Das serielle Anästhesie-Array für die Hochdurchsatzuntersuchung flüchtiger Wirkstoffe mit Drosophila melanogaster

Die SAA ermöglicht die Hochdurchsatzverarbeitung zur Untersuchung der Pharmakologie flüchtiger Wirkstoffe in wirbellosen Modellorganismen, die mit einem ausgeklügelten Gehirn und einem großen Repertoire an Verhaltensweisen ausgestattet sind. In Kombination mit dem genetischen Werkzeugkasten, der in Drosophila melanogaster zur Verfügung steht, ermöglicht diese Technik, die Pharmakogenetik flüchtiger Wirkstoffe schnell und kostengünstig zu untersuchen. Viele Menschen sind flüchtigen Stoffen als Schadstoffe oder Therapeutika ausgesetzt.

Neben der Anästhesie haben flüchtige Anästhetika zahlreiche toxische und positive Kollateralwirkungen. Das Ausmaß der Wirkung wird zum Teil durch die Genetik bestimmt, die noch weitgehend unerforscht ist. Modifizieren Sie nach der Herstellung des Holzrahmens die 50-Milliliter-Chronikrohrkappen, indem Sie mit einem 9/32-Zoll-Bohrer zwei Löcher in jede Kappe bohren.

Schleifen Sie die Löcher, um das zerlumpte Plastik zu reinigen. Schleifen Sie auch die Oberseite der Kappe, um die Oberfläche aufzurauen. Schneiden Sie dann fünf Milliliter serologische Pipetten zu, indem Sie den Kunststoff einritzen und an der geritzten Linie sauber brechen.

Schleifen Sie die Enden der abgeschnittenen oder zerbrochenen Pipetten. Kleben Sie anschließend das Netz auf die Schläuche und schneiden Sie das Netz auf die Schlauchgröße zu, sobald der Kleber getrocknet ist. Führen Sie die Röhrchen in die Löcher der konischen Kappen ein, wobei beide Röhrchen über die Kappe hinausragen.

Achten Sie darauf, dass das Zulaufrohr länger in das Rohr hineinragt als der Abfluss. Tragen Sie Kleber auf die Oberseite der Kappen um die Rohre auf, um die Teile zusammenzuhalten und trocknen zu lassen. Befestigen Sie selbstklebende Kabelzurrgurte am Rahmen.

Befestigen Sie die Kappen mit Kabelbindern am Rahmen und schneiden Sie die Enden des Kabelbinderetiketts kurz ab. Schneiden Sie die Länge des Tygon-Schlauchs ab und verbinden Sie ihn mit den Ein- und Auslaufschläuchen an jeder modifizierten Kappe. Beginnen Sie am stromaufwärts gelegenen Ende und befestigen Sie den Schlauch zuerst am Zulauf, dann vom Auslauf zum Einlauf der nachfolgenden Position.

Fügen Sie als Nächstes einen Durchflussindikator zum flussabwärts gelegenen Zufluss hinzu. Setzen Sie ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen in die erste Position und markieren Sie die Wassereinfüllmarkierung. Entfernen Sie den Schlauch.

Füllen Sie es unterhalb des Zulaufrohrs mit Wasser und setzen Sie es wieder in Position. Bereite die Schnittstelle für den Vaporizer vor. Entfernen Sie die Kolben, schneiden Sie Kerben aus zwei 10-Milliliter-Dosierspritzen und führen Sie sie in den Ein- und Auslass des Vaporizers ein, wobei die Kerben direkt zur Vorderseite des Vaporizers zeigen, um sie mit den Löchern auszurichten.

Schließen Sie das gesamte System an. Verwenden Sie Tygon-Schläuche, um den Trägergastank mit dem Regler, dem gasspezifischen Durchflussmesser, dem Verdampfer und dem SAA zu verbinden. Füllen Sie leere Stellen auf dem Array mit leeren 50-Milliliter-Chronikröhrchen.

Schalten Sie nun den Gastank ein. Öffnen Sie den Durchflussmesser auf zwei Liter pro Minute und schalten Sie den Verdampfer auf 0 % einBestätigen Sie den Gasfluss durch das System, indem Sie den Durchflussmesser vor dem Verdampfer und den Durchflussanzeiger stromabwärts der letzten Kammer des SAA auf Durchfluss überprüfen. Alternativ können Sie das nachgeschaltete Schlauchende ins Wasser stecken und nach Blasen suchen.

24 Stunden oder mehr vor der Anästhesieexposition sortieren Sie die Fliegenkohorten nach Bedarf für das Experiment mit der bevorzugten Methode. Übertragen Sie die Fliegen aus Lebensmittelfläschchen in leere konische 50-Milliliter-Röhrchen. Zählen und notieren Sie alle toten Fliegen, bevor Sie sie aussetzen.

Öffnen Sie die Kappe und schrauben Sie 50-Milliliter-Konusröhrchen mit Fliegen auf den SAA. Schalten Sie das Trägergas ein und stellen Sie es auf die gewünschte Durchflussmenge ein. Stellen Sie den Betäubungsverdampfer auf die gewünschte Konzentration ein und setzen Sie die Fliegen für die gewünschte Dauer aus.

Am Ende der Belichtung spülen Sie das System fünf Minuten lang mit dem Frischgasstrom mit 1,5 Litern pro Minute, was etwa dem 10-fachen des gesamten SAA-Volumens entspricht. Öffnen Sie den Hochdruckregler vollständig und schließen Sie ihn dann um eine halbe Umdrehung, um den Trägergasfluss zu gewährleisten. Folgen Sie den Schläuchen für jede Leitung zu den Durchflussmessern und dem Verdampfer und überprüfen Sie den Anästhesiespiegel in den Verdampfern.

Vergewissern Sie sich, dass beim Gasfluss der Durchfluss auf dem Durchflussmesser und auf der Durchflussanzeige stromabwärts angezeigt wird. Lassen Sie am Ende des Experiments vier bis fünf Minuten Luftstrom stehen, um das Anästhetikum auszuwaschen. Sieben Linien, die aus einer einzigen Population durch Einzelpaartreffen isoliert wurden, zeigten eine Variation der durch Isofluor-Toxizität induzierten Mortalität aufgrund des evolutionären Drucks in ND23 60114-Fliegen.

Die Vorkonditionierung von Fliegen mit 15 Minuten 2%ISO-Fluor vor einem Schädel-Hirn-Trauma reduzierte den Mortalitätsindex nach 24 Stunden bei weißen 1118- und gelb/weißen Stämmen. Der Mortalitätsindex nach 24 Stunden war in den vorkonditionierten Linien Oregon R und Canton S nicht signifikant niedriger. Während der Montage müssen die Kerben in den modifizierten Spritzen mit den Löchern der Verdampferanschlüsse ausgerichtet sein.

Überprüfen Sie während der Exposition regelmäßig, ob das System durchströmt wird. Dieses Verfahren kann für eine Vielzahl von Verhaltens-, Überlebens- und molekularen Studien durchgeführt werden, die zu Erkenntnissen über die Pharmakologie flüchtiger Wirkstoffe führen könnten.