Name: Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Lernen Sie CRISPR-basierte Genom-Engineering in der Mäuse-Eileiter zur Untersuchung von Krebsentstehung. Diese Methode ermöglicht gezielte Mutationen in sporadischen Zellen innerhalb immunkompetenter Umgebungen.

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Die Autoren danken Katie Teng und Dr. Matthew J. Ford für die Bereitstellung von Plasmiden, die zur Generierung repräsentativer Ergebnisse und zur Protokolloptimierung verwendet werden. K.H. wurde durch das Promotionsstipendium des Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), die Donnor Foundation, das Delta Kappa Gamma World Fellowship, das Centre for Research in Reproduction and Development (CRRD), Hugh E. Burke, Rolande & Marcel Gosselin und Alexander McFee unterstützt.

Die Tiere wurden in statischen Mikroisolationskäfigen mit Filteroberteilen untergebracht, die sich in einem speziellen Raum befanden, in dem sich eine Biosicherheitswerkbank vom Typ II befand. Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Tierpflegeausschuss der Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften der McGill University (AUP #7843) genehmigt.
1. Vorbereitung der Mikroinjektionsnadel
<ol><li>Ziehen Sie ein Glaskapillarröhrchen mit einem Mikropipettenabzieher mit folgendem Programm in eine scharfe Spitze: P = 500, Hitze = 576, ZIEHEN = 50, VEL = 80, DEL = 70.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze das spitze Ende des gezogenen Kapillarrohrs unter einem Präpariermikroskop ab, um eine Öffnung zu schaffen, wie in Abbildung 1A,B gezeigt. Achten Sie darauf, dass die Öffnung nicht zu groß ist, da dies den Eileiter beschädigt und eine langsame Injektion verhindert.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig01.jpg"> Abbildung 1: Herstellung der Mikroinjektionsnadel . (A,B) Gezogenes Kapillarrohr mit einem spitzen Ende (A), das abgeschnitten wurde, um eine Öffnung (B) zu schaffen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
2. Vorbereitung des Anästhetikums für die intraperitoneale Injektion
<ol><li>Bereiten Sie am Tag der Operation gefiltertes, verdünntes Avertin vor. Avertin (2,2,2-tribromethanol)-Stammlösung wird in einer Konzentration von 1,6 g/ml in tert.-Amylalkohol durch kräftiges Rühren hergestellt und dunkel gelagert.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Avertin-Stammlösung mit isotonischer Kochsalzlösung von 1,25 v/v-% auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml in einem Abzug. Wirbeln Sie das verdünnte Avertin und den Filter durch einen 0,22 μm Sterilfilter. Im Dunkeln aufbewahren.</li>
</ol>3. Vorbereitung des Operationsbereichs
<ol><li>Der Operationsbereich sollte eine spezielle sterile Umgebung sein, vorzugsweise eine saubere Bank oder eine Biosicherheitswerkbank. Ordnen Sie die sterilen Operationsgeräte, das Mikroskop, den Mikromanipulator und den Elektroporator nach Bedarf an. Ein Beispiel hierfür ist in Abbildung 2 dargestellt.</li>
	<li>Erhitzen Sie das Heizkissen/die Heizscheibe und legen Sie es unter einen sauberen, voll ausgestatteten Käfig. In diesem Käfig werden die Mäuse nach der Operation untergebracht.</li>
	<li>Gießen Sie sterile 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine sterile Petrischale. Verwenden Sie eine saubere Schere, um saugfähiges Papier in Quadrate mit einer ungefähren Größe von 1 cm x 1 cm zu schneiden. Lassen Sie diese saugfähigen Papierstücke in das 1x PBS fallen, um sie einzuweichen.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Lösung und der Nadel für die Injektion
<ol><li>Bereiten Sie die Injektionslösung am Tag der Operation vor. Mischen Sie die DNA/RNA/RNPs mit gefiltertem Trypanblau bis zu einer Mindestendkonzentration von jeweils 200 ng/μl bzw. 5%. Vor der Injektion bei Raumtemperatur lagern. Anmerkungen: Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um 100 % Trypanblau aufzunehmen, und filtern Sie sie vor der Verwendung durch einen 0,22 μm sterilen Filter.</li>
	<li>Befestigen Sie die gezogene Kapillarnadel, die im Folgenden als Mikroinjektionsnadel bezeichnet wird, an dem Mikromanipulator mit Klemmhalterung, der durch eine magnetische Halterung stabilisiert wird (Aufbau in Abbildung 2B gezeigt).</li>
	<li>Pipettieren Sie 2 μl der Injektionslösung in eine sterile Petrischale. Nehmen Sie bei der Beobachtung unter dem Mikroskop langsam 1-2 μl dieser Lösung mit der am Mikromanipulator angebrachten Luftdruckspritze in die Mikroinjektionsnadel auf. Vermeiden Sie Blasen/Aufnahme von Blasen in die Mikroinjektionsnadel.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig02.jpg"> Abbildung 2: Vorbereitung des Operationsbereichs . (A) Einrichtung des Operationsbereichs in einer sauberen Bank. (B) Präpariermikroskop und Mikromanipulator für Rechtshänder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
5. Freilegung des weiblichen Fortpflanzungstraktes
<ol><li>Betäuben Sie eine 6-8 Wochen alte weibliche Maus durch intraperitoneale Verabreichung von gefiltertem, verdünntem Avertin (Anästhetikum) in einer Dosis von 0,25-0,5 mg/g. Anschließend wird Carprofen (präemptives Analgetikum) subkutan in einer Dosis von 5 mg/kg verabreicht. Anmerkungen: Andere Alternativen, die als Anästhetikum verwendet werden können, sind Isofluran oder Ketamin/Xylazin.</li>
	<li>Legen Sie saugfähiges Papier auf ein sauberes, beheiztes Pad/eine Disc. Legen Sie dann die betäubte Maus mit der Rückenseite nach oben auf dieses erhitzte, saugfähige Papier. Tragen Sie Augengleitmittel auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen während der Operation zu verhindern. Anmerkungen: Vergewissern Sie sich, dass sich das Heizkissen/die Heizscheibe leicht warm anfühlt, indem Sie es mit dem Handrücken testen.</li>
