Name: Ganze neonatale Cochlea-Explantate als In-vitro-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Kultur von Cochlea-Explantaten aus Ratten zur Untersuchung sensorineuraler Hörverluste. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen von Haarzellen und Spiral-Ganglien-Neuronen.

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Wir danken der Animal Facility des Departements Biomedizin der Universität Basel für ihre Unterstützung bei der Tierpflege, den Microscopy Core Facilities sowie dem Informatikdienst des Departements Biomedizin für ihre technische Unterstützung und dem Schweizerischen Nationalfonds (SNF) für die finanzielle Unterstützung (MD-PhD-Stipendium an M.C., Förderkennzeichen 323530_191222).

Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften der Tierschutzkommission des Kantons Basel-Stadt, Schweiz, durchgeführt. Für die Experimente wurden postnatale C57BL/6JR-Mäuse, Wistar-Ratten und STAT1-defiziente Mäuse (gemischtes C57BL/6-129/SvEv)7 im Alter von 3-5 Tagen und beiderlei Geschlechts verwendet.
1. Beschichtung der Multiwell-Kammern
<ol><li>Bereiten Sie ein vollständiges Nährmedium vor.<ol><li>Für Corti-Explantate des Organs bereiten Sie ein Medium vor, das Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM), 10 % fötales Kälberserum (FBS), 25 mM HEPES und 30 U/ml Penicillin enthält.</li>
		<li>Für Organ-Corti-Explantate und Cochlea-Explantate ein Medium mit DMEM/F12, 1x N2-Ergänzung, 1x B27 minus Antioxidantien und 30 U/ml Penicillin herstellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von Poly-D-Lysin vor, indem Sie 10 ml Zellkulturwasser zu 5 mg Poly-D-Lysin in einer laminaren Haube hinzufügen. Die Endkonzentration von Poly-D-Lysin beträgt 0,5 mg/ml. HINWEIS: Aliquotieren Sie die Restrohlösung und lagern Sie sie bei −20 °C.<ol><li>Bereiten Sie Arbeitslösungen von Poly-D-Lysin vor, indem Sie die Stammlösung 1:10 in sterilem Wasser verdünnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Eine 8-Well-Kammer mit 150 μl/Well Poly-D-Lysin-Arbeitslösung beschichten und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. HINWEIS: Wenn eine 4-Well-Kammer verwendet wird, mit 300 μl/Well Poly-D-Lysin-Arbeitslösung beschichten.</li>
	<li>Saugen Sie die Lösung durch Vakuum oder Pipettieren an.</li>
	<li>2x mit 200 μl sterilem Wasser und einmal mit 200 μl vollständigem Nährmedium oder DMEM waschen.</li>
	<li>Geben Sie 150 μl des vollständigen Nährmediums in jede Vertiefung. HINWEIS: Wenn eine 4-Well-Kammer verwendet wird, fügen Sie 250 μl/Well des vollständigen Nährmediums hinzu.</li>
	<li>Die Kammer wird mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator gestellt, bevor ein Explantat platziert wird.</li>
</ol>2. Dissektion des Schläfenbeins
<ol><li>Desinfizieren Sie den Operationstisch mit 70%igem Ethanol und sterilisieren Sie alle Instrumente in einem Glas-Mikrosphären-Sterilisator.</li>
	<li>Stellen Sie eine sterile 60-mm-Petrischale auf einen Eimer mit Eis.</li>
	<li>Gießen Sie ein paar Milliliter 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und lassen Sie es auf Eis. HINWEIS: Verwenden Sie 30 U/ml Penicillin in 1x PBS, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie ein steriles Pad auf ein steriles Tablett und enthaupten Sie das Jungtier schnell mit einer Operationsschere. Tauchen Sie den Kopf 5 Sekunden lang in 70%iges Ethanol, wenn eine Kontamination häufig vorkommt. HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für Mäuse und Ratten im Alter von P3-P5 getestet. Cochlea-Gewebe ist bei älteren Mäusen und Ratten schwieriger zu sezieren, und das Überleben von Explantaten in Kultur ist begrenzt.</li>
	<li>Legen Sie den Tierkopf auf eine sterile Unterlage. Entferne den Unterkiefer. Hebe die Haut an und ziehe sie vom Schädel ab.</li>
	<li>Halten Sie den Schädel fest, indem Sie die Pinzette in die Augenhöhlen legen.</li>
	<li>Schneiden Sie den Schädel vorsichtig entlang der sagittalen Naht und schneiden Sie dann mit einer scharfen Skalpellklinge in den koronalen Nahtbereich, ohne die Cochlea zu beschädigen. HINWEIS: Vermeiden Sie es, zu viel Druck auszuüben, und vermeiden Sie Vorwärts- und Rückwärtsbewegungen mit dem Skalpell, da dies den Cochlea-Knochen und damit den Cochlea-Gang beschädigen kann.</li>
	<li>Entferne vorsichtig das Gehirn aus den beiden Schädelhälften.</li>
	<li>Die Schädelhälften werden in eine 60 mm Petrischale mit dem in Schritt 2.3 vorbereiteten eiskalten PBS überführt.</li>
</ol>3. Isolierung der Cochlea
<ol><li>Lokalisieren Sie die Cochlea im Schläfenbein unter dem Mikroskop. Setzen Sie die Zange in den oberen Bogengang ein.</li>
	<li>Lockern Sie das umliegende Gewebe zwischen Cochlea und Schläfenbein mit einer Insulinspritze (Mäuse) oder Zange (Ratten).</li>
	<li>Ziehen Sie das Schläfenbein vorsichtig von der Cochlea weg, wobei die Cochlea mit dem Schläfenbein am Vestibulum befestigt bleibt. Stellen Sie sicher, dass die Cochlea frei vom umgebenden Gewebe ist, bevor Sie das Schläfenbein beiseite schieben. HINWEIS: Wenn Sie zu viel Kraft aufwenden, wird der Cochlea-Gang beschädigt.</li>
	<li>Halten Sie die Cochlea in einer festen Position und entfernen Sie mit der anderen Hand vorsichtig die knorpelige Cochlea-Kapsel. Führen Sie die Spitzen der Pinzette vorsichtig in den Scheitelbereich oder zwischen die Windungen ein (sichtbar als weiße Linie) und entfernen Sie die Kapsel Stück für Stück. Legen Sie den Ductus cochlearis frei.</li>
	<li>Legen Sie die Zange vorsichtig unter die Cochlea und lösen Sie sie vom Gleichgewichtsorgan und dem Schläfenbein.</li>
	<li>Übertragen Sie die Cochlea in eine neue 60-mm-Schale mit eiskaltem PBS.</li>
	<li>Passen Sie die Vergrößerung des Mikroskops an, um die Explantaten besser sichtbar zu machen.</li>
	<li>Befolgen Sie die nächsten Schritte für Organ of Corti-Explantate:<ol><li>Halten Sie das Organ mit einer Pinzette an der Basis fest. Entfernen Sie vorsichtig den Ductus cochlearis, indem Sie ihn mit einer Pinzette im Bereich des Basalhakens anfassen.</li>
		<li>Wickeln Sie den Ductus cochlearis vom Modiolus ab, ohne ihn zu zerreißen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig das Spiralband mit der Stria vascularis, indem Sie das Organ an der Basis festhalten und wegziehen. HINWEIS: Die Gewebetrennung kann auch erreicht werden, indem die Spitzenregion anstelle der Basisregion gehalten wird. Dies kann hilfreich sein, wenn Rattenorgane oder ältere Mäusebabys präpariert werden (>P5).</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Reissner-Membran, indem Sie das Organ an der Basis festhalten und Stück für Stück abziehen. HINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, da die Reissner-Membran die Aufnahme der Bildgebung nicht beeinträchtigt.</li>
