Name: Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung bioaktiver Nanoscheiben zur Wirkstoffabgabe. Diese Methode ermöglicht die wässrige Löslichkeit hydrophober Verbindungen wie Amphotericin B für verbesserte therapeutische Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health (R37 HL-64159) unterstützt.

<ol><li>Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+HDL+as+a+therapeutic+delivery+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).</li>
<li>Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+maturation+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">HDL maturation and remodelling.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119(2022).</li>
<li>Nicholls, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+serial+infusions+of+CER-001%2C+a+pre-%CE%B2+high-density+lipoprotein+mimetic%2C+on+coronary+atherosclerosis+in+patients+following+acute+coronary+syndromes+in+the+CER-001+Atherosclerosis+Regression+Acute+Coronary+Syndrome+Trial%3A+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial.</a> JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).</li>
<li>Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-targeted+therapies%3A+progress%2C+failures+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">HDL-targeted therapies: progress, failures and future.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+for+structural+and+functional+studies+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins.</a> Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).</li>
<li>Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+GOLD-domain+seven-transmembrane+helix+protein+family+member+TMEM87A%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A.</a> eLife. 11, e81704(2022).</li>
<li>Pérez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+tumor-associated+macrophages+with+89Zr-labeled+high-density+lipoprotein+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles.</a> Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).</li>
<li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+cardiolipin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Studies of the cardiolipin interactome.</a> Progress in Lipid Research. 88, 101195(2022).</li>
<li>Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+bacterial+expression+of+human+apolipoprotein+A-I%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I.</a> Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).</li>
<li>Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+approach+for+human+recombinant+apolipoprotein+E4+expression+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification.</a> Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).</li>
<li>Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foam+fractionation+of+a+recombinant+biosurfactant+apolipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein.</a> Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).</li>
<li>Fisher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+overexpression%2C+isotope+enrichment%2C+and+NMR+analysis+of+the+N-terminal+domain+of+human+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).</li>
<li>Jonas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of high-density lipoproteins.</a> Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).</li>
<li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodisks%3A+hydrophobic+drug+delivery+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).</li>
<li>Oda, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+high+density+lipoprotein+enriched+with+the+polyene+antibiotic+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B.</a> Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).</li>
<li>Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans-retinoic+acid+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">All-trans-retinoic acid nanodisks.</a> International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).</li>
<li>Ghosh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+nanodisks%3A+formulation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Curcumin nanodisks: formulation and characterization.</a> Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+high-density+lipoproteins+for+delivery+of+10-hydroxycamptothecin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).</li>
<li>Zhao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingadienes+show+therapeutic+efficacy+in+neuroblastoma+in+vitro+and+in+vivo+by+targeting+the+AKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Investigational+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway.</a> Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).</li>
<li>Moschetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+characterization+of+biocompatible+coenzyme+Q10+enriched+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles.</a> Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).</li>
<li>Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutlin-3a+nanodisks+induce+p53+stabilization+and+apoptosis+in+a+subset+of+cultured+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanomedicine+and+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells.</a> Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454(2017).</li>
<li>Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lutein+nanodisks+protect+retinal+pigment+epithelial+cells+from+UV+light+induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage.</a> Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022(2022).</li>
<li>Scheetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+HDL+nanoparticles+delivering+docetaxel+and+CpG+for+chemoimmunotherapy+of+colon+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777(2020).</li>
<li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature Communications. 5, 3065(2014).</li>
<li>Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+studies+of+amphotericin+B+solubilized+in+nanoscale+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).</li>
<li>Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+stabilized+amphotericin+B+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Peptide stabilized amphotericin B nanodisks.</a> Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).</li>
<li>Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodisks+derived+from+amphotericin+B+lipid+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).</li>
<li>Nguyen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphotericin+B+induces+interdigitation+of+apolipoprotein+stabilized+nanodisk+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).</li>
<li>Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobiotechnology+applications+of+reconstituted+high+density+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8, 28(2010).</li>
<li>Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a+nanodisks+promote+ex+vivo+expansion+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66(2016).</li>
<li>Crosby, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD20+single+chain+variable+antibody+fragment-apolipoprotein+A-I+chimera+containing+nanodisks+promote+targeted+bioactive+agent+delivery+to+CD20-positive+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas.</a> Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).</li>
<li>Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid+nanodisks+as+an+siRNA+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle.</a> Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).</li>
<li>Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+transformation+of+cardiolipin+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).</li>
<li>Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+release+of+cytochrome+c+from+cardiolipin+nanodisks%3A+Implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722(2021).</li>
<li>Fox, C. A., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+binding+assay+reveals+doxorubicin+preference+for+DNA+versus+cardiolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin.</a> Analytical Biochemistry. 594, 113617(2020).</li>
<li>Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+nanodisks+confer+protection+against+doxorubicin-induced+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984(2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Formulierung eines bioaktiven Wirkstoffs, der Nanoscheiben enthält, stellt eine bequeme Methode zur Solubilisierung ansonsten unlöslicher hydrophober Verbindungen dar. Da das Produkt nanoaktive Wirkstoff-Nanoscheiben in wässrigen Medien vollständig löslich sind, bieten sie eine nützliche Verabreichungsmethode für eine Vielzahl von hydrophoben Molekülen (Tabelle 1). Dazu gehören kleine Moleküle, natürliche und synthetische Medikamente, sekundäre Pflanzenstoffe, Hormone usw. Die Formulierungsstrategie ...