	<li>Testen Sie auf einen tiefen Betäubungsstillstand, indem Sie den Zeh der betäubten Maus mit einer Pinzette einklemmen. Entfernen Sie das Rückenfell um die prospektive Inzisionsstelle (in Abbildung 3A gezeigte Stelle) und wischen Sie die nackte Haut mit einem Antiseptikum ab.</li>
	<li>Verwenden Sie eine gerade stumpfe Pinzette, um die nackte Haut zu kneifen und mit einer sterilen, scharfen, stumpfen Schere einen 1 cm langen Schnitt entlang der Körpermittellinie zu machen. Reinigen Sie den Bereich um den Einschnitt mit einem Antiseptikum.</li>
	<li>Drücke eine Seite der Schnittstelle zusammen und halte sie mit einer sterilen Adson-Pinzette hoch. Trennen Sie dann mit einer sterilen, gebogenen, gezackten Pinzette die Haut vorsichtig von der Körperwand, beginnend am Mittellinienschnitt und seitlich bewegend.</li>
	<li>Lokalisieren Sie das Fettpolster unterhalb der Niere. Kneifen Sie mit einer sterilen, geraden, stumpfen Pinzette die Körperwand direkt über dem Fettpolster zusammen. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Körperwand mit einer sterilen, scharfen Präparierschere und achten Sie darauf, Blutgefäße zu vermeiden.</li>
	<li>Während Sie die Körperwand immer noch mit einer geraden stumpfen Pinzette einklemmen, führen Sie ein Paar sterile, stumpfe, gebogene Pinzetten in den Einschnitt ein und erweitern Sie den in der Körperwand entstandenen Einschnitt.</li>
	<li>Fassen Sie das sichtbare Fettpolster mit der stumpfen gebogenen Pinzette und ziehen Sie es aus dem Loch, um den Eierstock, den Eileiter und die Gebärmutter freizulegen.</li>
	<li>Um den Fortpflanzungstrakt freizulegen, klemmen Sie das Fettpolster mit einer sterilen Bulldoggenklemme fest, wie in Abbildung 3B gezeigt.</li>
</ol>6. In-vivo-Eileiterinjektion und Elektroporation
<ol><li>Legen Sie das erhitzte saugfähige Papier und die betäubte Maus mit freiliegendem Fortpflanzungstrakt vorsichtig auf den Tisch eines Präpariermikroskops, so dass der Trakt beobachtet werden kann. Ein Beispiel für die unter dem Mikroskop beobachtete Ansicht ist in Abbildung 3B dargestellt.</li>
	<li>Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Injektionsnadel mit Lösung auch unter dem Mikroskop beobachtet werden kann.</li>
	<li>Halten Sie mit einer sterilen, sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze den Bereich des Eileiters, der injiziert werden soll, ruhig. Der zu injizierende Bereich muss mit der Richtung der Mikroinjektionsnadel übereinstimmen. Anmerkungen: Verwenden Sie die Bulldoggenklemme, mit der das Fettpolster und der Fortpflanzungstrakt verankert sind, um den Trakt bei Bedarf vorsichtig in eine optimale Position zu drehen/zu bewegen.</li>
	<li>Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass der Eileiter mit der Mikroinjektionsnadel punktiert wird, während Sie gleichzeitig den Eileiter mit der sich verjüngenden ultrafeinen Spitzenzange auf die Nadel führen. Bewegen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig, um zu bestätigen, dass sie in den Eileiter eingeführt wurde. Anmerkungen: Führen Sie die Mikroinjektionsnadel in ein gerades Segment und nicht in einen Wendepunkt des gewickelten Eileiters ein, um mehrfache Einstiche und das Auslaufen der Injektionslösung zu vermeiden.</li>
	<li>Injizieren Sie langsam bis zu 1 μl Lösung in den Eileiter, während Sie die Bewegung der blauen Lösung und die Ausdehnung des Eileiterlumens unter dem Mikroskop beobachten. Achten Sie darauf, dass keine Blasen in das Lumen gelangen. Repräsentative Bilder von Eileitern, die mit 100 % Trypanblau injiziert wurden, sind in Abbildung 3C,D dargestellt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel aus dem Eileiter. Decken Sie den Zielbereich mit einem Stück saugfähigem Papier ab, das in sterilem 1x PBS (ab Schritt 3.3) eingeweicht ist.</li>
	<li>Fassen Sie das vorgetränkte Papier und den Bereich/die Region, die anvisiert werden soll, mit einer Elektrodenpinzette (1 mm, 3 mm oder 5 mm, je nach Größe des zu behandelnden Bereichs) und ziehen Sie ihn vom Körper weg, bevor Sie mit den folgenden Einstellungen am Impulsgeber/Elektroporator elektropieren: 30 V, drei Impulse, 1 s Intervall, 50 ms Pulslänge, unipolar. Anmerkungen: Der Abstand zwischen den Elektroden sollte so eingestellt werden, dass sich die Elektroden an der Zielregion festklemmen können, ohne den Eileiter zu verformen. Der empfohlene Abstand beträgt ca. 1 mm.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Elektroporation das saugfähige Papier und legen Sie die Maus (mit dem erhitzten saugfähigen Papier darunter) wieder auf ein Wärmekissen. Lösen Sie die Bulldoggenklemme und schieben Sie den freiliegenden Fortpflanzungstrakt vorsichtig wieder unter die Körperwand. Wiederholen Sie Abschnitt 5, um den Fortpflanzungstrakt auf der anderen Seite freizulegen. HINWEIS: Die Elektroporation ist unabhängig vom Brunststadium der Maus erfolgreich, solange das Lumen mit der Lösung gefüllt ist.</li>
	<li>Decken Sie den freiliegenden Trakt mit saugfähigem Papier ab, das in sterilem 1x PBS vorgetränkt ist, um ein Austrocknen zu verhindern, und bereiten Sie dann die Mikroinjektionsnadel für die zweite Injektion vor, indem Sie die Schritte 4.2 und 4.3 wiederholen. Anmerkungen: Ersetzen Sie die Mikroinjektionsnadel nach Bedarf. Verhindern Sie das Austrocknen des freiliegenden Gewebes, indem Sie bei Bedarf steriles 1x PBS auftragen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte, um den Eileiter auf der gegenüberliegenden Seite zu injizieren und zu elektroporieren. Anmerkungen: Tragen Sie das Augengleitmittel während und nach der Operation nach Bedarf erneut auf.</li>