	</ol></li>
	<li>Befolgen Sie die nächsten Schritte für Cochlea-Explantate:<ol><li>Lösen Sie das Spiralganglion mit einer Insulinspritze (Mäuse) oder einer Zange (Ratten) von der knöchernen Spirallamina.</li>
		<li>Wickeln Sie das Modiolus während des Ablösens vorsichtig ab. HINWEIS: Die Explantate können zur besseren Handhabung in zwei Teile geteilt werden.</li>
		<li>Greife den Hakenbereich mit einer Pinzette.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig das Spiralband mit der Stria vascularis, indem Sie es abziehen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Reissner-Membran, indem Sie das Organ an der Basis festhalten und Stück für Stück abziehen. HINWEIS: Dieser Schritt wird empfohlen, da die Reissner-Membran normalerweise die Neuronenfilamente faltet und bedeckt und daher die Experimente beeinflussen kann.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Kultur von Cochlea-Explantaten
<ol><li>Übertragen Sie die Explantate aus der Petrischale in die Multi-Well-Kammern. Heben Sie die Explantate mit den Haarzellen nach oben mit einem Laborspatel an. Geben Sie ein paar Mikroliter 1x PBS hinzu, um zu verhindern, dass die Proben am Spatel kleben. HINWEIS: Stark beschädigte Explanate bleiben am Spatel haften.</li>
	<li>Lassen Sie die Explantaten vom Spatel in die Kammer gleiten, indem Sie den Spatel vorsichtig im Medium schwenken. Platzieren Sie ein Explantat pro Vertiefung eines Objektträgers mit 8 Vertiefungen. HINWEIS: Wenn das Explantat am Spatel klebt, halten Sie den Spatel in das Medium und verwenden Sie die Pinzette, um die Explantate zu lösen. Platzieren Sie die Pinzette immer am inneren Rand des Explantats (weg von den Haarzellen).</li>
	<li>Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Explantaten in der richtigen Ausrichtung übertragen und in der Mitte der Vertiefungen platziert wurden. HINWEIS: Falsch ausgerichtete Explantate mit nach unten gerichteten Haarzellen neigen dazu, entlang ihrer Breite eine U-Form nach oben zu zeigen. Korrigieren Sie ihre Ausrichtung, indem Sie die Explantate in die Ecken der Kammern verschieben (es ist mehr Medium verfügbar) und sie anweisen, sich zu drehen.</li>
	<li>Entfernen Sie 80 μl des Mediums mit einer 100-μl-Pipette und entsorgen Sie es.</li>
	<li>Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Haarzellen und Spiralganglien-Neuronenzellen sichtbar sind. Falls nötig, verwenden Sie eine Pinzette, um überlappendes Gewebe vorsichtig auseinander zu drücken.</li>
	<li>Entfernen Sie den Rest des Mediums und warten Sie ~10 s.</li>
	<li>Pipetieren Sie das Medium zurück. Geben Sie ein oder zwei Tropfen des Mediums neben das Explantat und den Rest des Mediums in einiger Entfernung vom Explantat, um zu verhindern, dass sich das Explantat ablöst. HINWEIS: Auch wenn die Explantaten an den Kammern befestigt sind, sollte das Medium immer zuerst zugegeben werden, indem ein bis zwei Tropfen neben die Explantate pipettiert werden. Auf diese Weise werden die Explantate nicht angehoben, wenn das verbleibende vollständige Medium hinzugefügt wird.</li>
	<li>Legen Sie die Kammer wieder in den Inkubator und inkubieren Sie 2 Stunden lang, damit sich die Organe fest am Boden der Kammer anheften können.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und fügen Sie vorsichtig 300 μl frisches, vorgewärmtes komplettes Medium mit einer 100-μl- oder 200-μl-Pipette hinzu. Verwenden Sie keine 1-ml-Pipette. HINWEIS: Wenn eine Vorbehandlung gewünscht wird, fügen Sie nach 2 Stunden des Anbringens 300 μl des vollständigen Mediums hinzu, das die gewünschte Substanz enthält. Wenn eine 4-Well-Kammer verwendet wird, verwenden Sie bis zu 500 μl/Well.</li>
	<li>Legen Sie die Kammern wieder in den Inkubator zurück.</li>
</ol>5. Prüfung von ototoxischen Stoffen
<ol><li>Lassen Sie die Explantaten über Nacht stehen, um sich an die Kulturbedingungen anzupassen und sich zu erholen.</li>
	<li>Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen von ototoxischen Wirkstoffen vor, um die geeignete Konzentration zu finden, um ein ototoxisches Modell mit ca. 50% Haarzellverlust zu erstellen. Verwenden Sie zwischen 50 μM und 250 μM für Gentamicin und zwischen 40 μM und 320 μM für Cisplatin. Bereiten Sie die Cisplatin-Lösungen frisch vor und schützen Sie sie vor Licht.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und fügen Sie vorsichtig 300 μl des Mediums hinzu, das das gewünschte ototoxische Medikament enthält.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Explantate mit Gentamicin und Cisplatin bei 37 °C für 24 bis 48 Stunden, um das Überleben der Haarzellen zu bestimmen. HINWEIS: Die Wirkstoffkonzentrationen und die Expositionszeit werden je nach Zweck der Studie ausgewählt. Die Konservierung der Explantate wurde hier bis zu 72 h getestet. Verwenden Sie kein Serum, wenn Sie eine Langzeitkultur durchführen möchten.</li>
	<li>Befolgen Sie den nächsten Abschnitt, um die Cochlea-Zellen zu färben.</li>
</ol>6. Fixierung und Immunfluoreszenz
<ol><li>Verwerfen Sie das Medium am Ende des Experiments und waschen Sie die Explantate sofort mit 200 μl vorgewärmtem 1x PBS.</li>
	<li>Fixieren Sie die Explantate mit 200 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten unter einem chemischen Abzug. VORSICHT: PFA ist eine gefährliche Chemikalie; Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt (MSDS), bevor Sie zum ersten Mal mit PFA arbeiten.</li>
	<li>Waschen Sie die Explantate zweimal mit 200 μl 1x PBS. Lagern Sie die Explantate in 1x PBS bei 4 °C für den Fall, dass die Färbevorgänge verschoben werden müssen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Permeabilisierungslösung bestehend aus 1x PBS und 1%-5% Triton-X100 vor.</li>
	<li>Verwerfen Sie das 1x PBS, fügen Sie 200 μl Permeabilisierungslösung hinzu und inkubieren Sie die Explantate 15 Minuten lang.</li>
	<li>Bereiten Sie die Blockierungslösung vor.<ol><li>Für Organ-Corti-Explantate eine Blockierungslösung herstellen, die aus 1x PBS, 10% normalem Ziegenserum (NGS, für Ziegen-Sekundärantikörper, oder einem anderen Serum der gleichen Spezies wie die Sekundärantikörper) besteht. Alternativ können Sie 1%-5% Rinderserumalbumin (BSA) verwenden, wenn die Zellen nur mit Phalloidin gefärbt sind.</li>
