Isolierung, Charakterisierung und Gesamt-DNA-Extraktion zur Identifizierung endophytischer Pilze in mykoheterotrophen Pflanzen

Die hier vorgestellten Techniken sind nützlich, um die endophytische Pilzgemeinschaft zu untersuchen, die mit verschiedenen Pflanzenorganen assoziiert ist. Die Isolierung endophytischer Pilze ermöglicht ihre Identifizierung und ist wertvoll für andere Techniken wie die symbiotische Keimung. Bereiten Sie zunächst acht bis zehn Zentimeter langes PDA-Nährmedium Petrischalen vor, die mit drei Millilitern pro Liter Antibiotikum ergänzt werden.

Prüfen Sie das Nährmedium auf Kontamination, indem Sie das Nährmedium vor der Verwendung 24 Stunden lang bei 36 Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag gesunde mychoheterotrophe Pflanzenfragmente nach einem Standardverfahren oberflächlich desinfizieren und in eine sterile Petrischale legen. Um die Wirksamkeit der oberflächlichen Entwesung von Proben zu bewerten, werden einige Tropfen destilliertes Wasser geimpft, das während des letzten Waschens der Proben auf PDA verwendet wurde.

Anschließend werden die Proben mit einem geflammten Skalpell und einer Pinzette in 0,2 Zentimeter dicke Stücke zerlegt. Schneiden Sie die Proben ab, um die Oberfläche zu vergrößern, die mit dem Medium in Kontakt kommen soll. Legen Sie fünf Fragmente der unterirdischen Organe so weit wie möglich auseinander in die mit Antibiotika ergänzte PDA-Platte, ohne die Schalenränder zu berühren.

Verschließen Sie die Petrischalen mit Frischhaltefolie und lagern Sie sie fünf Tage lang im Dunkeln bei 25 bis 27 Grad Celsius. Bereiten Sie einen Tag vor der Subkultivierung fünf Zentimeter lange Petrischalen mit fünf bis sieben Gramm pro Liter AA-Medium vor und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 36 Grad Celsius. Um Pilzisolate zu reinigen, unterscheiden Sie die PDA-Plattenkolonien nach Farbe, Wachstumsmuster, Textur und Randformat.

Begrenzen Sie dann die Kolonieränder auf der Unterseite der Schale. Identifizieren Sie die Kolonien auch mit einem Code. Entnehmen Sie mit der Spitze eines autoklavierten hölzernen Zahnstochers eine winzige Menge Myzel von den Rändern der identifizierten Pilzkolonie und streifen Sie die AA-Platte auf, so dass drei Streifen entstehen, die einen Zentimeter voneinander und von den Kanten der Schale entfernt sind.

Beschriften Sie das AA-Schild mit dem entsprechenden Code mit Aufkleberpapier und Bleistift. Versiegeln Sie die Platten, bevor Sie sie drei Tage lang im Dunkeln bei 25 bis 27 Grad Celsius inkubieren. Beobachten Sie nach der Inkubation die Platten genau, um feine Hyphen zu identifizieren, die einzelne Kolonien bilden.

Begrenzen Sie das Gebiet der einzelnen Völker mit einem Permanentmarker. Schneiden Sie einen Teil des Mediums, das die Kolonie enthält, mit einem autoklavierten Zahnstocher ab und übertragen Sie das Schnittvolumen ohne Antibiotika in die Mitte einer neuen PDA-Petriplatte. Nachdem Sie die Petrischalen mit den Codes der Isolate beschriftet haben, verschließen Sie sie mit Frischhaltefolie und bewahren Sie sie sieben bis 14 Tage lang im Dunkeln bei 25 bis 27 Grad Celsius auf.

Um die Konservierung der Pilzisolate mit Castellanis Methode zu beginnen, geben Sie 0,5 Milliliter destilliertes Wasser in das autoklavierte zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen. Schneiden Sie mit einem autoklavierten Zahnstocher ein 0,5 mal 0,5 Zentimeter großes quaderförmiges Medium aus den Myzelrändern bereits gezüchteter gereinigter Isolate ab. Vier bis sechs Quader in die Mikrozentrifugenröhrchen mit destilliertem Wasser geben.

Lagern Sie die Röhrchen so lange wie nötig im Dunkeln bei 25 Grad Celsius. Entnehmen Sie bei Bedarf einen Quader und legen Sie ihn in die Mitte einer neuen PDA-Schale, um ein gelagertes Isolat zu züchten. Beginnen Sie mit der Tease-Mount-Methode, indem Sie einen Tropfen eines Toluidinblau-O-Flecks auf einen sauberen Objektträger geben.

Bei einer solchen Technik können verschiedene Färbungen verwendet werden. Entferne mit einem autoklavierten Zahnstocher vorsichtig einige Hyphen aus dem gewachsenen Isolat und lege sie in den Fleck. Legen Sie ein Deckglas auf und analysieren Sie es unter einem Lichtmikroskop.

Für die Klebeband-Montagemethode geben Sie einen Tropfen einer Lactophenol-Baumwollblau-Beize auf einen sauberen Objektträger. Schneiden Sie einen Streifen transparentes Klebeband in einer Größe zu, die gut auf den Objektträger und den zentralen Fleckentropfen passt. Führe die klebrige Oberfläche des Klebestreifens auf die Myzeloberfläche und versuche, einige Hyphen zu sammeln, ohne zu viele davon zu drücken oder zu sammeln.

Kleben Sie dann das Klebeband auf den Objektträger und stellen Sie sicher, dass der Fleck mit den gesammelten Hyphen in Kontakt kommt. Geben Sie einen Tropfen Wasser über das Klebeband und legen Sie ein Deckglas auf, bevor Sie den Objektträger unter einem Lichtmikroskop analysieren. Das Wachstum kleiner Gruppen von filamentösen Pilzmyzelien, die aus dem Inneren der Fragmente austreten, wurde nach fünftägiger Inokulation des mychoheterotrophen Pflanzenorganfragments auf dem PDA-Medium beobachtet.

Während der sieben- bis 14-tägigen Inokulation des gereinigten Isolats wurde das zentrifugale Wachstum einer reinen Pilzisolatkolonie auf PDA beobachtet, die ein einziges kreisförmiges Myzel bildete. Mögliche Kontaminationen konnten leicht identifiziert werden, was die Homogenität der Kolonie in Bezug auf das Aussehen der Wachstumsform, die Farbe und die Pigmentproduktion im Medium beeinträchtigte. Eine Kolonie, die aus den fusiformen Wurzeln der mychoheterotrophen Orchidee (Wullschlaegelia aphylla) isoliert wurde, war undurchsichtig und enthielt keine diffundierbaren Pigmente oder Exsudate im Medium.

Die Kolonie war auf der Oberseite weißlich bis grau und auf der Unterseite bräunlich. Die Myzelien waren luftig und reichlich vorhanden, und die Ränder waren unregelmäßig und luftig. Die Kolonie hatte eine samtige Textur und eine faltige Topographie ohne makroskopische Strukturen.

Die Strukturen, die im ungefärbten Myzel nicht leicht sichtbar waren, wurden nach der Färbung des Pilzmyzels mit Lactophenol-Baumwollblau und Toluidinblau-O gezeigt, was ihre Identifizierung erleichterte. Die hier vorgestellten Methoden zur Pilzisolierung können auch auf Grünpflanzen angewendet werden, um die Pilzendophyten zu identifizieren. Die isolierten Pilze können in symbiotischen Keimversuchen eingesetzt werden.