	<li>Nachdem beide Eileiter elektroporiert und wieder unter die Körperwand gelegt wurden, nähen oder klammern Sie die dorsale Inzisionsstelle. Fassen Sie zum Nähen mit einem Hämostat die Nadel der seidengeflochtenen Nähte (3/8 Kreis; Maschenweite: 5-0; Nadelstärke: 18 mm; Fadenlänge: 75 cm). Drücken und halten Sie eine Seite der Schnittstelle mit einer sterilen, gebogenen, gezackten Pinzette zusammen und halten Sie sie hoch, und verwenden Sie dann das Hämostat, um die Naht zu manipulieren und die Wunde zu schließen.</li>
	<li>Bewegen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, der auf ein beheiztes Pad/eine beheizte Disc (aus Schritt 3.2) gelegt wird, und überwachen Sie, bis die Maus aktiv ist.</li>
	<li>Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen in den nächsten 3 Tagen alle 24 Stunden subkutan und überwachen Sie es in den nächsten 10 Tagen.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig03.jpg"> Abbildung 3: Exposition des weiblichen Fortpflanzungstrakts und Mikroinjektion . (A) Lage des Mittellinienschnitts (dargestellt als gelbe Linie) auf der dorsalen Seite einer Rosa-LSLtdTomato-Maus. (B) Exposition des weiblichen Fortpflanzungstrakts. Das Fettpolster wurde mit einer sterilen Bulldoggenklemme geklemmt, um den Trakt zu verankern und freizulegen. (C,D) Repräsentative Bilder der In-vivo-Eileiterinjektion . Eine Mikroinjektionsnadel wurde in die distale Ampulle eingeführt (mit AMP gekennzeichnet) und filtriertes 100%iges Trypanblau wurde in das Lumen des Eileiters injiziert, während der Trakt freigelegt wurde (C). Repräsentatives Bild eines präparierten Eileiters, das zeigt, dass sich die injizierte Trypanblaulösung im distalen und proximalen Eileiterlumen (D) verteilt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<ol><li>Avilés, M., Coy, P., Rizos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oviduct%3A+A+key+organ+for+the+success+of+early+reproductive+events%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Frontiers%22%5BJournal%5D)">The oviduct: A key organ for the success of early reproductive events.</a> Animal Frontiers. 5 (1), 25-31 (2015).</li>
<li>Li, S., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviduct%3A+roles+in+fertilization+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Oviduct: roles in fertilization and early embryo development.</a> The Journal of Endocrinology. 232 (1), R1-R26 (2017).</li>
<li>Briceag, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fallopian+tubes--literature+review+of+anatomy+and+etiology+in+female+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine+and+Life%22%5BJournal%5D)">Fallopian tubes--literature review of anatomy and etiology in female infertility.</a> Journal of Medicine and Life. 8 (2), 129-131 (2015).</li>
<li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca%3BTp53%3BPten+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li>
<li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+grade+serous+ovarian+carcinomas+originate+in+the+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube.</a> Nature Communications. 8 (1), 1093(2017).</li>
<li>Shaw, P. A., Rouzbahman, M., Pizer, E. S., Pintilie, M., Begley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+serous+cancer+precursors+in+fallopian+tube+epithelium+of+BRCA1%2F2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Candidate serous cancer precursors in fallopian tube epithelium of BRCA1/2 mutation carriers.</a> Modern Pathology. 22 (9), 1133-1138 (2009).</li>
<li>Soong, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+lineage+continuity+between+early+serous+proliferations+%28ESPs%29+in+the+Fallopian+tube+and+disseminated+high-grade+serous+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evidence for lineage continuity between early serous proliferations (ESPs) in the Fallopian tube and disseminated high-grade serous carcinomas.</a> The Journal of Pathology. 246 (3), 344-351 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> The Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li>
<li>Puisieux, A., Pommier, R. M., Morel, A. P., Lavial, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pliancy+and+the+multistep+process+of+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular pliancy and the multistep process of tumorigenesis.</a> Cancer Cell. 33 (2), 164-172 (2018).</li>
<li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li>
<li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677(2021).</li>
<li>Teng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+high-grade+serous+ovarian+carcinoma+using+a+combination+of+in+vivo+fallopian+tube+electroporation+and+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling high-grade serous ovarian carcinoma using a combination of in vivo fallopian tube electroporation and CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Cancer Research. 81 (20), 5147-5160 (2021).</li>
<li>Ford, M. J., Yamanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mouse+oviduct+epithelial+cells+using+in+vivo+electroporation+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mouse oviduct epithelial cells using in vivo electroporation and CRISPR/Cas9-mediated genetic manipulation.</a> Methods in Molecular Biology. 2429, 367-377 (2022).</li>
<li>Maresch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+pancreatic+genome+engineering+and+cancer+induction+by+transfection-based+CRISPR%2FCas9+delivery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed pancreatic genome engineering and cancer induction by transfection-based CRISPR/Cas9 delivery in mice.</a> Nature Communications. 7, 10770(2016).</li>