		<li>Für Cochlea-Explantate ist eine Blockierungslösung aus 1x PBS, 10 % NGS und Fab-Fragment (Fab-Fragment Ziegen-Anti-Maus-IgG H+L, Verdünnung 1:200) herzustellen, wenn Maus-Primärantikörper (z. B. Maus-Anti-TuJ1) zur Färbung der Spiralganglienzellen verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie 200 μl Blockierungslösung hinzu und inkubieren Sie die Explantaten 1 Stunde lang.</li>
	<li>Verwerfen Sie die blockierende Lösung. Zu den Explantaten, die mit Fab-Fragment inkubiert wurden, fügen Sie 200 μl 4%ige PFA hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang.</li>
	<li>Waschen Sie die Explantate mit 1x PBS für 5 min.</li>
	<li>Stellen Sie eine Antikörperlösung her, die aus 1x PBS, 5% NGS und 0,1%-0,25% Triton-X100 besteht.</li>
	<li>Verdünnen Sie den primären Antikörper in der Antikörperlösung MYO7A (ab3481 in einer Verdünnung von 1:500 oder MYO7A 138-1 in 1:100), um die Haarzellen zu markieren, und TuJ1 (1:400), um die Spiralganglienneuronen zu markieren. HINWEIS: Wenn die Haarzellen nur mit Phalloidin markiert sind, verdünnen Sie das Phalloidin bei 1:150 in 1x PBS, inkubieren Sie 40 Minuten bis 1 Stunde bei Raumtemperatur und fahren Sie mit Schritt 6.22 fort.</li>
	<li>Fügen Sie eine Kontrolle für die unspezifische Bindung des Sekundärantikörpers hinzu, indem Sie den Primärantikörper weglassen.</li>
	<li>170 μl der Antikörperlösung mit dem Primärantikörper in die entsprechende Vertiefung geben und über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln (40-60 U/min) inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Explantate 4x für jeweils 5 min mit 1x PBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie den sekundären Antikörper in einer Antikörperlösung (z. B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 oder Ziegen-Anti-Maus-Alexa Fluor 568 IgG in einer Verdünnung von 1:500).</li>
	<li>170 μl der Antikörperlösung mit dem Sekundärantikörper zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. HINWEIS: Schützen Sie die Explantate ab diesem Schritt vor längerer Lichteinwirkung.</li>
	<li>Waschen Sie die Explantate 2x für jeweils 5 min mit 1x PBS.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem nächsten Schritt für die sequentielle doppelte Markierung der Explantate fort. Inkubieren Sie mit einem zweiten primären Antikörper von Interesse (z. B. MYO7A für Haarzellen) über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln (40-60 U/min). Alternativ wird mit Phalloidin (1:150) für 40 min bis 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und mit Schritt 6.22 fortgefahren. HINWEIS: Führen Sie eine sequenzielle Markierung durch, wenn die Primärantikörper von derselben Wirtsspezies stammen. Führen Sie am Ende eine Phalloidin-Markierung für die Multiplex-Immunfluoreszenz durch.</li>
	<li>Waschen Sie die Explantate 4x für jeweils 5 min mit 1x PBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie den sekundären Antikörper in einer Antikörperlösung (z. B. Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 oder Ziegen-Anti-Maus-Alexa Fluor 568 IgG in einer Verdünnung von 1:500).</li>
	<li>170 μl des sekundären Antikörpers zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Explantate 2x für jeweils 5 min mit 1x PBS.</li>
	<li>Bereiten Sie eine DAPI-Stammlösung von 1 mg/ml vor und lagern Sie sie bei −20 °C. Die DAPI-Stammlösung wird im Verhältnis 1:10 verdünnt, um Arbeitslösungen von 0,1 mg/ml herzustellen, und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Überspringen Sie Schritt 23 und fahren Sie mit Schritt 26 fort, wenn das DAPI-haltige Eindeckmedium verwendet wird.</li>
	<li>Verdünnen Sie die DAPI-Arbeitslösung 1:100 in 1x PBS und inkubieren Sie die Explantaten mit 200 μl DAPI-Lösung für 5 Minuten.</li>
	<li>Waschen Sie die Explantate 2x für jeweils 5 min mit 1x PBS.</li>
	<li>Entfernen Sie das 1x PBS so weit wie möglich, damit der Boden der Kammer trocknen kann. Lassen Sie das Explantat nicht trocknen.</li>
	<li>Warten Sie 2-5 s und geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium direkt auf das Explantat. HINWEIS: Das Eindeckmedium auf dem Explantat bleibt aufgrund der Oberflächenspannung an Ort und Stelle. Es kann ein härtendes Eindeckmedium verwendet werden.</li>
	<li>Lagern Sie die Kammern bis zur Bildgebung bei 4° C.</li>
</ol>7. Immunfluoreszenz von lebenden Zellen aus Explantaten
<ol><li>Verwenden Sie die isolierten Explantaten nach der Inkubation über Nacht.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und fügen Sie vorsichtig 300 μl Medium mit 125 μM Cisplatin hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Explantaten 18 Stunden lang, um das mitochondriale Superoxid in den lebenden Explantaten zu messen.</li>
	<li>Verwerfen Sie das Medium am Ende der Arzneimittelexposition.</li>
	<li>Fügen Sie 300 μl einer permeablen Sonde hinzu, um die zelluläre ROS (z. B. 250 nM Mito-Hydroethidin) und/oder Caspase-3 (z. B. 2 μM DEVD-Peptid, konjugiert mit einem Nukleinsäure-bindenden Farbstoff) nachzuweisen.</li>
	<li>Bei 37 °C 30 min inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Explantate zweimal vorsichtig mit 200 μl warmer Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) oder einem geeigneten Puffer.</li>
	<li>Bilden Sie die Zellen innerhalb von 2 Stunden mit Fluoreszenzanregung bei 400 nm und Emissionsdetektion bei 590 nm ab.</li>
	<li>Verwerfen Sie das Medium am Ende des Experiments und waschen Sie die Explantate sofort mit 200 μl vorgewärmtem 1x PBS.</li>
	<li>Fixieren Sie die Explantate und färben Sie die Cochlea-Zellen wie oben beschrieben.</li>
</ol>8. Visualisierung durch konfokale Bildgebung
<ol><li>Die Explantaten werden mit einem Mikroskop abgebildet, das mit einer konfokalen Spinning-Disk-Einheit ausgestattet ist, oder mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer konfokalen Punkt-Scanning-Einheit ausgestattet ist.</li>
	<li>Erfassen Sie die Bilder mit einer rotierenden Scheibe mit einem 20-fachen Luftobjektiv (numerische Apertur: 0,75) zur Zellzählung. Alternativ können Sie die Bilder mit einem konfokalen Punkt-Scanning-Mikroskop mit einem 40-fachen Luftobjektiv (numerische Apertur: 0,95) oder einem 100-fachen Ölobjektiv (numerische Apertur: 1,45) aufnehmen, um die Synapsen zu visualisieren und zu zählen oder die Stereozilien abzubilden. HINWEIS: Passen Sie die Laserintensität und die Belichtungszeit für jeden Kanal an, um eine Über- und Untersättigung der Bilder zu vermeiden. Wenden Sie die gleichen Einstellungen auf alle Explantaten desselben Experiments an.</li>