Entstehende diskoidale High-Density-Lipoproteine (HDLs) sind natürlich vorkommende Vorläufer des weitaus häufiger vorkommenden sphärischen HDL, das im menschlichen Kreislaufsystem vorkommt. Diese entstehenden Partikel, die auch als prä-ß-HDL bezeichnet werden, besitzen einzigartige und unverwechselbare strukturelle Eigenschaften1. Tatsächlich existieren die entstehenden HDLs nicht als kugelförmige Partikel, sondern sind scheibenförmig. Umfangreiche strukturelle Charakterisierungsstudien an natürlichen und rekonstituierten diskoidalen HDLs haben gezeigt, dass sie aus einer Phospholipiddoppelschicht bestehen, deren Umfang durch ein amphipathisches austauschbares Apolipoprotein (apo), wie z.B. apoA-I, begrenzt ist. Im humanen Lipoproteinstoffwechsel akkumulieren zirkulierende naszierende HDLs Lipide aus peripheren Zellen und reifen zu kugelförmigen HDLs in einem Prozess, der von wichtigen Proteinmediatoren abhängig ist, darunter der ATP-bindende Kassettentransporter A1 und Lecithin:Cholesterin-Acyltransfers2. Dieser Prozess stellt eine wichtige Komponente des umgekehrten Cholesterintransportwegs dar, der als Schutz vor Herzerkrankungen gilt. Ausgestattet mit diesem Wissen und der Fähigkeit, diskoidale HDLs zu rekonstruieren, haben Forscher diese Partikel als therapeutische Intervention zur Behandlung von Atheroskleroseeingesetzt 3. Im Wesentlichen fördert die Infusion von rekonstituiertem HDL (rHDL) in Patienten den Cholesterinausfluss aus Plaqueablagerungen und gibt es zur Leber zurück, wo es in Gallensäuren umgewandelt und aus dem Körper ausgeschieden wird. Mehrere Biotechnologie-/Pharmaunternehmen verfolgen diese Behandlungsstrategie4.
