Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien
8. Dezember 2023
Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.
Die Anreicherung mykobakterieller EVs hilft dabei, ihren Inhalt abzugrenzen, ihre Fraktionen zu entschlüsseln und Wege zu entwickeln, um rekombinante EVs zu konstruieren und zu generieren, die hauptsächlich Impfstoffkandidaten nutzen. Sechs Serien entstehen an unterschiedlichen Stellen der Bakterienoberfläche. Sie haben keine konservierten Marker.
Daher können affinitätsbasierte Ansätze nur eine Teilmenge der Elektrofahrzeuge anreichern. Im Gegensatz dazu erfasst unsere Methode alle erzeugten Mykobakterien-EVs. Das Verfahren wird Mohd Ilyas, ein Doktorand aus meinem Labor, vorführen.
Geben Sie zunächst einen Milliliter Glycerinbrühe von Wildtyp- oder rekombinantem Mycobacterium smegmatis in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 10 Milliliter vorgewärmte 7H9-Brühe enthält. Schließen Sie den Deckel und schwenken Sie das Röhrchen, bevor Sie die Kultur über Nacht bei 37 Grad Celsius zwischen 200 und 220 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Am nächsten Tag, wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern etwa eins erreicht, zentrifugiert man die Kultur bei 3.200 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgt den Überstand in einen Flüssigkeitsbehälter.
Fügen Sie einen Milliliter vorgewärmtes Sautons-Medium hinzu und resuspendieren Sie es vorsichtig, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten. Reduzieren Sie das Volumen auf 10 Milliliter mit Sautons-Medien. Zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie den Überstand.
Nach dem Waschen resuspendieren Sie die Bakterienzellen. in 20 Milliliter vorgewärmtem Sauton-Medium und messen die optische Dichte bei 600 Nanometern. Die erforderliche Menge an Bakteriensuspension wird in einen Ein- bis Zwei-Liter-Erlenmeyerkolben mit 330 Millilitern Sautons-Medium geimpft und bei 37 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert, bis die optische Dichte 0,3 erreicht.
Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen einmal, wie zuvor gezeigt, und resuspendieren Sie das Pellet in 330 Milliliter Sautons, die 1/10 Tween 80 enthalten. Verteilen Sie 50 Milliliter der Zellsuspension auf sechs Ein-Liter-Kolben, die jeweils 280 Milliliter vorgewärmte Sautons enthalten, die 1/10 Tween 80 enthalten. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute, bis die optische Dichte zwei bis 2,5 erreicht.
Zwei Liter Kulturen im mittleren Exponentialstadium werden in sechs 400-Milliliter-Flaschen gegeben und bei 8.000 G 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand und die vorgekühlten autoklavierten Kolben oder Bechergläser und lagern Sie ein Aliquot des Pellets für analytische Verfahren. Das Pellet ist gefärbt, wenn die EVs rekombinant für mCherry sind, und braun, wenn sie Wildtyp oder rekombinant für nicht-fluoreszierende Proteine sind.
Filtern Sie den Kulturüberstand durch einen 0,45-Mikron-Entsorgungsfilter, gefolgt von einer Filtration durch einen 0,22-Mikron-Filter, um alle Spuren von Bakterien zu entfernen. Anschließend werden die 30-Kilodalton-Membrankonzentratoren mit 15 Millilitern doppelt destilliertem Wasser bei 4.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius vorgewaschen. Waschen Sie dann mit 15 Millilitern vorgefiltertem kaltem Sautons-Medium unter den gleichen Bedingungen, um alle Spuren von Chemikalien zu entfernen.
Nach dem Waschen werden 15 Milliliter gefilterter Kulturüberstand in einen Konzentrator gegeben und 20 Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius konzentriert. Füllen Sie das Konzentrat in ein kaltes 40-Milliliter-Oak Ridge-Zentrifugenröhrchen oder ein frisches 50-Milliliter-Falcon-Zentrifugenröhrchen um. Sobald die gesamten zwei Liter Kulturfiltrat konzentriert sind, wird das Konzentrat in ein doppelt destilliertes, gewaschenes und vorgekühltes 50-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt und einer zweistufigen Zentrifugation unterzogen.
Zuerst bei 4.000 g, dann bei 15.000 g.Das zentrifugierte Konzentrat in ein vorgekühltes 38,5-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen überführen und bei 100.000 g vier Stunden bei vier Grad Celsius schleudern. Sammeln Sie den Überstand in einem vorgekühlten 50 Milliliter frischen Falcon-Zentrifugenröhrchen. Drehen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen auf ein frisches, fusselfreies, saugfähiges Papier, um Spuren des Überstands zu entfernen, und resuspendieren Sie das Pellet in 600 Mikroliter HEPES-Puffer.
Schichten Sie das resuspendierte Pellet auf den Boden eines vorgekühlten 13-Milliliter-UltraClear-Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchens und mischen Sie es vorsichtig mit vier Millilitern inerter Iodixanol-Lösung mit 60 % Dichtegradient. Anschließend mit je einem Milliliter 40 %, 30 %, 20 % und 10 % Jodixanol überlagern. Füllen Sie das Röhrchen, indem Sie oben vier Milliliter 6%iges Jodixanol hinzufügen.