	<li>Richten Sie das Mikroskop so ein, dass es mit einem 20-fachen Luftobjektiv, einem Z-Stapel und automatischen Stitching-Werkzeugen ein 3D-Bild der gesamten Cochlea-Explantation aufnimmt. Verwenden Sie 3 x 3 benachbarte Felder mit 15 % Überlappung für Maus-Explantaten und 4 x 4 benachbarte Felder für Ratten-Explantate, die zusammengefügt werden sollen.</li>
	<li>Passen Sie die Bilder mit der Software des Mikroskops oder der kostenlosen Open-Source-Software FIJI8 an. HINWEIS: Dekonvolution, eine Bildverarbeitungstechnik, kann auf konfokale Bilder angewendet werden, um den Kontrast und die Auflösungvon 9-11 zu schärfen.</li>
</ol>

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<li>Ershov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate+7%3A+Integrating+state-of-the-art+segmentation+algorithms+into+tracking+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines.</a> Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+A+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+mammalian+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+of+Science+B%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of mammalian inner ear hair cells.</a> Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Der Zweck der Aktualisierung dieses Protokolls bestand darin, die Schritte von der Isolierung der Explantate bis zur Bildgebung der lebenden und fixierten Cochlea-Zellen zu rationalisieren. Wir haben einige Schritte während der Isolierung verbessert und einige innovative Werkzeuge eingeführt, mit dem Ziel, ein effizientes und reibungslos funktionierendes Protokoll zu etablieren, um qualitativ hochwertige Explantaten zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren handelt es sich um ein optimiertes Protokoll aus früheren Berichten 4,5. Darüber hinaus fehlt in einigen aktuellen Studien ein schrittweise aktualisiertes Protokoll. Mit vereinfachten Explantatkulturschritten bietet dieses Protokoll die einfache Handhabung gut erhaltener Explantate, was für reproduzierbare Daten unerlässlich ist. Die Einführung von Multi-Well-Kammern mit einem Polymer-Deckglas für Innenohr-Explantaten verbessert die Organbefestigung und die Erhaltung intakter Explantate. Hier stellen wir einige Beispiele von Experimenten unter Stressbedingungen vor, um zu zeigen, dass die Organe in Kultur ihre zelluläre Organisation trotz des Verlustes von Haarzellen und der Schädigung der Neuriten beibehalten.
Eine der Herausforderungen bei der Kultivierung von Innenohrorganen besteht darin, die Ablösung und das Aufschwimmen der Organe zu vermeiden, da dies die Integrität der Explantate, das Ansprechen auf die Behandlung und die nachfolgenden Untersuchungen beeinträchtigt. Zuvor wurden Explantaten auf Glasdeckgläsern 4,5 kultiviert. Obwohl die Kultur auf Glasoberflächen eine gute Alternative zu sein scheint, ist die Beschichtung des Glases zeitaufwändig, und die Deckgläser selbst sind zerbrechlich und empfindlich. Ein alternatives Protokoll mit Millicell-Zellkultur-Inserts versucht, dieses Problem zu lösen6. Das Schneiden und Übertragen der Membran mit den Explantaten scheint jedoch ein heikler Schritt in diesem Protokoll zu sein. Darüber hinaus können die Explantate während der Montage und Versiegelung des Deckglases beschädigt werden. In unserem vorgeschlagenen Ansatz ist nach dem Transfer der Explantaten in die mit Poly-D-Lysin beschichteten Kammern und der richtigen Position kein weiterer Transfer oder Abdecken mit Deckgläsern erforderlich. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Kammern mit einem dünnen, gasdurchlässigen Polymer-Deckglas, das optimale Kulturbedingungen für die Organexplantate bietet. Dieses Polymer hat eine glasähnliche optische Qualität und eignet sich daher für die Zellbildgebung in der hochauflösenden Mikroskopie.
Die Zugabe von Serum zum Medium wird in den meisten Protokollen für Zell- und Gewebekulturen verwendet, einschließlich der Kultur von Innenohrexplantaten mit 1%-10% FBS 4,5,6,16. Das Vorhandensein von Serum beeinflusst die Kulturbedingungen der Experimente; Daher wird in bestimmten Situationen die Kultur ohne Serum bevorzugt. Das Fehlen von Serum in der Kultur der Cochlea-Explantate wurde entweder durch die Zugabe von N2 zu DMEM oder durch die Zugabe von N2 zu Neurobasal-A-Medium 5,6 ersetzt. In diesem Zusammenhang haben wir die Kulturbedingungen der Explantate mit und ohne Serum getestet. Unter beiden Bedingungen waren die Innenohrzellen vital und reagierten auf ototoxische Bedingungen. Wir haben diese Bedingungen 72 Stunden lang getestet, aber die Explantate können noch länger in Kultur gehalten werden, insbesondere wenn sie mit serumfreiem Medium zusammen mit N2, B27 und Wachstumsfaktoren inkubiert werden, wie in anderen Studien vorgeschlagen 5,16.
Neben den allgemeinen kritischen Schritten bei der Isolierung von Innenohrexplantaten, wie z.B. der Dauer der Organisolierung und des verwendeten Antibiotikums, gibt es auch einige kritische Schritte in diesem Protokoll, die jedoch überschaubar sind. Einer der kritischen Schritte bei dieser Methode bezieht sich auf das Volumen des Mediums, das nach dem Einsetzen des Organs in der Kammer verbleibt. Dies wurde optimiert, um die Explantaten am Leben zu erhalten und an der Unterseite zu befestigen. Ein weiterer kritischer Schritt bezieht sich auf die Inkubationszeit, die erforderlich ist, damit sich die Explantaten am Boden der Kammer anheften können. Inkubationszeiten von mehr als 2 h mit wenigen Mikrolitern Medium können die Gesundheit der Explantate beeinträchtigen. Kürzere Inkubationszeiten, wie z.B. 1 h, können ebenfalls verwendet werden, solange darauf geachtet wird, dass sich die Explantaten nicht ablösen. Ein weiterer wichtiger Aspekt sind die Rückstände von Poly-D-Lysin. Die Waschschritte von Poly-D-Lysin sollten strikt eingehalten werden, da Rückstände des Bromidsalzes von Poly-D-Lysin für die Zellen giftig sein können. Nachdem die Waschschritte genau befolgt wurden, erleichtert die Beschichtung mit Poly-D-Lysin die reibungslose Haftung der Explantate an den Kammern, so dass die Position korrigiert werden kann, bevor sie fest am Boden der Kammer haften.