Gleichzeitig hat die Möglichkeit, diese Partikel im Labor zu erzeugen, eine Flut von Forschungsaktivitäten ausgelöst, die zu neuartigen Anwendungen und neuen Technologien geführt haben. Eine prominente Anwendung ist die Verwendung von rHDL-Partikeln als Miniaturmembran zur Unterbringung von Transmembranproteinen in einer nativen Umgebung5. Bis heute wurden Hunderte von Proteinen erfolgreich in diskoidales rHDL eingebaut, und die Forschung hat gezeigt, dass diese Proteine sowohl die native Konformation als auch die biologische Aktivität als Rezeptoren, Enzyme, Transporter usw. beibehalten. Es hat sich auch gezeigt, dass diese Partikel, die als "Nanodiscs" bezeichnet werden, für eine strukturelle Charakterisierung geeignet sind, oft mit hoher Auflösung6. Dieser Ansatz zur Untersuchung von Transmembranproteinen gilt als überlegen gegenüber Studien mit Detergenzienmizellen oder Liposomen und schreitet daher rasch voran. Es ist wichtig zu erkennen, dass zwei verschiedene Methoden beschrieben wurden, die in der Lage sind, eine rHDL zu bilden. Die "Cholatdialyse"-Methode13 ist beliebt für Anwendungen, die mit dem Einbau von Transmembranproteinen in die rHDL-Doppelschicht5 zusammenhängen. Im Wesentlichen beinhaltet dieses Formulierungsverfahren das Mischen einer Doppelschicht, die ein Phospholipid, ein Gerüstprotein bildet, und das interessierende Transmembranprotein in einem Puffer, der das Detergens Natriumcholat (oder Natriumdesoxycholat; Mizellenmolekulargewicht [MW] von 4.200 Da) enthält. Das Detergens löst die verschiedenen Reaktionskomponenten effektiv auf, so dass die Probe gegen Puffer ohne Detergens dialysiert werden kann. Während des Dialyseschritts, wenn das Detergen aus der Probe entfernt wird, bildet sich spontan ein rHDL. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, um ein Transmembranprotein von Interesse einzufangen, wurden die Produktpartikel als Nanoscheiben5 bezeichnet. Versuche, mit dieser Methode niedermolekulare hydrophobe bioaktive Wirkstoffe (MW <1.000 Da) einzubauen, blieben jedoch weitgehend erfolglos. Im Gegensatz zu Transmembranproteinen sind niedermolekulare bioaktive Wirkstoffe in der Lage, zusammen mit dem Detergens aus dem Dialysebeutel zu entweichen, was ihre Inkorporationseffizienz in rHDLs stark verringert. Dieses Problem wurde gelöst, indem Detergenzien aus der Formulierungsmischung14 weggelassen wurden. Stattdessen werden die Komponenten nacheinander in einen wässrigen Puffer gegeben, beginnend mit der Doppelschicht, die ein Lipid bildet, wodurch ein stabiler bioaktiver Wirkstoff entsteht, der rHDL enthält, der als Nanodisk bezeichnet wird. Andere haben rHDL für den Einbau und Transport von In-vivo-Bildgebungsmitteln verwendet 7. In jüngerer Zeit wurden spezialisierte rHDL, bestehend aus einem Apolipoprotein-Gerüst und dem anionischen Glycerophospholipid Cardiolipin, in Ligandenbindungsstudien eingesetzt. Diese Partikel bieten eine Plattform für Studien zur Wechselwirkung von Cardiolipin mit verschiedenen wasserlöslichen Liganden, darunter Calcium, Cytochrom c und das Krebsmittel Doxorubicin8.
Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt auf der Formulierung von rHDL, die einen stabil eingebauten hydrophoben bioaktiven Wirkstoff (d.h. Nanodisk) besitzen. Die Fähigkeit dieser Wirkstoffe, sich in das Lipidmilieu von scheibenförmigen rHDL-Partikeln zu integrieren, verleiht ihnen effektiv eine wässrige Löslichkeit. Daher haben Nanoscheiben das Potenzial für therapeutische Anwendungen in vivo . Bei der Formulierung von Nanoscheiben sind bestimmte Inkubations-/Reaktionsbedingungen erforderlich, um diskrete hydrophobe bioaktive Wirkstoffe erfolgreich in das Produktpartikel einzubauen, und das Ziel dieses Berichts ist es, detaillierte praktische Informationen bereitzustellen, die als grundlegende Vorlage für die Herstellung neuartiger Nanoscheibenpartikel für bestimmte Anwendungen verwendet werden können. Daher sind die Begriffe Nanodisc und Nanodisk im Kontext dieses Manuskripts nicht austauschbar. Während sich Nanodisc auf ein rHDL bezieht, das so formuliert ist, dass es ein Transmembranprotein enthält, das in seine Lipiddoppelschicht5 eingebettet ist, bezieht sich der Begriff Nanodisk auf ein rHDL, das so formuliert ist, dass es hydrophobe bioaktive Wirkstoffe mit niedrigem Molekulargewicht (< 1.000 Da), wie z. B. Amphotericin B14, enthält.