<li>Braun, C. J., Adames, A. C., Saur, D., Rad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+design+and+execution+of+CRISPR+in+vivo+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: design and execution of CRISPR in vivo screens.</a> Nature Protocols. 17 (9), 1903-1925 (2022).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Chazaud, C., Yamanaka, Y., Pawson, T., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lineage+segregation+between+epiblast+and+primitive+endoderm+in+mouse+blastocysts+through+the+Grb2-MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in mouse blastocysts through the Grb2-MAPK pathway.</a> Developmental Cell. 10 (5), 615-624 (2006).</li>
<li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nature Reviews. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li>
<li>Kroeger Jr, P. T., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+heterogeneity+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer.</a> Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+analyses+of+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma.</a> Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Entscheidende Schritte in diesem detaillierten Protokoll sind die Mikroinjektion der DNA/RNA/RNP-Lösung in das Lumen des Eileiters und die Kontrolle der Stärke und Fläche der Elektroporation. Das Austreten von DNA/RNA/RNP-Lösung während der Mikroinjektion kann zu einer Transfektion unerwünschter Bereiche/Zellen führen. Für eine gleichmäßige und effiziente Elektroporation ist es vorzuziehen, das Lumen des Eileiters mit der Lösung zu füllen (Abbildung 3C,D). Dies liegt daran, dass der Bereich der Elektroporation hauptsächlich durch die Elektrodengröße und -platzierung gesteuert wird. Eine schwache Elektroporation verringert die Anzahl der elektroporierten Zellen, und eine starke Elektroporation kann die Elektroporation unerwünschter Zellen verursachen oder die Gewebestruktur stören. Die Anzahl der elektroporierten Zellen kann durch Einstellen der DNA/RNA/RNP-Lösungskonzentration oder der Elektroporationsparameter variiert werden. Da jedoch hohe Spannungen/Wärmeentwicklung während der Elektroporation das Gewebe schädigen können, sollten diese Parameter vor der Anwendung an lebenden/anästhesierten Mäusen getestet werden. Schließlich wird aufgrund des anspruchsvollen Charakters dieses Verfahrens empfohlen, die Exposition des Trakts und die Mikroinjektion an toten Mäusen zu üben, bevor diese Operation an lebenden/anästhesierten Mäusen durchgeführt wird.
Es ist bekannt, dass mehrere Gene an der Krebsentstehung beteiligt sind, so dass die Rekapitulation dieses Ereignisses eine multiallelische Modifikation mehrerer Gene erfordert. Darüber hinaus ist auch bekannt, dass nicht alle Zellen gleichermaßen anfällig für onkogene Mutationen sind9. Die Krebsmodellierung erfordert daher spezifische Cre-Mauslinien, um eine genaue Kontrolle der onkogenen Insulte zu erreichen. Ihre Verfügbarkeit und Spezifität bringt jedoch verschiedene Herausforderungen mit sich, darunter Auswirkungen auf nicht zielgerichtete Gewebe und Letalität19. Darüber hinaus verursachen herkömmliche G-GEMMs hohe Wartungskosten und benötigen Zeit für die Mauslinienerstellung. Die Entwicklung der CRISPR/Cas9-Genom-Editierungstechnologie und die Verbesserung der Genübertragung in bestimmte somatische Zellen haben es uns ermöglicht, diese Probleme zu überwinden. In diesem Protokoll stellen wir eine DNA/RNA/RNP-Verabreichungsmethode für die somatische Genommanipulation vor, die für die Krebsmodellierung verwendet werden kann, ohne dass unbedingt spezifische Mauslinien erforderlich sind12. Durch die Injektion von DNA/RNA/RNP-Lösungen in das Lumen und die Verwendung unterschiedlich großer Pinzettenelektroden für die elektroporationsbasierte Verabreichung werden eingeschränkte Bereiche des Eileiterschleimhautepithels der Maus anvisiert (Abbildung 4A-F). Dies ist besonders nützlich bei der Modellierung der Initiierung von HGSCs, die vom distalen Ende des Eileiters ausgehen.
Die vorgestellte Mikroinjektions- und In-vivo-Elektroporationsmethode ist sehr vielseitig einsetzbar, um Gewebe/Organe mit einem Lumen gezielt zu erreichen. Auch das Organparenchym kann mit dieser Methode angegriffen werden14. Virale Verabreichungsansätze, wie lentivirale und adenovirale Systeme, können ebenfalls für ähnliche Zwecke verwendet werden. Die Vorteile der Elektroporation gegenüber viralen Verabreichungsansätzen sind jedoch: 1) mehrfache Plasmidabgabe in einzelne Zellen, 2) keine Beschränkung der Insertgröße15 und 3) einfache Kontrolle des Bereichs und des Zeitpunkts der Verabreichung. Darüber hinaus kann die Targeting-Spezifität durch die Verwendung von linienspezifischen Promotoren verbessert werden. Dies ist bei viralen Systemen manchmal schwierig, da die Virusverpackung begrenzt ist.
Wie es in der Natur der Elektroporation liegt, werden elektroporierte Epithelzellen zufällig mit gesunden, unbearbeiteten Zellen durchsetzt (Abbildung 4G). Dieser Mosaizismus in genetisch veränderten und unveränderten Zellen könnte jedoch für die Untersuchung der Krebsentstehung von Vorteil sein, da er die sporadische Natur der frühen Krebsentstehung in einer immunkompetenten Mikroumgebung rekapituliert. Die Frequenz der elektroporierten Zellen kann durch Variation der DNA/RNA/RNP-Lösungskonzentrationen und/oder Elektroporationsparameter eingestellt werden. Durch die Verwendung von CRISPR-Cas-vermittelter Genom-Editierung in Kombination mit dem vorgestellten Protokoll ist es einfach, mehrere Gene zu screenen und heterogene Muster von Mutationen/Allelkombinationen in Zielgenen zu erzeugen. Dies ist besonders nützlich bei der Modellierung von Krebserkrankungen, die eine beträchtliche Anzahl genomischer Veränderungen aufweisen, wie z. B. HGSCs20,21. Darüber hinaus ist es möglich, durch die Sequenzierung gezielter Gene während der Krebsprogression die klonale Evolution von Tumoren und Metastasen in immunkompetenten Mäusen zu verfolgen12.