Eine der Einschränkungen dieser Methode ist die Abbildung von Zellen mit aufrechter Mikroskopie. Dies könnte ein wichtiges Thema für Labore mit inversen Mikroskopen sein. Objektträger mit herausnehmbaren Silikonkammern können für die aufrechte und inverse Mikroskopie verwendet werden; Unsere Beschichtungsbedingungen mit Poly-D-Lysin müssen jedoch zuerst getestet werden. Eine weitere Einschränkung ist die Lagerung der Kammern, da die Einsätze nicht herausnehmbar sind und die Gesamthöhe einer Kammer mit Deckel fast 11 mm beträgt, verglichen mit der Höhe von 1 mm eines Standard-Objektträgers. Die 8-Well-Kammer benötigt jedoch weniger Platz als die 4-Well-Platten, die vor16 vorgeschlagen wurden.
Wir präsentieren hier Bilder, die mit zwei Mikroskopen aufgenommen wurden. Während das konfokale Punkt-Scanning-Mikroskop aufgrund seines dünnen optischen Querschnitts hochauflösende Bilder von Geweben liefert, bietet das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop eine schnellere Abbildungszeit bei guter Auflösung. Die Stereozilien der inneren Haarzellen (IHCs) und der äußeren Haarzellen (OHCs) werden mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. Da die Stereozilien von IHCs größer sind als die von OHCs, wurden sie in dieser Arbeit wiederholt und gut visualisiert. Bei OHC-Stereozilien können andere alternative Mikroskope die Visualisierung verbessern, wie z. B. die Super-Resolution-Mikroskopie (SRM). Die mit dem Spinning-Disk-Mikroskop aufgenommenen Explantatbilder sind ausreichend für die einfache Integration der automatisierten Haarzellzählung unter Verwendung eines Deep-Learning-Ansatzes12. Darüber hinaus ist die kurze Aufnahmezeit wichtig für Experimente mit lebenden Zellen und Geweben. Darüber hinaus ist dieses Protokoll nicht auf neonatale Cochlea-Explantate beschränkt. Mit einigen Optimierungen können auch andere Explantaten wie vestibuläre Organe oder embryonales Gewebe kultiviert werden.
Die Quantifizierung von Cochlea-Zellen, wie Haarzellen und Neuronen, in vitro ist wichtig für die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und damit des Prozentsatzes der beschädigten oder verlorenen Zellen. Untersuchungen von Signalwegen und Zellfunktionen helfen, die Mechanismen von Tod und Überleben aufzudecken. Untersuchungen von embryonalem und neonatalem Cochlea-Gewebe sind nützlich, um die Entwicklungsstadien der Cochlea zu untersuchen. Daher wird dieses Protokoll dazu beitragen, In-vitro-Studien von Innenohr-Explantaten zu optimieren, z. B. um ototoxische Modelle zu erstellen, Entwicklungsstadien zu untersuchen, Signalwege zu bewerten und Wirkstoff-Screening-Studien durchzuführen.

Die meisten Fälle von Schallempfindungsschwerhörigkeit sind auf die Degeneration von sensorischen Haarzellen, Hörnervenzellen und/oder Hörsynapsen zurückzuführen1. Dieser degenerative Prozess in den Sinneszellen ist fortschreitend und in der Regel irreversibel, was zu einem Hörverlust führt2. Daher sind Informationen über die Lebensfähigkeit von Sinneszellen und Veränderungen der Signalwege unter Stressbedingungen von entscheidender Bedeutung, um die Zellen vor Schäden und damit vor Verlust zu schützen. Die Untersuchung von Cochlea-Explantaten in Kultur ermöglicht die Rekapitulation des Gewebekomplexes und die Aufrechterhaltung eines normalen Zell-Zell-Netzwerks, was eine bessere Beschreibung der Signalprozesse ermöglicht. Um experimentelle Modelle der Ototoxizität zu etablieren, wurden häufig das Antibiotikum Gentamicin und das Chemotherapeutikum Cisplatin verwendet, da von ihnen ototoxische Nebenwirkungen bekannt sind3.
In-vitro-Kultursysteme von Cochlea-Explantaten wurden im Laufe der Zeit entwickelt und modifiziert. Eine Beschreibung des schrittweisen Protokolls für die Kultivierung ganzer Cochlea-Explantate fehlt jedoch häufig in mehreren Publikationen. Eines der ersten Videoprotokolle für die Primärkultur des murinen Organs von Corti wurde von Parker et al. veröffentlicht, in dem die Autoren die Schritte zur Isolierung des sensorischen Epithels, zur Kultivierung auf Glasdeckgläsern und zur Elektroporation von Explantaten für Transfektionsexperimente beschrieben4. Zuvor wurde auch ein weiteres Protokoll mit Deckgläsern aus Glas veröffentlicht, in dem die Organisation der Zellstruktur im Innenohr berücksichtigt wurde5. Es wurde über ein alternatives Protokoll mit Millicell-Membran für die Kultur von Mausexplantaten des Corti-Organs und des vestibulären Organs berichtet6. Diese Videoberichte haben zur Verbesserung der Methode beigetragen, aber es gibt immer noch Herausforderungen, die gelöst werden müssen. Um eine Reihe von Problemen zu lösen, die sich aus der Verwendung von Deckgläsern und Einsätzen aus Glas ergeben, zielt das vorliegende Protokoll darauf ab, die Organkulturschritte zu rationalisieren und qualitativ hochwertige Organe zu kultivieren, um zuverlässige Daten zu erhalten. Dies wird erreicht, indem die direkte Handhabung des Organs während der experimentellen Verfahren minimiert und der Organtransfer vermieden wird, bevor hochauflösende Bilder der lebenden und fixierten Zellen erhalten werden.
Das vorliegende Protokoll aktualisiert bereits veröffentlichte In-vitro-Kultursysteme und führt mehrere Optimierungen bei der Isolierung des Corti-Organs und dem Transfer in die Kulturkammern sowie die Integration einer neuen Objektträgerkammer ein, um die Kulturbedingungen und die weitere Analyse zu verbessern. Dieses optimierte Protokoll reduziert das Risiko einer Beschädigung des Organs, die bei der Verwendung von Deckgläsern während des Medienwechsels oder während der Übertragung des Organs aus Deckgläsern oder Membranen zur weiteren Analyse auftreten kann 4,5,6. Die Deckgläser aus Glas haben einen besseren Reflexionsindex als die aus Kunststoff; Sie sind jedoch zerbrechlich und können leichter brechen. Die hier verwendeten Multiwell-Kammern sind auf einem Objektträger befestigt, die sich gut für die Organkultur und für die hochauflösende Bildgebung eignen. Der Transfer der isolierten Organe erfolgt mit einem Spatel, der es ermöglicht, das Organ in die richtige Ausrichtung zu bringen und in die Kammer zu schieben, anstatt wie zuvor empfohlen mit einer Pipette Kraft auszuüben 4,5,6.
