Name: Osmotische Minipump-Implantation zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Lernen Sie die stereotaxische Implantation osmotischer Minipumpen zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor cerebrospinalis von Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Funktionen.

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National Institutes of Health gewähren DK124619 an KHC.
Anschubfinanzierung und Pilotforschungspreis, Department of Medicine, University of Rochester, NY, an KHC.
Der Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, University of Rochester, an KHC.
Forschungspreis der Universität, Büro des Vizepräsidenten für Forschung, Universität Rochester, NY, an KHC.
MUR entwarf und führte die Methode durch, analysierte die Ergebnisse, erstellte Grafiken und Abbildungen und schrieb und redigierte das Manuskript. KHC konzipierte und betreute die Studie, analysierte die Ergebnisse und schrieb und redigierte das Manuskript. KHC ist der Garant für diese Arbeit. Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung des Manuskripts zu.

Alle Mausverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Rochester genehmigt und gemäß den Richtlinien des US Public Health Service für die humane Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Sechs Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse, die für diese Studie verwendet wurden, wurden kommerziell beschafft. Alle Tiere wurden in Gruppen (5 Mäuse pro Käfig) in einem Raum mit einem 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklus untergebracht und erhielten ad libitum Zugang zu Futter und Wasser. Nachdem den Mäusen eine Kanüle zur Infusion von Glukose in den Seitenventrikel implantiert worden war, wurden sie einzeln untergebracht, um Schäden an den Implantaten durch andere Mäuse zu vermeiden.
1. Montage osmotischer Minipumpen
<ol><li>Bereiten Sie künstlichen Liquor cerebrospinalis (aCSF) gemäß dem folgenden Protokoll vor. NaCl (8,66 g), KCl (0,224 g),CaCl 2,2H2O (0,206 g) und MgCl2,6H2O (0,163 g) werden in 500 ml sterilem Wasser gelöst, um Lösung A herzustellen. Na2HPO 4,7H2O (0,214 g) und NaH2PO 4 lösen. H2O(0,027 g) in 500 ml sterilem Wasser zur Herstellung von Lösung B. Mischen Sie dann Lösung A und B im Verhältnis 1:1, um den aCSF herzustellen. HINWEIS: Diese Formulierung von aCSF enthält keine Glukose.</li>
	<li>Zur Herstellung der 50%igen Glukoselösung 50 g Glukose zu 50 ml Liquor in ein Becherglas geben. Stellen Sie das Becherglas auf eine Kochplatte und bringen Sie die Temperatur der Suspension auf 60 °C. Mischen Sie die Suspension mit einem Magnetrührer, bis sich die Glukose vollständig aufgelöst hat.</li>
	<li>Geben Sie aCSF in das Becherglas, um das endgültige Volumen auf 100 ml zu erhöhen. Führen Sie die Lösung durch einen 0,22 μm Porenfilter, um sie zu sterilisieren.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,9%ige Kochsalzlösung (NaCl) vor und passieren Sie die Lösung durch den 0,22-μm-Filter.</li>
	<li>Legen Sie alle Komponenten der Minipumpe und des Infusionssets in eine sterile Schale und schneiden Sie den Schlauch des Gehirninfusionssets mit einer sterilen Schere auf 1 Zoll Länge. Halten Sie den Schlauch mit einem sterilen Hämostat fest und schieben Sie ihn auf die Oberseite eines Endes der Kanüle. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit der Oberseite des Durchflussmodulators. Bedecke beide Enden des Schlauchs mit etwas Kleber, um eine stärkere Verbindung zu erhalten.</li>
	<li>Befestigen Sie eine 27-g-Nadel an einer 1-ml-Spritze und füllen Sie sie entweder mit aCSF oder der Glukoselösung. Führen Sie die 27-G-Nadel in ein kleines Stück Schlauch ein. Schließen Sie dann den Schlauch an das offene Ende des Durchflussmodulators an und füllen Sie ihn mit der entsprechenden Lösung, bis Tropfen der Lösung aus der Kanüle austreten. Entfernen Sie alle Luftblasen, die im Schlauch eingeschlossen sind.</li>
	<li>Um die Minipumpe zu befüllen, halten Sie die Pumpe aufrecht und führen Sie die Spritzennadel in die Pumpe ein. Füllen Sie es mit der entsprechenden Lösung, bis sich an der Öffnung der Minipumpe ein Tropfen der Lösung bildet.</li>