Nach sorgfältigem Wiegen des Röhrchens in einem Glasbecher oder einem Ständer wird es vorsichtig in die schwingenden Eimer und dann in den Rotor der schwingenden Eimer für die Ultrazentrifugation bei 141.000 G für 16 Stunden bei vier Grad Celsius überführt. Nach der Ultrazentrifugation wird das Röhrchen vorsichtig entfernt und eine Fraktion von einem Milliliter in autoklavierte Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. Die TEM-Analyse zeigte, dass mykobakterielle EVs kreisförmig sind, und die Nano-Tracking-Analyse bestätigte unterschiedlich große EVs mit Durchmessern zwischen 20 und 250 Nanometern.
Als das N-terminale Ende von mCherry translational mit dem C-terminalen Ende von CFP-29 fusioniert wurde, färbte sich ein Teil der angereicherten mEVs von Msm rosa, was auf die Fähigkeit von cf-29 hindeutet, ein fremdes Protein von Interesse zu tragen. CFP-29 wurde dann verwendet, um die EsxA-Verabreichung in MSM-Elektrofahrzeuge zu evaluieren. EsxA von Mtb wurde in MSM-Elektrofahrzeugen in geringen Mengen beobachtet.
CFP-29 EsxA 3X FLAG war stabiler und akkumulierte in mEVs auf höheren Niveaus. Die Anreicherung der EVs aus Mykobakterien, die unter physiologisch unterschiedlichen Bedingungen gezüchtet wurden, gibt Einblicke in ihre veränderten Inhaltsstoffe und modifizierten Funktionen, die eine anhaltende Infektiosität, Pathogenese und Ausbreitung von Krankheitserregern bestimmen.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm). Es beschreibt auch das Design und die Anreicherung von mCherry-enthaltenden rekombinanten MsmEVs und verifiziert diesen neuartigen Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Impfstoffentwicklung
- Extrazelluläre Vesikel
Hintergrund
- Mykobakterielle extrazelluläre Vesikel (EVs) spielen eine entscheidende Rolle in der zellulären Kommunikation.
- Verschiedene Serien von EVs werden von verschiedenen Stellen auf der bakteriellen Oberfläche generiert.
- Affitätsbasierte Ansätze können aufgrund des Mangels an konservierten Markern nur einen Teil der EVs anreichern.
- Diese Studie präsentiert eine Methode zur Erfassung aller generierten mykobakteriellen EVs.
Zweck der Studie
- Zur Anreicherung nativer mykobakterieller EVs für die Inhaltsanalyse.
- Zum Design und zur Herstellung rekombinanter EVs für potenzielle Impfstoffkandidaten.
- Um einen neuartigen Ansatz für die Anreicherung spezifischer Proteine innerhalb von EVs zu demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Isolierung von mEVs aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis.
- Design rekombinanter mEVs, die mCherry enthalten.
- Anreicherung von mEVs, die das EsxA-Protein enthalten.
- Verifizierung der Anreicherungsmethode durch experimentelle Verfahren.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Anreicherung nativer mEVs von Mycobacterium smegmatis.
- Entwicklung von mCherry-enthaltenden rekombinanter mEVs.
- Verifizierung der Methode mit EsxA-Protein-enthaltenden mEVs.
- Demonstration des Verfahrens durch einen PhD-Studenten aus dem Labor.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht eine umfassende Anreicherung mykobakterieller EVs.
- Rekombinante mEVs können für die Impfstoffentwicklung konzipiert werden.
- Dieser Ansatz verbessert das Verständnis der Funktionen mykobakterieller EVs.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Comprehensive enrichment of native and recombinant mycobacterial extracellular vesicles (EVs) enables precise interrogation of vesicle content and function, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in vaccine and infectious disease research. The ability to engineer and isolate EVs containing specific immunogens or reporters provides a robust platform for evaluating antigen delivery and vesicle-mediated biological effects. This workflow enhances predictive confidence at the discovery-to-preclinical interface for vaccine candidate assessment and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic analysis of vesicle-associated proteins and immunogens for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the biological roles of native and engineered EVs.
- Facilitates functional assessment of antigen incorporation and delivery within vesicle systems.
Screening & Assay Development
- Provides standardized enrichment of EVs for reproducible downstream assays.
- Enables quantitative and qualitative assessment of recombinant protein loading in EVs.
- Supports development of scalable, reusable platforms for vesicle-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vesicle content analysis with disease-relevant immunogen delivery for translational studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of vesicle-based vaccine candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by characterizing vesicle-mediated antigen presentation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing and target validation through assay development and preclinical evaluation of vesicle-based candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of vesicle content and function for mechanistic clarity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative EV preparations for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Provides size, content, and protein incorporation data to compare native and recombinant EVs.
- Translational Research: Enables alignment of vesicle engineering with disease-relevant immunogen delivery.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for EV enrichment across diverse mycobacterial systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vesicle-based candidate evaluation.
- Operational Value: Standardizes EV enrichment for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target and antigen validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vesicle-based vaccine and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, vesicle isolation, and protein engineering.
- Demands access to ultracentrifugation and analytical instrumentation for EV characterization.
- Necessitates cross-team standardization of enrichment and analytical protocols.
- Adaptation may be needed for different mycobacterial species or immunogen constructs.
- Affinity-based enrichment may not capture all EV subtypes due to lack of conserved markers.