Die Poly-D-Lysin-beschichteten Multi-Well-Kammern, die ausreichend Medium enthalten sollten, erleichtern den Organtransfer und die korrekte Positionierung der Explantate ohne Adhäsionsdruck und unter Vermeidung von Organüberlappungen, wie bereits erwähnt6. Darüber hinaus werden zufällige Organüberlappungen und ungleichmäßige Strukturen mit einem konfokalen Z-Stapel aufgelöst. Dieses Protokoll wurde für verschiedene Anwendungen optimiert, wie z. B. Explantate von Mäusen und Ratten, Explantaten des Corti- und Cochlea-Organs, Kultur in serumhaltigem und serumfreiem Medium, ototoxische Bewertungen und allgemeine Arzneimittelansprechexperimente. Die Cochlea-Explantaten werden in Kammern mit einem Deckglasboden montiert und inkubiert, was die Haftung der Cochlea-Explantate an den Kammern erleichtert, um eine optimale Handhabung während der In-vitro-Experimente , die Nachbearbeitung der Explantate und die Abbildung von lebenden und fixierten Cochlea-Explantaten zu ermöglichen. Die Visualisierung der gesamten Länge des Corti-Organs und die Quantifizierung der Haarzellen werden optimiert. Darüber hinaus sind die Beurteilungen der Stützzellen, Spiralganglien-Neuronenzellen und Neuriten genau. Daher kann dieses Protokoll für eine umfassende Analyse von Cochlea-Zellen von Säugetieren verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>15 mL konisches Röhrchen aus hochklarem Polypropylen 17 x 120 mm FALCON</td><td></td><td>352096</td> 45°<td></td></tr><tr><td>; Abgewinkelte Pinzetten&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konisches Polypropylen-Röhrchen 30 x 115 mm</td><td>Ausführung FALCON</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Antifading-Eindeckmedium</td><td>VECTASHIELD</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Thermofisher</td><td>2151755</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Beta-III-Tubulin-Antikörper [TUJ-1]</td><td>Abcam</td><td>ab14545</td><td></td></tr><tr><td>Antifade-Eindeckmedium mit DAPI</td><td>VECTASHIELD</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myosin VII Kaninchen polyklonal</td><td>Abcam</td><td>ab3481</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung (50x), abzüglich Antioxidantien</td><td>Thermofisher</td><td>10889038</td><td></td></tr><tr><td>CARBON STEEL chirurgische Klingen 23</td><td>Swann Moiton</td><td>210</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent&etage; Caspase-3/7 Grünes Detektionsreagenz</td><td>Thermofisher</td><td>C10723</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX</td><td>Thermofisher</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Doppelspatel, ein gebogenes Ende</td><td>VWR</td><td>RSGA038.150</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol 70% V/V 1.000 mL</td><td>Bichsel</td><td>160 0 106 00</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert</td><td></td><td>Thermofisher 16000036</td><td></td></tr><tr><td>Fixierlösung 4% Paraformaldehyd, hergestellt in PBS</td><td>Thermofisher</td><td>201255309/201255305</td><td></td></tr><tr><td>Kalthalogen-Lichtquelle mit hoher Intensität&nbsp;</td><td>Intralux&reg; &nbsp;</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional Version 21.10</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Slide 8 well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>LEICA</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>LEICA</td><td>MS5</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX&trade; Roter mitochondrialer Superoxid-Indikator, für die Bildgebung lebender Zellen</td><td>Thermofisher</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung (100x)</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Mikroskop mit einer konfokalen Einheit Yokogawa CSU-W1 Spinning Disk und einer Photometrics Prime 95B Kamera.</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Mikroskop mit konfokaler A1-Punktabtasteinheit</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operationsschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14005-16</td><td></td></tr><tr><td>Operationsschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Operationspinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-15</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 (1x), 500mL</td><td>Thermofisher</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>POLY-D-LYSIN HYDROBROMIDE MOL WT GT 30</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7405</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250 Zweiter Sterilisator</td><td>Simon Keller AG</td><td>&nbsp; 031100</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisator, Trockenmittelpellets</td><td>Simon Keller AG</td><td>31120</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale 60 x 15 mm</td><td>FALCON</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale 60 x 15 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Trito&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Unkonventionelle Myosin-VIIa-Entwicklungsstudien</td><td>Hybridom Bank</td><td>138-1s</td><td></td></tr><tr><td>WFI für Zellkultur[-]Antimikrobiell, 500 mL</td><td>Thermofisher</td><td>A12873-01</td><td></td></tr></tbody></table>

ganze neonatale cochlea-explantate als in-vitro-modell

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Unbehandelter Hörverlust verursacht erhebliche Kosten für das globale Gesundheitssystem und beeinträchtigt die Lebensqualität des Einzelnen. Die Schallempfindungsschwerhörigkeit ist gekennzeichnet durch den kumulativen und irreversiblen Verlust von sensorischen Haarzellen und Hörnerven in der Cochlea. Vollständige und vitale Cochlea-Explantaten sind eines der grundlegenden Werkzeuge in der Hörforschung, um Haarzellverlust zu erkennen und die molekularen Mechanismen der Innenohrzellen zu charakterisieren. Vor vielen Jahren wurde ein Protokoll für die Cochlea-Isolierung von Neugeborenen entwickelt, das zwar im Laufe der Zeit modifiziert wurde, aber immer noch Verbesserungspotenzial birgt. 
In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Kultivierung ganzer neonataler Cochlea-Explantate in Multi-Well-Kulturkammern vorgestellt, das die Untersuchung von Haarzellen und Spiralganglien-Neuronenzellen entlang der gesamten Länge der Cochlea ermöglicht. Das Protokoll wurde mit Cochlea-Explantaten von Mäusen und Ratten getestet. Gesunde Cochlea-Explantaten wurden gewonnen, um die Interaktion zwischen Haarzellen, Spiralganglien-Neuronenzellen und den umgebenden Stützzellen zu untersuchen. 
Einer der Hauptvorteile dieser Methode besteht darin, dass sie die Organkulturschritte vereinfacht, ohne die Qualität der Explantaten zu beeinträchtigen. Alle drei Windungen des Corti-Organs sind am Boden der Kammer befestigt, was In-vitro-Experimente und die umfassende Analyse der Explantaten erleichtert. Wir stellen einige Beispiele für Cochlea-Bilder aus verschiedenen Experimenten mit lebenden und fixierten Explantaten zur Verfügung, die zeigen, dass die Explantate ihre Struktur trotz Exposition gegenüber ototoxischen Medikamenten beibehalten. Dieses optimierte Protokoll kann für die integrative Analyse der Cochlea von Säugetieren eingesetzt werden.