Für die Gewinnung geeigneter Gerüstproteine stehen eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung. Es ist möglich, Gerüstproteine von Herstellern zu kaufen [z. B. apoA-I (SRP4693) oder apoE4 (A3234)], jedoch können die Kosten ein limitierender Faktor sein. Ein bevorzugter Ansatz ist die Expression rekombinanter Gerüstproteine in Escherichia coli. Es wurden Protokolle für humane apoA-I9, apoE410 sowie das Insekten-Hämolymphprotein Apolipophorin-III11 veröffentlicht. Für die Zwecke der hierin beschriebenen Experimente wurde eine rekombinante humane apoE4 N-terminale (NT) Domäne (Aminosäuren 1-183) verwendet. Die Nukleotidsequenz, die für humanes apoE4-NT kodiert, wurde synthetisiert und in einen pET-22b (+) Expressionsvektor eingefügt, der direkt an die vektorkodierte pelB-Leader-Sequenz angrenzt. Dieses Konstrukt führt zur Expression eines pelB-Leader-Sequenz-apoE4-NT-Fusionsproteins. Nach der Proteinsynthese leitet die bakterielle pelB-Leader-Sequenz das neu synthetisierte Protein in den periplasmatischen Raum, wo die Leader-Peptidase die pelB-Sequenz spaltet. Das resultierende apoE4-NT-Protein ohne Sequenzmarkierungen oder Schwänze entweicht anschließend den Bakterien und reichert sich im Nährmedium11,12 an, was die nachgelagerte Verarbeitung vereinfacht.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>11636</td><td>ND Formulierung & Standardpräparation</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP17925</td><td>Transformation & Expansion</td></tr><tr><td>ApoE4-NT Plasmid</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>Transformation</td></tr><tr><td>Baffled Flask</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>N/A</td><td>Expansion & Expression</td></tr><tr><td>BL21 kompetente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Transformation</td></tr><tr><td>Zentrifugenflaschen</td><td>Nalgene</td><td>3140-0250</td><td>Expression</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>G607-4</td><td>ND Formulierung</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>Standard Präpartation</td></tr><tr><td>Dymyristoylphosphatidylcholin</td><td>Avanti Lipide</td><td>850345P</td><td>ND Formulierung</td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben</td><td>Bellco Biotechnology</td><td>N/A</td><td>Expansion & Expression</td></tr><tr><td>Falcon Tubes</td><td>Sarstedt Ag & Co</td><td>D51588</td><td>Hefe-Viabilitäts-Assay</td></tr><tr><td>Glas-Borosilikat-Röhrchen</td><td>VWR</td><td>47729-570</td><td>ND</td></tr><tr><td>Formulation GraphPad (Software)</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>Hefe-Viabilitäts-Assay</td></tr><tr><td>Beheiztes Beschallungsbad</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>ND Formulaton</td></tr><tr><td>Heiz- und Stickstoffmodul</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18822</td><td>ND Formulation</td></tr><tr><td>HiTrap Heparin HP (5 mL)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0407-03</td><td>Aufreinigung</td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>Expression</td></tr><tr><td>J-25 Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>J325-IM-2</td><td>Expression</td></tr><tr><td>JA-14 Rotor Beckman</td><td>Coulter</td><td>339247</td><td>Expression</td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>7755030</td><td>ND Formulierung</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>ND Formulierung</td></tr><tr><td>Stickstoffgas</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td>ND Formulierung</td></tr><tr><td>NZCYM Medien</td><td>RPI Research Products</td><td>N7200-1000.0</td><td>Expansion & Ausdruck</td></tr><tr><td>Pet-22B Vektor</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>Transformation</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875718</td><td>Transformation & Expansion</td></tr><tr><td>Quarzküvetten</td><td>Fisher Brand</td><td>14385 928A</td><td>Spektralanalyse</td></tr><tr><td>Schüttelbrutkasten</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1344-0004</td><td>Transformation, Expansion & Expression</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Bojen</td><td>Thermo Scientific</td><td>66430</td><td>Reinigung</td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialyseschlauch</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td>Reinigung</td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialyseschlauch</td><td>Thermo