	<li>Setzen Sie den Durchflussmodulator langsam in die Pumpe ein und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Baugruppe gelangen.</li>
	<li>Nachdem die osmotischen Minipumpen zusammengebaut sind, füllen Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Füllen Sie den Schlauch mit der sterilen Kochsalzlösung, so dass die Pumpen vollständig eingetaucht sind, und achten Sie darauf, dass die Kanüle nicht in die Kochsalzlösung gelangt. Vier solcher zusammengebauten Pumpen können in einem 50-ml-Röhrchen untergebracht werden.</li>
	<li>Setzen Sie die Kappe locker auf jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Pumpen bei 37 °C, um sie mindestens 48 h lang anzusaugen.</li>
</ol>2. Operation zur Implantation osmotischer Pumpen
<ol><li>Präoperativer Eingriff<ol><li>Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven und lassen Sie sie vor Gebrauch mindestens 30 Minuten abkühlen. Die Autoklavenbedingungen beinhalten eine Dampfsterilisation bei 121 °C für 30 Minuten.</li>
		<li>Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Knöpfe, Ohrbügel und die stereotaktische Rahmenoberfläche ab. Anmerkungen: Die Operation sollte in einer aseptischen Umgebung durchgeführt werden, wobei zu beachten ist, dass während der Operation keine unsterilen Oberflächen berührt werden. Ersetzen Sie die Handschuhe, wenn der Verdacht auf eine Kontamination besteht.</li>
		<li>Legen Sie die Maus in eine Anästhesiekammer, um sie 3-5 Minuten lang mit 3% Isofluran an der Luft zu betäuben. Nehmen Sie dann die Maus aus der Kammer und legen Sie sie auf ein steriles Tuch. Halten Sie die Anästhesie über einen Nasenkegel bei 1,5%-2%.</li>
		<li>Kneifen Sie die Hinterpfote der Maus zusammen, um einen Reflex zu beobachten und die Narkosetiefe zu überprüfen.</li>
		<li>Injizieren Sie 5 mg/kg Carprofen subkutan zur Analgesie.</li>
		<li>Verwenden Sie eine saubere Haarschneidemaschine, um den Operationsbereich am Mauskopf zu befestigen. Reiben Sie die Kopfhaut zuerst mit Povidon-Jod-Lösung und dann mit Alkoholtupfern gründlich für mindestens 2 Minuten ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens dreimal.</li>
		<li>Tragen Sie ein Augengleitmittel auf, um zu verhindern, dass die Augen während der Operation austrocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Chirurgie<ol><li>Setzen Sie die Maus auf den stereotaktischen Rahmen und setzen Sie den Kopf auf die Schneidezahnstange. Bedecken Sie die Nase mit dem Nasenkegel. Bringen Sie sterile Abdeckungen an, um den Operationsbereich zu sichern.</li>
		<li>Verlagern Sie den Isofluranfluss auf den Nasenkegel. Halten Sie die Anästhesie weiterhin bei 1,5%-2% Isofluran.</li>
		<li>Legen Sie ein Heizkissen unter die Maus, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Ziehen Sie neue sterile Handschuhe an und machen Sie mit einem Skalpell einen Mittellinienschnitt (~10-15 mm lang) auf der Kopfhaut. Lege die Schädeloberfläche mit einem Spatel frei, während du Wattestäbchen verwendest, um Blutungen abzuwischen. Anmerkungen: Verwenden Sie einen Kauterisator, wenn Sie stark bluten, was selten vorkommt.</li>
		<li>Reiben Sie mit einer in 3%iges Wasserstoffperoxid getauchten Wattespitze, um die Schädelnähte freizulegen.</li>
		<li>Notieren Sie sich Bregma und Lambda, um in den Schädelkoordinaten zu navigieren. Setzen Sie alle Koordinaten bei bremma auf Null. HINWEIS: Diese Koordinaten stammen aus einem Mausgehirnatlas14. Der Referenzabstand zwischen Bregma und Lambda im Atlas beträgt 4,21 mm. Um alters- und geschlechtsbedingte Unterschiede in der Schädelgröße zu korrigieren, wurde der Bregma-Lambda-Abstand für jede Maus gemessen und dann durch 4,21 mm geteilt, um einen Multiplikationsfaktor zu erhalten. Wenn beispielsweise der Abstand zwischen Bregma und Lambda 4,65 mm beträgt, ergibt die Division durch 4,21 mm einen Multiplikationsfaktor von 1,10. Alle Koordinaten aus dem Atlas wurden dann mit diesem Faktor multipliziert, um die tatsächlichen Koordinaten zu messen, die zum Bohren des Lochs verwendet wurden. Im obigen Beispiel wären die resultierenden anterior-posterioren (AP) und medial-lateralen (ML) Koordinaten 0,55 bzw. 1,1 mm (d. h. 1,1 x 0,5 oder 1 mm).</li>