Das vorliegende Protokoll wurde an der Cochlea von neugeborenen Mäusen und Ratten getestet. In dieser Arbeit werden Bilder von Explantaten aus verschiedenen Experimenten vorgestellt. Die Explantaten des Corti-Organs wurden Gentamicin oder Cisplatin ausgesetzt, und der Verlust der Haarzellen war sichtbar. Die Explantate des Corti-Organs behielten ihre Struktur und Gesamtlänge sowohl unter Normal- als auch unter Stressbedingungen bei (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die überlebenden Haarzellen entlang der gesamten Länge der Rattenexplantate, die zuvor Cisplatin ausgesetzt waren, waren einzeln nachweisbar (Abbildung 1). Neben dem Nachweis überlebender Haarzellen wurden auch Haarzellen in Apoptose nachgewiesen (Abbildung 2). Dieser Ansatz erleichtert die Visualisierung und Zählung überlebender Zellen, die mit einem Deep-Learning-Ansatz durchgeführt werden kann, wie zuvor12 beschrieben. Auch in lebenden Cochlea-Zellen konnten die biologischen Prozesse mit entsprechenden zellpermeablen Sonden nachgewiesen werden (Abbildung 3).
Bei Cochlea-Explantaten mit Spiralganglien-Neuronen können die Explantate in zwei Teile geschnitten oder die Apexregion weggeschnitten werden, um bessere Kulturbedingungen zu schaffen. Hier haben wir uns dafür entschieden, den Scheitelbereich zu trennen, da er unter Stressbedingungen weniger betroffen ist. Abbildung 4 zeigt die Basis- und medialen Regionen der Cochlea-Explantate. Es wurden Haarzellen nachgewiesen, die mit dem Haarzellmarker MYO7A markiert waren. In ähnlicher Weise wurden gesunde und beschädigte Spiralganglienzellkörper und Neuriten identifiziert, die mit dem neuronalen Marker TuJ1 markiert waren. Die Analyse von Spiralganglienregionen kann manuell oder mit Open-Source-Software wie FIJI mit dem NeuronJ-Plugin für die Neuritenverfolgung13 oder Erweiterungen wie TrackMate und Cellpose für die morphologische Segmentierung 14,15 durchgeführt werden. Die genauere Untersuchung der Mausexplantate zeigte die hohe Auflösung der Cochlea-Zellen und der Haarzell-Stereozilien (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig01.jpg"> Abbildung 1: Explantate des Corti-Organs von Ratten, die Gentamicin ausgesetzt waren. Repräsentative Bilder (Projektion mit maximaler Intensität) von (A) Kontroll- und (B) Gentamicin-exponierten (200 μM für 24 h) Explantaten. Die Haarzellen sind mit Phalloidin markiert und können über die gesamte Länge der Cochlea sichtbar gemacht werden. Zur besseren Veranschaulichung ist das Bild in Grautönen gehalten. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv (numerische Apertur: 0,75) aufgenommen. Maßstabsleiste = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig02.jpg"> Abbildung 2: Explantate des Corti-Organs von Mäusen, die Cisplatin ausgesetzt waren. Repräsentative Bilder (Projektion mit maximaler Intensität) von (A) Kontroll- und (B) Cisplatin-exponierten (160 μM für 48 h) Explantaten. Die Haarzellen sind mit Phalloidin (rot) und die apoptotischen Haarzellen mit Fluorescin markiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Punkt-Scanning-Mikroskop und einem 20-fach-Objektiv (numerische Apertur: 0,75) aufgenommen. Maßstabsleiste = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig03.jpg"> Abbildung 3: Explantate des Corti-Organs aus Live-Imaging-Experimenten. Repräsentative Bilder (Maximum-Intensitäts-Projektion) von Explantaten von Wildtyp-Mäusen, die (A) Kontroll-Explantaten und (B) Explantate mit Exposition bei 125 μM Cisplatin für 18 h zeigen. Die Haarzellen sind mit Mitohydroethidin und Caspase-3 markiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop und einem 20-fach-Objektiv (numerische Apertur: 0,75) aufgenommen. Maßstabsleiste = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig04.jpg"> Abbildung 4: Cochlea-Explantate von STAT1-Knockout-Mäusen, die Cisplatin ausgesetzt waren. Repräsentative Bilder (Projektion mit maximaler Intensität) von (A) Kontroll-Explantaten und (D) Explantaten, die 48 h lang mit 40 μM Cisplatin exponiert wurden. Die Haarzellkörper sind mit dem Antikörper MYO7A (grün) und die Spiralganglienzellen mit dem Antikörper TuJ1 (rot) und der Kernmarkierung DAPI (blau) markiert. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Punkt-Scanning-Mikroskop und einem 20-fachen Objektiv (numerische Apertur: 0,75) mit zusätzlichem 2,15-fach-Zoom (B,C,E,F) aufgenommen. Maßstabsleiste = (B,C,E,F) 50 μm und (A,D) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig05.jpg"> Abbildung 5: Mausorgan der Corti-Explantate. (A-D) Repräsentative Bilder (Maximum-Intensitätsprojektion) von Ganzkörper-Explantaten von Wildtyp-Mäusen. (A,B) Die Explantate wurden mit dem MYO7A-Antikörper, Phalloidin und der Kernmarkierung DAPI markiert. (B) In der vergrößerten Übersicht sind die Zellkörper der mit MYO7A-Antikörper markierten Haarzellen (grün) deutlich zu erkennen. (C,D) Phalloidin markiert die Stereozilien und die Kutikularplatte der Haarzellen. Die Explantate wurden mit Phalloidin markiert. (D) In der vergrößerten Übersicht sind dekonvolutierte Bilder einzelner innerer Haarzell-Stereozilien gut zu erkennen (untere Reihe), während einzelne äußere Haarzell-Stereozilien schwieriger abzugrenzen sind (obere Reihe). Die Bilder in den Panels A und C wurden mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv (numerische Apertur: 0,75) aufgenommen. Das Bild in Panel B wurde mit dem gleichen Mikroskop, aber mit einem 40-fachen Luftobjektiv (numerische Apertur: 0,95) aufgenommen. Das Bild in Tafel D wurde mit einem konfokalen Punktmikroskop und einem 100-fachen Ölobjektiv (numerische Apertur: 1,45) mit zusätzlichem 3,46-fach-Zoom aufgenommen. Die Scans wurden viermal pro XY-Schnitt gemittelt, und die Pixelgröße betrug 0,02 μm. Maßstabsbalken = (D) 3 μm, (B) 100 μm und (A,C) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Das aktuelle Protokoll aktualisiert frühere Protokolle und enthält relativ einfache Ansätze für die Kultivierung hochwertiger Cochlea-Explantate. Dies ermöglicht eine zuverlässige Datenerfassung und hochauflösende Bildgebung in lebenden und fixierten Zellen. Dieses Protokoll unterstützt den anhaltenden Trend zur Untersuchung von Innenohrzellen.

