspendieren Sie sie erneut mit 250 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS.Die Nachweisgrenze wird bestimmt, indem 100 Mikroliter des blockierten Kügelchenpräparats in Röhrchen verteilt werden, die unterschiedliche Mengen des verdünnten rekombinanten Proteins PfHRP2 in dreifacher Ausführung enthalten. Die Kügelchenlösungen mit dem Protein bei 22 Grad Celsius unter schnellem Schütteln eine Stunde lang inkubieren. Waschen Sie die Kügelchen mit 500 Mikrolitern gefiltertem 10 Millimolar PBS unter Zentrifugation, wie zuvor gezeigt.Nach dem Verwerfen des Überstandes werden zwei Mikrogramm Maus-IgG-Antikörper gegen das rekombinante Protein, verdünnt in 10 Millimolar PBS und BSA, in jede Probe gegeben und das gleiche Verfahren für die Inkubation befolgt. Als nächstes werden 100 Mikroliter des verdünnten fluoreszierenden Anti-Maus-Antikörpers zu jeder Probe gegeben. Nach der Inkubation wird die Probe in 250 Mikroliter filtriertem 10 Millimolar PBS resuspendiert.Schalten Sie den Computer und das Durchflusszytometer ein und warten Sie einige Minuten, bis das Gerät eine Verbindung zum Computer hergestellt hat. Klicken Sie auf die auf dem Computer installierte Zytometrie-Software und melden Sie sich an. Wählen Sie im Arbeitsbereich der Software Zytometer, gefolgt von Fluidik-Start, Reinigungsmodi und SIT-Spülung aus.Definieren Sie die Gating-Strategie basierend auf den morphometrischen und Fluoreszenzeigenschaften des Negativkontrollpartikels. Um die Zellmorphometrie zu bestimmen, wählen Sie für die Analyse der Parameter der Vorwärtsstreuung A die Punktplotgrafik mit der Seitenstreuung A.Bestimmen Sie die einzelnen Zellen durch die Seitenstreuung mit der Punktplotgrafik für die Analyse der Seitenstreuung W in der Y-Achse und der Seitenstreuung H in der X-Achse. Und bestimmen Sie die einzelnen Zellen durch Vorwärtsstreuung, indem Sie die Punktdiagrammgrafik für die Analyse der Vorwärtsstreuung W auf der Y-Achse und der Vorwärtsstreuung H auf der X-Achse verwenden.Wählen Sie für die Fluoreszenzanalyse FL1-Punktdiagramme mit Vorwärtsstreuung A. Verwenden Sie ein Styroporröhrchen mit Stopfen und Proben, die zuvor mit einfarbigem Alexa Fluor 488 markiert wurden, und mischen Sie den Inhalt des Röhrchens vorsichtig. Befestigen Sie das Röhrchen an der Durchflusszytometersonde und klicken Sie mit der linken Maustaste auf Erfassen. Um die Leistung der Laser einzustellen, klicken Sie auf Parameter und stellen Sie in den folgenden Optionen die Spannung der Durchlassstreuung auf 182 Volt und die Spannung der Seitenstreuung auf 236 Volt ein.Um den Schwellenwert am Zytometer einzustellen, klicken Sie auf Schwellenwert und stellen Sie in den folgenden Optionen die FSC auf 500 Volt ein. Stellen Sie das Analysegatter ein, um Partikel nach Größe und Komplexität zu charakterisieren und Einzelzellanalysen durchzuführen. Entfernen Sie die Autofluoreszenz, indem Sie die farbstofffreie Probe, die nur die Latexkügelchen enthält, analysieren und die Spannung des Detektors FL1 FITC auf 332 Volt einstellen.Stellen Sie das Fluoreszenzanalyse-Gate im viereckigen Format ein, ausgehend von dem negativen Punkt, der im Punktdiagramm angezeigt wird. Nachdem die morphometrischen und fluoreszierenden Analysen angepasst wurden, konfigurieren Sie das Gerät für 50.000 Ereignisse und klicken Sie auf Aufzeichnen. Die elektrophoretischen Profile des IgY-PfHRP2-Antikörpers, bedingt durch die Trennung mit Caprylsäure, sind hier dargestellt.Aus dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die Antikörper vor und nach der Caprylsäuretrennung ähnliche elektrophoretische Profile aufwiesen, mit charakteristischen Banden von 65 Kilodalton und 27 Kilodalton, die sich auf die leichten und schweren Ketten des IgY beziehen. Darüber hinaus sind auch andere Banden sichtbar, wahrscheinlich aufgrund des C-terminalen Eigelbprotein-Vitellogenin-II-Vorläufers. Die Beurteilung der Antikörpersättigungskonzentration auf Latexkügelchen ist für die Entwicklung eines Immunoassays mit den Kügelchen von entscheidender Bedeutung.Eine Kurve der prozentualen Fluoreszenz verschiedener Konzentrationen von Antikörpern, gekoppelt an jeden Mikroliter kommerzieller Latexkügelchen, ist hier dargestellt. Mit steigender Konzentration stiegen auch die Prozentwerte an und erreichten ein Plateau bei zwei Mikrogramm Antikörperkonzentration, was sie als optimale Kopplungskonzentration für den Zielantigen-Immunoassay etablierte. Die Nachweisgrenze wurde bestimmt, indem der Fluoreszenzprozentsatz der Latexgeschwindigkeitsreaktivität gegen unterschiedliche rPfHRP2-Proteinkonzentrationen bestimmt wurde.Bei einem Sandwich-Immunoassay wurde beobachtet, dass die Fluoreszenz ab 0,01 Mikrogramm PfHRP2-Protein erhöht war und bei 0,1 Mikrogramm ein Plateau erreichte. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Fluoreszenz bei null Mikrogramm und 0,01 Mikrogramm. Ein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenz wurde jedoch bei 0,01 Mikrogramm, 0,1 Mikrogramm und 10 Mikrogramm beobachtet.Der Waschschritt dieses Protokolls ist entscheidend, um den Verlust von Perlen zu vermeiden. Das Messgerät muss gut definiert sein, damit das erzielte Ergebnis keine Fehler aufweist. Die hier beschriebenen Schritte stellen eine wichtige Standardisierung dar, die notwendig ist, um die Zuverlässigkeit der diagnostischen Tests mit Latexkügelchen zu gewährleisten, die mittels Vollzytometrie ausgewertet werden.Daher ist diese Methodik eine Alternative zu den klassischen Sandwich-Testmodellen. Diese Methode kann auf verschiedene Arten von Assays angewendet werden und eignet sich sowohl für die Übertragung mehrerer Moleküle auf die Oberfläche der Kügelchen als auch für die Detektion verschiedener Analyten.

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

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Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

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Standardisierung des Transfers zwischen Laboren zwischen Durchflusszytometern zum Nachweis von Lymphozyten bei mit japanischer Enzephalitis geimpften Kindern

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Standardisierung eines zytometrischen Bead-Assays auf Basis von Eigelb-Antikörpern

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