Der Eileiter, bei Mäusen Eileiter genannt, ist eine röhrenförmige Struktur, die die Gebärmutter mit dem Eierstock verbindet. Es spielt eine wesentliche Rolle bei der Fortpflanzung von Säugetieren und bietet die Umgebung für die innere Befruchtung und die Präimplantationsentwicklung 1,2. Trotz seiner Bedeutung ist wenig über seine Funktion und Homöostase bekannt, was zum Teil auf die Entwicklung von In-vitro-Fertilisationstechniken zurückzuführen ist, die jedes Unfruchtbarkeitsproblem im Zusammenhang mit diesem Organ umgehen3. Es wurde jedoch festgestellt, dass präkanzeröse Läsionen des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms (HGSC), eines aggressiven Histotyps des Ovarialkarzinoms, der etwa 75 % der Ovarialkarzinome und 85 % der damit verbundenen Todesfälle ausmacht4, auf das distale Eileiterepithel beschränkt sind 5,6,7,8 . Dies deutet darauf hin, dass nicht alle Zellen in unserem Körper gleichermaßen anfällig für onkogene Beleidigungen sind, sondern dass nur einzelne/anfällige Zellen in jedem Gewebe/Organ zur Ursprungszelle von Krebs werden – als zelluläre Geschmeidigkeitbezeichnet 9. In diesem Sinne hat sich gezeigt, dass sich die Epithelzellen des distalen Eileiters, die sich neben dem Eierstock befinden, vom Rest des Eileiters unterscheiden10,11. Traditionelle Mausmodelle von HGSC, die auf alle Zellen im Eileiter abzielen, rekapitulieren daher nicht den menschlichen Zustand. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir eine Kombination aus CRISPR-vermittelter Genomeditierung, in vivo Eileiter-Elektroporation und Cre-basierter Abstammungsverfolgung verwendet, um HGSC erfolgreich zu induzieren, indem wir vier Tumorsuppressorgene im distalen Eileiter der Maus mutierten12,13. Dieses Manuskript enthält ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das dieses Verfahren der Mikroinjektion und der In-vivo-Elektroporation beschreibt, um auf das Schleimhautepithel der Eileiterschleimhaut der Maus abzuzielen.
Diese Methode hat mehrere Vorteile. Es kann so angepasst werden, dass es auf andere Gewebe/Organe abzielt, einschließlich des Organparenchyms14. Obwohl andere In-vivo-Ansätze zur Genübertragung wie lentivirale und adenovirale Systeme verwendet werden können, um ein ähnliches gewebe-/organspezifisches Targeting zu erreichen, lässt sich der Bereich des Targetings leichter anpassen, indem verschiedene Größen von Pinzettenelektroden für die elektroporationsbasierte Verabreichung verwendet werden. Abhängig von der Konzentration von DNA/RNA/Ribonukleoproteinen (RNPs), den Elektroporationsparametern und der Größe der Elektroden kann die Anzahl der elektroporierten Zellen verändert werden. Darüber hinaus können bestimmte Zelltypen gezielt anvisiert werden, wenn sie in Kombination mit Promotoren für die Cas9-Expression verwendet werden, ohne dass gentechnisch veränderte Mausmodelle (G-GEMMs) in der Keimbahn erforderlich sind. Darüber hinaus ermöglicht die Elektroporation im Gegensatz zu viralen Verabreichungssystemen die Verabreichung mehrerer Plasmide in einzelne Zellen und weniger Einschränkungen bei der Insert-DNA der Größe15. Auch das In-vivo-Screening von Genmutationen kann aufgrund dieser hohen Flexibilität relativ einfach durchgeführt werden. Weiterhin können elektroporierte Zellen verfolgt oder verfolgt werden, wenn diese Methode in Kombination mit Cre-Reporterlinien wie Tdtomato oder Confetti verwendet wird16,17.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; M Sterilfiltereinheit&nbsp;</td><td>LifeGene</td><td>SF0.22PES</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>Terumo Medical Corportation</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Pinzettenelektroden</td><td>BEX CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> LF650P1 <tr><td>3 mm Pinzettenelektroden</td><td>BEX CO., LTD</td><td></td><td></td></tr> LF650P3 <tr><td>30G x 1/2 Nadel</td><td>BD</td><td>305106</td><td>Die Nadel wird an der 1 ml-Spritze befestigt, wenn ein injizierbares Anästhetikum oder Analgetikum verwendet wird.</td></tr><tr><td>Adson-Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-000-451</td><td></td></tr><tr><td>Druckluftspritze</td><td>BD</td><td>B302995</td><td>Wird an den Mikromanipulator angeschlossen, wie in Abbildung 2B</td></tr><tr><td>gezeigt Analgetikum</td><td>-</td><td>-</td><td>Carprofen, Dosis: 5 mg/kg.</td></tr><tr><td>Antiseptikum</td><td>Cardinal Health</td><td>OMEL0000017</td><td>Baxedin: 2% Chlorhexidin in 70% Isopropylalkohol</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol) - Anästhetikum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator für Klemmhalterung</td><td>AD Instruments</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Zange mit Wellenschliff</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0696845</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Apochromat S, 0,63X, FWD 107mm. Angebaute KL 200 LED für das obere Licht, in Abbildung 2B als Lichtquelle beschriftet.</td></tr><tr><td>Augengleitmittel</td><td></td> <td>Alcon-Systane Salbe (Gleitmittel Augensalbe)</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillarnadeln</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100&ndash; 50-10</td><td>Außendurchmesser: 1 mm, Innendurchmesser: 0,5 mm, Länge: 10 cm</td></tr><tr><td>Hartman Hämostaten</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-711</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen/-scheibe</td><td>-</td><td>-</td><td>SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad wurde in diesem Protokoll verwendet. 