Ganze neonatale Cochlea-Explantate als In-vitro-Modell

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Dieses Protokoll beinhaltet einen unkomplizierten Ansatz zur Optimierung von Kulturschritten, zur Gewinnung hochwertiger Explantaten und wird zur Erforschung und Enthüllung molekularer Mechanismen von Cochlea-Zellen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die minimale direkte Organhandhabung durch die Koordination der Dissektionsschritte, die geeignete Polymeroberflächenbeschichtung, das optimierte mittlere Volumen und die Anheftungszeit der Explantate. Diese Technik stellt einen beliebten In-vitro-Ansatz zur Untersuchung von Schallempfindungsschwerhörigkeit dar.Dies kann verwendet werden, um ototoxische Modelle zu erstellen, Strukturanalysen durchzuführen, Signalwege zu bewerten und Wirkstoff-Screening-Studien durchzuführen. Prinzipiell kann diese Methode auf verschiedene Gewebeexplantate angewendet werden. Es kann auch in der Innenohrforschung eingesetzt werden, um Einblicke in embryonale Entwicklungsstadien zu erhalten.Zu Beginn legst du den Kopf der geköpften Ratte auf das sterile Pad. Verwende Schere und Pinzette, um den Unterkiefer zu entfernen, dann hebe die Haut an und ziehe sie vom Schädel ab. Platzieren Sie die Pinzette in den Augenhöhlen, um den Schädel zu halten.Mit einer scharfen Skalpellklinge den Schädel vorsichtig entlang der sagittalen Naht und dann im koronalen Nahtbereich durchtrennen, ohne die Cochlea zu beschädigen. Entferne nun das Gehirn aus den beiden Schädelhälften. Lokalisieren Sie unter dem Mikroskop die Cochlea im Schläfenbein und lockern Sie das umliegende Gewebe zwischen Cochlea und Schläfenbein.Legen Sie dann die Pinzette in den oberen Bogengang. Ziehen Sie das Schläfenbein vorsichtig von der Cochlea weg und halten Sie die Cochlea mit dem Schläfenbein am Vestibulum befestigt. Führen Sie die Pinzettenspitzen in den Apexbereich ein, der als weiße Linie sichtbar ist, und entfernen Sie die knorpelige Cochlea-Kapsel Stück für Stück, um den Cochlea-Gang freizulegen.Setzen Sie die Pinzette unter die Cochlea und lösen Sie sie vom Gleichgewichtsorgan und dem Schläfenbein. Übertragen Sie die Cochlea in eine neue 60-Millimeter-Schale mit eiskaltem PBS. Um Corti-Explantationsorgane zu isolieren, halten Sie das Organ an der Basis und den Ductus cochlearis im Bereich des Basalhakens fest und wickeln Sie den Ductus cochlearis vorsichtig vom Modiolus ab, ohne ihn zu zerreißen.Halten Sie dann den Ductus cochlearis an der Basis fest und ziehen Sie das Spiralband und die Stria vascularis weg. Um Cochlea-Explantaten zu isolieren, verwenden Sie eine Pinzette, um das Spiralganglion von der knöchernen Spirallamina zu lösen, und wickeln Sie das Modiolus während der Ablösung ab. Fassen Sie mit einer Pinzette die Hakenregion und entfernen Sie das Spiralband mit der Stria vascularis.Ziehen Sie außerdem Reissners Membran Stück für Stück ab. Um die Cochlea-Explantate zu übertragen, tauchen Sie einen Laborspatel in die Schale mit dem Explantat. Heben Sie das Explantat mit den Haarzellen nach oben zusammen mit ein paar Mikrolitern PBS an, indem Sie mit einem Spatel winken.Legen Sie das Explantat in einen Objektträger mit acht Vertiefungen, indem Sie den Spatel vorsichtig im Medium schwenken. Lassen Sie das Explantat in die Kammer gleiten. Entfernen Sie mit einer 100-Mikroliter-Pipette 80 Mikroliter Medium und entsorgen Sie es.Überprüfen Sie die Sichtbarkeit von Haarzellen und Spiralganglien-Neuronenzellen unter dem Mikroskop. Verwenden Sie bei Bedarf eine Pinzette, um überlappendes Gewebe auseinander zu drücken. Entnehmen Sie das verbleibende Medium aus der Vertiefung.Das Explantat liegt nun flacher auf der Oberfläche der Kammer. Nach 10 Sekunden pipettieren Sie ein oder zwei Tropfen des Mediums direkt neben dem Explantat und das verbleibende Medium in einiger Entfernung zurück, um eine Ablösung des Explantats zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass sich die Explantate während der Zugabe des Mediums nicht bewegen.Inkubieren Sie die Kammer zwei Stunden lang, um die Organe fest am Boden der Kammer zu befestigen. Nach der Inkubation wird das Medium abgesaugt. Geben Sie mit einer 100- oder 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig 300 Mikroliter frisches, vorgewärmtes Komplettmedium hinzu.Die konfokalen mikroskopischen Aufnahmen der rotierenden Scheibe zeigten, dass die Corti-Explantate des Rattenorgans ihre Struktur und Gesamtlänge sowohl unter normalen als auch unter Stressbedingungen beibehielten. Darüber hinaus zeigte ein konfokales Rastermikroskop überlebende Haarzellen von Explantaten aus den Organen der Mäuse sowie Haarzellen, die Apoptose durchlaufen. Das Protokoll ermöglichte die Überwachung biologischer Prozessoren in lebenden Cochlea-Zellen mit geeigneten zellpermeablen Sonden und einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop.Die Kultur dieser Cochlea-Explantate verbessert die Analyse der Interaktion zwischen Haarzellen und Spiralganglienzellen. Die Haarzellen von Cochlea-Implantaten wurden mit dem Haarzellmarker MYO7A nachgewiesen. In ähnlicher Weise wurden gesunde und beschädigte Spiralganglienzellkörper und Neuriten mit dem neuronalen Marker Tuj 1 identifiziert.In der vergrößerten Übersicht waren die Zellkörper der mit dem MYO7A-Antikörper markierten Haarzellen sichtbar. Es wurden Stereozilien der äußeren Haarzellen und dekonvolutierte Bilder einzelner Stereozilien der inneren Haarzellen identifiziert, die mit Phalloidin markiert waren. Bei den Eingriffen unter dem Mikroskop ist Vorsicht geboten, insbesondere bei der Trennung des Spiralganglions von der knöchernen Spirallamina.Die intakten Explantaten sollten vorsichtig übertragen und ausgerichtet werden. Dieses Protokoll optimierte In-vitro-Studien an Innenohr-Explantaten. Die Ergebnisse dieser Studien, wie z. B. Signalwege und Arzneimitteltoxizität, können das Design weiterer In-vivo-Studien leiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

Dieses Video zeigt den Prozess der Isolierung von Spiralganglien-Explantaten aus dem Innenohr und deren Co-Kultivierung mit dem Corti-Organ auf einem Multielektroden-Array. Spiralganglien werden sorgfältig entnommen und in kleinere Gewebeschnitte oder Explantate geschnitten. Diese Explantate werden auf der aktiven Fläche des Multielektrodenarrays kultiviert, um das Wachstum des neuronalen Prozesses zu fördern.

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Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das...

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

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Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

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