Scientific</td><td>88243</td><td>Reinigung</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td>Reinigung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Reinigung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500</td><td>Reinigung</td></tr><tr><td>Spectra/POR gewichtete Verschlüsse</td><td>Spektrum Medizinische Industrie</td><td>132736</td><td>Reinigung</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Shimadzu UV-1800</td><td>220-92961-01</td><td>Spektralanalyse</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>ND Formulation</td></tr><tr><td>UVProbe 2.61 (Software)</td><td>Shimadzu</td><td>N/A</td><td>Spektralanalyse</td></tr><tr><td>Vakuumfilter</td><td>Millipore</td><td>9004-70-0</td><td>Expression & </td></tr><tr><td>Reinigungs-Vakuumpumpe</td><td>GAST Manufacturing Inc</td><td>DOA-P704-AA</td><td>Expression & Aufreinigung</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>ND Formulierung</td></tr><tr><td>Hefe</td><td>N/A</td><td>BY4741</td><td>Hefe-Viabilitätsassay</td></tr><tr><td>Hefeextrakt-Pepton-Dextrose</td><td>BD</td><td>242820</td><td>Hefe-Viabilitätsassay</td></tr></tbody></table>

formulierung und charakterisierung bioaktiver wirkstoffe, die nanoscheiben enthalten

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

Der Begriff Nanodisk bezieht sich auf eine diskrete Art von Nanopartikeln, die aus einer Doppelschicht, die ein Lipid bildet, einem Gerüstprotein und einem integrierten bioaktiven Wirkstoff besteht. Nanoscheiben sind als scheibenförmige Lipiddoppelschicht organisiert, deren Umfang durch das Gerüstprotein begrenzt wird, das normalerweise zur Familie der austauschbaren Apolipoproteine gehört. Zahlreiche hydrophobe bioaktive Wirkstoffe wurden in Nanoscheiben effizient gelöst, indem sie in das hydrophobe Milieu der Lipiddoppelschicht des Partikels integriert wurden, was zu einer weitgehend homogenen Population von Partikeln im Bereich von 10-20 nm Durchmesser führte. Die Formulierung von Nanoscheiben erfordert ein präzises Verhältnis der einzelnen Komponenten, eine geeignete sequenzielle Zugabe jeder Komponente, gefolgt von einer Badbeschallung der Formulierungsmischung. Das amphipathische Gerüstprotein kontaktiert und reorganisiert spontan die dispergierte Doppelschicht, die ein Lipid/bioaktives Wirkstoffgemisch bildet, um eine diskrete, homogene Population von Nanoscheibenpartikeln zu bilden. Während dieses Prozesses geht das Reaktionsgemisch von einem undurchsichtigen, trüben Aussehen in eine geklärte Probe über, die, wenn sie vollständig optimiert ist, beim Zentrifugieren keinen Niederschlag ergibt. Die Charakterisierungsstudien umfassen die Bestimmung der Solubilisierungseffizienz bioaktiver Wirkstoffe, Elektronenmikroskopie, Gelfiltrationschromatographie, UV/Vis-Absorptionsspektroskopie und/oder Fluoreszenzspektroskopie. Daran schließt sich in der Regel eine Untersuchung der biologischen Aktivität mit kultivierten Zellen oder Mäusen an. Im Falle von Nanodisks, die ein Antibiotikum (d. h. das Makrolid-Polyen-Antibiotikum Amphotericin B) enthalten, kann ihre Fähigkeit, das Wachstum von Hefen oder Pilzen in Abhängigkeit von Konzentration oder Zeit zu hemmen, gemessen werden. Die relativ einfache Formulierung, die Vielseitigkeit in Bezug auf die Komponenten, die nanoskalige Partikelgröße, die inhärente Stabilität und die wässrige Löslichkeit ermöglichen unzählige In-vitro - und In-vivo-Anwendungen der Nanodisk-Technologie . Im vorliegenden Artikel beschreiben wir eine allgemeine Methodik zur Formulierung und Charakterisierung von Nanodisks, die Amphotericin B als hydrophoben bioaktiven Wirkstoff enthalten.

Bioaktiver Wirkstoff Nanodisk-Formulierungsprozess Bei dem beschriebenen ampB-Nanodisk-Formulierungsverfahren gilt die Reaktion als abgeschlossen, wenn das Erscheinungsbild der Probe von trüb zu klar übergeht (Abbildung 1). Diese Veränderung deutet darauf hin, dass sich Nanoscheiben gebildet haben und der bioaktive Wirkstoff solubilisiert wurde. Häufig absorbieren bioaktive Wirkstoffe Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich (z. B. ampB, Curcumin, Lutein, Coenzym Q10<...

Hier beschreiben wir die Herstellung und Charakterisierung von bioaktiven Wirkstoffen, die Nanoscheiben enthalten. Amphotericin-B-Nanoscheiben werden als Beispiel genommen, um das Protokoll schrittweise zu beschreiben.