2-5 Minuten in die Mikrowelle stellen und mit dem Handrücken mit Handschuhen testen.</td></tr><tr><td>Magnetische Halterung für Mikromanipulator</td><td>AD Instruments</td><td>MB-B</td><td>Wird verwendet, um den Mikromanipulator mit Klemmhalterung während der Injektion stabil und aufrecht zu halten.</td></tr><tr><td>Mikro-Bulldog-Klemme</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-230</td><td>3 cm</td></tr><tr><td>Mikropipetten-Abzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>P-97 Flammender/brauner Mikropipettenabzieher. Verwendetes Programm: P = 500, Hitze = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>263991</td><td>Autoklavierte/sterile Petrischalen aus Glas können ebenfalls verwendet werden.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PD8117</td><td>10X PBS wurde mit DI-Wasser auf 1X verdünnt. Vor Gebrauch autoklavieren.&nbsp;</td></tr><tr><td>Impulsgenerator/Elektroporator</td><td>BEX CO., LTD</td><td>CUY21 EDIT II</td><td>Elektroporationseinstellungen: 30 V, 3 Impulse, 1 s Intervall, P. Länge = 50 ms, unipolar</td></tr><tr><td>Rosa-LSLtdTomato Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>7914</td><td>Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td></tr><tr><td>Scharf-stumpfe Präparierschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>28251</td><td></td></tr><tr><td>Scharfe Präparierschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDI130</td><td></td></tr><tr><td>Rasierer</td><td></td> <td>-</td> <td>Haarentfernungscreme kann ebenfalls verwendet werden.</td></tr><tr><td>Seidengeflochtene Nähte</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td>3/8 Kreis, Stärke: 5-0, Nadelstärke: 18 mm, Fadenlänge: 75 cm. Klammern können ebenfalls verwendet werden.</td></tr><tr><td>Zange mit konischer ultrafeiner Spitze&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Dünnes, saugfähiges Papier</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7050</td><td>Gefiltert mit 0,22 &; Mikro; m Sterilfilter vor der Verwendung für Mikroinjektionen.</td></tr></tbody></table>

somatic genom-engineered mausmodelle mit in-vivo-mikroinjektion und elektroporation

Somatic Genome-Engineered Mouse Models Using In Vivo Microinjection and Electroporation

Gentechnisch veränderte Mausmodelle in der Keimbahn (G-GEMMs) haben wertvolle Einblicke in die Funktion von In-vivo-Genen in Entwicklung , Homöostase und Krankheit geliefert. Der Zeit- und Kostenaufwand für die Gründung und Pflege von Kolonien ist jedoch hoch. Jüngste Fortschritte in der CRISPR-vermittelten Genom-Editierung haben die Erzeugung von somatischen GEMMs (S-GEMMs) ermöglicht, indem sie direkt auf die Zelle/das Gewebe/das Organ von Interesse abzielen.
Der Eileiter oder Eileiter beim Menschen gilt als Ursprungsgewebe des häufigsten Eierstockkrebses, des hochgradigen serösen Ovarialkarzinoms (HGSCs). HGSCs beginnen im Bereich des Eileiters distal der Gebärmutter, der sich neben dem Eierstock befindet, aber nicht im proximalen Eileiter. Traditionelle Mausmodelle von HGSC zielen jedoch auf den gesamten Eileiter ab und rekapitulieren daher nicht den menschlichen Zustand. Wir stellen eine Methode der DNA-, RNA- oder Ribonukleoprotein-Lösung (RNP) vor, die Mikroinjektion in das Lumen des Eileiters und die in vivo Elektroporation zur gezielten Ansprache von Schleimhautepithelzellen in begrenzten Regionen entlang des Eileiters. Es gibt mehrere Vorteile dieser Methode für die Krebsmodellierung, wie z.B. 1) hohe Anpassungsfähigkeit bei der Ausrichtung auf den Bereich/das Gewebe/das Organ und die Region der Elektroporation, 2) hohe Flexibilität bei den Zielzelltypen (zelluläre Pliancy) bei Verwendung in Kombination mit spezifischen Promotoren für die Cas9-Expression, 3) hohe Flexibilität in der Anzahl der elektroporierten Zellen (relativ niedrige Frequenz), 4) Es ist keine spezifische Mauslinie erforderlich (immunkompetente Krankheitsmodellierung), 5) hohe Flexibilität bei der Kombination von Genmutationen und 6) Möglichkeit der Verfolgung elektroporierter Zellen in Kombination mit einer Cre-Reporterlinie. Somit rekapituliert diese kostengünstige Methode die Krebsentstehung beim Menschen.

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die Vorbereitung der Mikroinjektionsnadel bzw. den Aufbau des Operationsbereichs für die In-vivo-Mikroinjektion bzw. die Elektroporation des Maus-Eileiters. Während der Operation wurde der weibliche Fortpflanzungstrakt durch Schnitte in der Rückenhaut (Abbildung 3A) und der Körperwand einer betäubten Rosa-LSLtdTomate (Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)17 Maus freigelegt. Eine Bulldoggenklemme wurde auf das Fettpolster über dem Trakt geklemmt, um es freizulegen und zu verankern (Abbildung 3B). Eine Injektionslösung, die PCS2 CreNLS-Plasmide18 in einer Konzentration von 400 ng/μl enthielt, wurde in die Ampulle (mit AMP gekennzeichnet) des gewundenen Eileiters injiziert und verteilte sich im gesamten Lumen des Eileiters (Abbildung 3C, D). Obwohl in diesem Manuskript PCS2-CreNLS-Plasmide verwendet wurden, um repräsentative Ergebnisse zu erzielen, kann die beschriebene Methode mit leicht austauschbaren DNA/RNA/RNPs in der Injektionslösung für die CRISPR/Cas-vermittelte Geneditierung im Eileiter der Maus verwendet werden. Dann wurden 1 mm oder 3 mm Pinzettenelektroden so positioniert, dass sich der distale Eileiter zwischen den Elektroden für die elektroporationsbasierte Abgabe befand.