Formulierung und Charakterisierung bioaktiver Wirkstoffe, die Nanoscheiben enthalten

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Dieses Protokoll vermittelt praktisches Wissen, das für die Formulierung von nanoskaligen Partikeln, d. h. Nanoscheiben, nützlich ist, die eine breite Palette hydrophober bioaktiver Moleküle stabil enthalten. Diese Methode hat viele praktische Anwendungen.Die Fähigkeit, ansonsten unlöslichen bioaktiven Verbindungen wässrige Löslichkeit zu verleihen, ermöglicht den Einsatz von Nanodisks in Anwendungen zur Verabreichung von Medikamenten. Die beschriebene Methode ist einfach. Es wird bevorzugt, Studien in der beschriebenen Größenordnung durchzuführen, fünf Milligramm Phospholipid, zwei Milligramm Gerüstprotein, so dass die Bildung von Nanoscheiben leicht durch visuelle Inspektion überwacht werden kann.Michael Karo und Matthew Swackhammer, studentische Forscher im Ryan-Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Um ein Phospholipidaliquot herzustellen, wiegen Sie fünf Milligramm DMPC ab und geben Sie es in ein Reagenzglas aus Glas. Lösen Sie das Phospholipid auf, indem Sie 300 Mikroliter Chloroform und 100 Mikroliter Methanol im Verhältnis drei zu eins hinzufügen.Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel, indem Sie das Glasreagenzglas 10 bis 15 Minuten lang unter einen sanften Strom von Stickstoffgas stellen, so dass sich ein dünner Film aus getrocknetem Phospholipid entlang der Wände des unteren Teils des Röhrchens bildet. Um Amphotericin B oder AmpB-Nanodisks zu formulieren, pipettieren Sie 450 Mikroliter PBS in das lyophilisierte Phospholipid-Aliquot und wirbeln Sie 30 Sekunden lang, um das Lipid zu dispergieren. Pipettieren Sie 50 Mikroliter mit 20 Milligramm pro Milliliter AmpB-Lösung in die dispergierte Phospholipidprobe und den Vortex.Geben Sie 500 Mikroliter von vier Milligramm pro Milliliter ApoE4 NT-Gerüstprotein in das Glasreagenzglas, das das dispergierte Phospholipid und AmpB enthält. Beschallen Sie die Probe im Bad bei 24 Grad Celsius, bis sich die Lösung geklärt hat. Für die AmpB-Nanodisk-Dialyse bereiten Sie einen Abschnitt des Dialyseschlauchs vor, indem Sie ihn 10 Minuten lang gründlich in destilliertem Wasser einweichen.Klemmen Sie mit einer Dialyseschlauchklemme ein Ende des getränkten Dialyseschlauchs ein, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit austreten kann. Führen Sie einen schmalen Trichter in das offene Ende des Dialyseschlauchs ein und übertragen Sie die AmpB-Nanodisk-Probe in den Dialyseschlauch. Entfernen Sie den Trichter und klemmen Sie das Ende des Dialyseschlauchs mit einer anderen Dialyseschlauchklemme ab.Setzen Sie einen Schaumstoff-Dialyseschlauch auf eines der versiegelten Enden des Dialyseschlauchs und legen Sie den zusammengebauten Dialyseschlauch in das Becherglas mit frisch zubereitetem Ein-Liter-PBS-Puffer. Setzen Sie einen magnetischen Rührstab in den Boden des Becherglases ein und stellen Sie den Rührregler auf niedrig, um sicherzustellen, dass kein Wirbel entsteht. Lassen Sie die Dialyse über Nacht bei vier Grad Celsius weiterlaufen.Schalten Sie das Spektralfotometer ein, indem Sie den Netzschalter umlegen, und stellen Sie eine Verbindung zu einem entsprechenden Support-Computer her, indem Sie die PC-Steuerung drücken. Öffnen Sie auf dem Support-Computer die Software mit der Bezeichnung UVProbe 2.61 und stellen Sie eine Verbindung zum Spektralphotometer her, indem Sie in der unteren linken Ecke auf "Verbinden" klicken. Klicken Sie auf das Spektrum und dann auf "Methode"in der oberen Symbolleiste.Klicken Sie auf die Registerkarte "Messung" und geben Sie 500 in das Textfeld "Start" unter "Wellenlängenbereich" und 300 in das Textfeld "Ende" ein. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü neben der Registerkarte mit der Bezeichnung Scangeschwindigkeit"und stellen Sie es auf mittel ein. Bereiten Sie einen Probenrohling vor, indem Sie einen Milliliter DMSO in zwei Quarzküvetten umfüllen.Legen Sie beide Küvetten in die entsprechenden Probenöffnungen des Spektralphotometers. Klicken Sie auf automatisch leer"und nehmen Sie ein Spektrum von 300 bis 500 Nanometern auf, indem Sie auf "Start"in der unteren linken Ecke. Entfernen Sie für die AmpB-Standardspektralanalyse die Küvette aus dem vorderen Probenanschluss und fügen Sie 20 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter AmpB-Stammlösung hinzu.Legen Sie die Küvette wieder in die Probentafel ein und klicken Sie auf "Start", um die Probenabsorption aufzuzeichnen. Entfernen Sie nach der Aufzeichnung der Probenaufnahme die Küvette und füllen Sie den flüssigen Inhalt in einen Abfallbehälter um. Spülen Sie die Küvette gründlich mit drei Waschgängen deionisiertem Wasser aus, gefolgt von drei Waschgängen mit 70%igem Ethanol.Für die Spektralanalyse von gestörter AmpB-Nanodisk wird die Probe vorbereitet, indem Sie 20 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter AmpB-Nanodisk-Stamm in einen Milliliter DMSO pipettieren und eine Minute lang inkubieren, bevor das Spektrum aufgezeichnet wird. Legen Sie die Küvette in den vorderen Probenanschluss ein und klicken Sie auf "Start", um die Probenabsorption aufzuzeichnen. Für die Spektralanalyse eines PBS-Pufferrohlings bereiten Sie einen Rohling vor, indem Sie einen Milliliter PBS in zwei Quarzküvetten überführen.Legen Sie die Küvetten in den Probenanschluss. Klicken Sie auf "Auto Blank" und nehmen Sie das Spektrum von 300 bis 500 Nanometern auf. Für die Spektralanalyse einer ungestörten AmpB-Nanodisk-Probe entfernen Sie die Küvette aus dem vorderen Probenanschluss und geben 20 Mikroliter einer AmpB-Nanodisk-Probe von einem Milligramm pro Milliliter in den PBS-Puffer.Legen Sie die Küvette wieder in die Probenplatine ein. Klicken Sie auf "Start" und nehmen Sie das Probenspektrum auf. Die AmpB-Nanodisk-Formulierungsreaktion gilt als abgeschlossen, wenn das Erscheinungsbild der Probe von trüb zu klar übergeht.Gezeigt wird die UV-sichtbare Absorptionsspektroskopie von AmpB-Proben in DMSO und PBS. In DMSO wurden drei unterschiedliche Absorptionsmaxima bei 372, 392 und 415 Nanometern beobachtet, Peaks, die auf AmpB hindeuten. Die Absorptionsspektren von AmpB-Nanodisks in PBS zeigten einen einzigen großen Absorptionspeak bei kürzerer Wellenlänge.Im Vergleich dazu erschienen die Absorptionsspektren von AmpB-Nanodisks in DMSO ähnlich wie die Spektren von Standard-AmpB. Die biologische Aktivität von AmpB-Nanodisks wurde durch die Bewertung von Hefewachstumshemmungsassays durchgeführt. Kontrollproben wie PBS, DMSO und rekonstituierte High-Density-Lipoproteine zeigten, dass andere Nanodisk-Komponenten als AmpB keinen erkennbaren Einfluss auf das Hefewachstum haben.Die Positivkontrolle bestätigte, dass AmpB ein effizienter Inhibitor des Hefewachstums ist. Im Fall von AmpB-Nanodisks wurde eine konzentrationsabhängige Wachstumshemmungsaktivität beobachtet. Nanodisk-Präparate sind nicht gleich Nanodisk-Präparate.Einige benötigen möglicherweise mehr Zeit, andere Lipide oder andere Gerüstproteine. Sie sind nur undeutlich}ist die Klärung der Nanodisk-Probe. Diese Technik hat zu neuartigen Nanopartikeln geführt, die zur Untersuchung von Doxorubicin-induzierter Kardiotoxizität, Apoptose und Ligandeninteraktionen verwendet werden, und lieferte zahlreiche wässrige unlösliche bioaktive Moleküle, darunter Lutein und Curcumin.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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