Die Eileiter wurden 4 Tage nach der Operation entnommen und durch Entfernung des Mesosalpinx gedehnt, um die Spezifität der Elektroporation zu visualisieren. Mit Hilfe von 1 mm oder 3 mm Pinzettenelektroden wurde der mit TdTomato markierte Zielbereich auf das distale Eileiterepithel beschränkt (Abbildung 4A, D). Die Größe dieses Zielbereichs wurde durch den Einsatz von Elektroden unterschiedlicher Größe weiter kontrolliert. Mit 3-mm-Pinzettenelektroden zielten wir auf einen viel größeren Bereich des AMP (Abbildung 4B, C), als nur auf die distale Spitze, die INF (Abbildung 4E, F), mit 1-mm-Pinzettenelektroden. Diese entnommenen Eileiter wurden fixiert, mit einem Saccharosegradienten behandelt und mit einem Kryostaten für detaillierte Analysen geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hoescht 33342 und Phalloidin gegengefärbt, um die Zellkerne bzw. das Zytoskelett zu färben, und dann mit einem konfokalen Punktrastermikroskop abgebildet. In der Zielregion wurden elektroporierte Zellen, die durch TdTomato markiert waren, zufällig auf nicht-elektroporierte (TdTomato-ve) Zellen verteilt (Abbildung 4G). Darüber hinaus waren elektroporierte Zellen auf das Schleimhautepithel beschränkt und nicht in der darunter liegenden Stroma- oder Muskelschicht zu finden (Abbildung 4G,H). Um die CRISPR-Cas-vermittelte Geneditierung zu bestätigen, können TdTomato+ve-Zellen schließlich durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) zur DNA-Isolierung und MiSeq-Sequenzierung isoliert werden12.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65131/65131fig04.jpg"> Abbildung 4: Validierung der erfolgreichen In-vivo-Injektion und Elektroporation von Eileiterepithelzellen, 4 Tage nach der Operation. (A-C) Elektroporation mit 3 mm großen Pinzettenelektroden. Der Eileiter wurde abgewickelt, indem der Mesosalpinx entfernt wurde, um die Spezifität der Elektroporation besser sichtbar zu machen (A). Der durch die TdTomato-Expression identifizierte Elektroporationsbereich war auf den distalen Eileiter beschränkt, der als AMP (B,C) gekennzeichnet war. (D-F) Elektroporation mit 1 mm großen Pinzettenelektroden. Der Eileiter wurde abgewickelt, indem der Mesosalpinx entfernt wurde, um eine bessere Visualisierung der Elektroporationsspezifität zu ermöglichen (D). Der Bereich der Elektroporation beschränkte sich auf das Infundibulum (INF), die distale Spitze des Eileiters (E,F). (G,H) Querschnitt des distalen Eileiters 4 Tage nach Elektroporation mit PCS2 CreNLS-Plasmiden. Elektroporierte Zellen, die mit TdTomato (G) markiert waren, waren auf die epitheliale Monoschicht (H) beschränkt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65131/65131fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die Mikroinjektion und In-vivo-Elektroporation für die regional eingeschränkte CRISPR-vermittelte Genom-Editierung im Eileiter der Maus.

Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Germline genetically engineered mouse models (G-GEMMs) have provided valuable insight into in vivo gene function in development, homeostasis, and disease. ...

Das vorgestellte Protokoll ist eine hochflexible Methode zur Genommanipulation im Eileiter der Maus. Es ermöglicht die Bildung von sporadisch mutierten Zellen, die von uneditierten Zellen umgeben sind, in einer immunkompetenten Umgebung. Dies ist vorteilhaft, um die Krebsentstehung zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre hohe Anpassungsfähigkeit, um ein Organ, einen Bereich, eine Region oder einen Zelltyp von Interesse mit leicht austauschbaren Sätzen von Mutationskombinationen anzusprechen, ohne dass eine Mauslinie unbedingt erforderlich ist. Diese Methode kann leicht für den Einsatz in Organen mit dem Lumen sowie im Organparenchym angepasst werden. Ziehen Sie zunächst ein Glaskapillarröhrchen mit einem Mikropipettenzieher an eine scharfe Spitze.Schneiden Sie mit einer sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze das spitze Ende des gezogenen Kapillarrohrs unter einem Präpariermikroskop ab, um eine Öffnung zu schaffen. Achten Sie darauf, dass die Öffnung nicht zu groß ist, da dies den Eileiter beschädigt und eine langsame Injektion verhindert. Ordnen Sie als Nächstes die sterilen chirurgischen Geräte, das Mikroskop, den Mikromanipulator und den Elektroporator auf einer sauberen, sterilen Bank oder in der Biosicherheitswerkbank an.Erhitzen Sie das Heizkissen auf einer Scheibe und legen Sie es unter einen sauberen, voll ausgestatteten Käfig. Gießen Sie steril 1X PBS in eine Petrischale. Schneiden Sie das saugfähige Papier mit einer sauberen Schere in Quadrate, die einen Zentimeter lang sind.Geben Sie diese in PBS, um sie einzuweichen. Befestigen Sie als Nächstes die gezogene Kapillarnadel an dem Mikromanipulator mit Klemmhalterung, der durch eine magnetische Halterung stabilisiert wird. Pipettieren Sie zwei Mikroliter der Injektionslösung auf eine sterile Petrischale.Nehmen Sie während der Beobachtung unter dem Mikroskop langsam ein bis zwei Mikroliter der Injektionslösung mit der am Mikromanipulator angebrachten Luftdruckspritze in die Mikroinjektionsnadel auf. Vermeiden Sie es, Blasen in der Nadel aufzunehmen. Nachdem Sie eine sechs bis acht Wochen alte weibliche Maus betäubt und Carprofen subkutan verabreicht haben, legen Sie die Maus mit der Rückenseite nach oben auf das erhitzte saugfähige Papier.Tragen Sie Augengleitmittel auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen während der Operation zu verhindern. Nachdem Sie den Narkosestopp bestätigt haben, indem Sie den Zeh mit einer Pinzette zusammengedrückt haben, entfernen Sie das Rückenfell um die voraussichtliche Einschnittstelle und wischen Sie die nackte Haut mit einem Antiseptikum ab. Verwenden Sie eine gerade, stumpfe Pinzette, um die nackte Haut zu kneifen und mit einer sterilen Schere einen einen einen Zentimeter langen Schnitt entlang der Körpermittellinie zu machen.Drücke eine Seite der Schnittstelle zusammen und halte sie mit einer sterilen Adson-Pinzette hoch. Trennen Sie dann mit einer sterilen, gebogenen, gezackten Pinzette die Haut vorsichtig von der Körperwand, beginnend am Mittellinienschnitt und seitlich bewegend. Nachdem Sie das Fettpolster unter der Niere lokalisiert haben, verwenden Sie eine sterile, gerade, stumpfe Pinzette, um die Körperwand direkt über dem Fettpolster einzuklemmen.Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Körperwand mit einer sterilen, scharfen, spitzen Präparierschere und achten Sie darauf, Blutgefäße zu vermeiden. Während Sie die Körperwand noch mit einer geraden, stumpfen Pinzette einklemmen, führen Sie eine sterile, stumpfe, gebogene Pinzette in den Einschnitt ein und erweitern Sie den in der Körperwand entstandenen Einschnitt. Fassen Sie das sichtbare Fettpolster mit der stumpfen, gebogenen Pinzette und ziehen Sie es aus dem Loch, um den Eierstock, den Eileiter und die Gebärmutter freizulegen.Halten Sie die Fortpflanzungsspur frei, indem Sie das Fettpolster mit einer sterilen Bulldoggenklemme festklemmen. Legen Sie die betäubte Maus vorsichtig mit freiliegender Fortpflanzungsspur auf den Tisch eines Präpariermikroskops. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Injektionsnadel mit der Lösung unter dem Mikroskop beobachtet wird.Manipulieren Sie dann das Mikroskop, um den Eierstock, den Eileiter und die Gebärmutter leicht zu beobachten. Halten Sie mit einer sterilen, sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze den Bereich des Eileiters fest, der injiziert werden soll. Der Bereich muss mit der Richtung der Mikroinjektionsnadel übereinstimmen.Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass der Eileiter mit der Mikroinjektionsnadel punktiert wird, während Sie gleichzeitig den Eileiter mit der sich verjüngenden Pinzette mit ultrafeiner Spitze auf die Nadel führen. Bewegen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig, um zu bestätigen, dass sie in den Eileiter eingeführt wurde. Injizieren Sie langsam einen Mikroliter der Injektionslösung und 5%iges gefiltertes Trypanblau in den Eileiter, während Sie die Bewegung der blauen Lösung und die Ausdehnung des Eileiterlumens beobachten.Vermeiden Sie es, Blasen in das Lumen einzuführen. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel aus dem Eileiter und decken Sie den Zielbereich mit einem in PBS getränkten Stück saugfähigem Papier ab. Fassen Sie das eingeweichte Papier und den Bereich, auf den Sie zielen möchten, mit einer Elektrodenpinzette und ziehen Sie ihn vom Körper weg.Elektroporieren Sie den Zielbereich mit drei unipolaren Impulsen bei 30 Volt für 50 Millisekunden in Intervallen von einer Sekunde. Entfernen Sie nach der Elektroporation das saugfähige Papier und legen Sie die Maus wieder auf das Heizkissen. Lösen Sie die Bulldoggenklemme und schieben Sie die freiliegende Fortpflanzungsspur vorsichtig wieder unter die Körperwand.Nachdem beide Eileiter elektroporiert und wieder unter die Körperwand gelegt wurden, greifen Sie die Nadel mit einem Nadelhalter. Drücken Sie eine Seite der Schnittstelle zusammen und halten Sie sie mit einer sterilen, gebogenen, gezackten Pinzette hoch. Verwenden Sie dann den Nadelhalter, um das Nahtmaterial zu manipulieren und die Wunde zu schließen.Bewegen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, der auf einem Heizkissen platziert ist, und überwachen Sie, bis die Maus aktiv ist. Nach der Elektroporation mit drei oder einem Millimeter großen Pinzettenelektroden wurde der mit TdTomato markierte Zielbereich auf das distale Eileiterepithel beschränkt. Mit drei Millimeter großen Pinzettenelektroden wurde ein viel größerer Bereich der Ampullen anvisiert, verglichen mit Ein-Millimeter-Pinzettenelektroden, die nur auf die distale oberste Spitze, das Infundibulum, abzielten.In der Zielregion wurden elektroporierte Zellen, die durch TdTomato markiert wurden, zufällig auf nicht-elektroporierte Zellen verteilt. Darüber hinaus waren elektroporierte Zellen auf das Schleimhautepithel beschränkt und wurden nicht in der darunter liegenden Stroma- oder Muskelschicht beobachtet. Um die CRISPR-vermittelte Genom-Editierung zu bestätigen, können fluoreszierende Zellen durch FACS-Sortierung für die DNA-Isolierung und -Sequenzierung isoliert werden.Dies ermöglicht es uns, die Häufigkeit der Zielallele zu quantifizieren und die einzigartige Kommunikation zwischen der Probe zu verfolgen, um die koronale Evolution des Primärtumors in vivo zu verfolgen, und die Metastasierung in einer immunkompetenten Umgebung.

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