		<li>Verwenden Sie eine Bohrmaschine, um ein Loch an diesen Koordinaten zu bohren: 0,5 mm posterior zu Bremma und 1 mm seitlich zur Mittellinie nach rechts. HINWEIS: Achten Sie beim Bohren des Lochs im Schädel darauf, dass die Dura mater nicht reißt. Stellen Sie sicher, dass der Bohrer steril ist. Es kann zur Sterilisation mit anderen Instrumenten in denselben Autoklavenbeutel gelegt werden.</li>
		<li>Führen Sie ein Hämostat unter die eingeschnittene Haut ein und schieben Sie es an die Stelle, an der die osmotische Minipumpe implantiert werden soll. Öffnen und schließen Sie das Hämostat vorsichtig, um eine Tasche für die Minipumpe zu schaffen.</li>
		<li>Verwenden Sie ein steriles Hämostat, um eine vorbereitete osmotische Minipumpe von der Spitze des Durchflussmodulators zu entnehmen. Schieben Sie die Pumpe durch die eingeschnittene Haut in die Tasche. Anmerkungen: Achten Sie darauf, dass die Pumpe und die Kanüle keine unsterile Oberfläche berühren.</li>
		<li>Tragen Sie etwas Kleber auf die Unterseite der Kanüle auf und fixieren Sie sie im Kanülenhalter. Senken Sie die Kanüle langsam durch das gebohrte Loch 2 mm ventral auf die Schädeloberfläche. Lassen Sie es dort mindestens 5 Minuten einwirken, damit sich der Kleber verfestigen kann.</li>
		<li>Bevor Sie die Kanüle in das Gehirn einführen, vergewissern Sie sich, dass die Kanüle nicht verstopft ist und die Lösung richtig fließt. Anmerkungen: Manchmal kann sich aufgrund einer sehr geringen Flussrate Glukose an der Spitze der Kanüle ablagern und den Fluss blockieren.</li>
		<li>Schneiden Sie mit Hilfe einer Schere die Oberseite der Kanüle ab, um sicherzustellen, dass sie sich nicht von der Schädeloberfläche löst.</li>
		<li>Decken Sie die Kanüle mit einer Schicht Zahnzement ab, um zusätzlichen Halt zu erhalten.</li>
		<li>Verwenden Sie Nylonnähte (Größe 5-0 und 30 Zoll Länge), um die Wunde zu schließen, und tragen Sie ein topisches Antibiotikum auf die Wunde auf, um eine Infektion zu verhindern.</li>
		<li>Schalten Sie Isofluran aus und lassen Sie das Tier sich von der Narkose erholen. Setzen Sie das Tier dann in einen neuen, sauberen Käfig um.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachsorge<ol><li>Überwachen Sie die Maus nach der Operation mindestens 1 Woche lang.</li>
		<li>Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen subkutan einmal alle 24 Stunden für drei Tage nach der Operation.</li>
		<li>Lassen Sie die Wunde vollständig heilen, bevor Sie die Fäden 7-10 Tage nach der Operation entfernen. HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass Mäuse mit hohem Liquorglukosespiegel länger brauchten, um zu heilen. Das Trimmen von Krallen an den Hinterpfoten der Maus minimiert die Wahrscheinlichkeit einer Verletzung der Einschnittstelle aufgrund des Kratzverhaltens von Mäusen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Austausch der Minipumpen
HINWEIS: Da die in dieser Studie verwendeten Minipumpen nur 4 Wochen halten, wurde auch der Austausch von Minipumpen getestet, um die Dauer der Glukoseinfusion zu verlängern, wie es bei Langzeitstudien erforderlich sein kann. Dies umfasste die folgenden Schritte.
<ol><li>Bereiten Sie die Mäuse wie oben beschrieben auf die Operation vor.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen vertikalen Schnitt von 1 cm in der Haut etwas oberhalb der Pumpe.</li>
	<li>Führen Sie ein Hämostat unter die eingeschnittene Haut ein und ziehen Sie die Pumpe heraus.</li>
	<li>Entfernen Sie die Pumpe aus dem Schlauch und schließen Sie eine neue angesaugte Pumpe an den Schlauch an.</li>
	<li>Setzen Sie die Pumpe wieder ein und nähen Sie die Haut.</li>
	<li>Befolgen Sie die gleichen Pflegeanweisungen nach der Operation wie oben beschrieben.</li>
</ol>4. Verfahren zur Sammlung des Liquors
<ol><li>Präparat<ol><li>Ziehen Sie Glaskapillaren mit einem Durchmesser von 1 mm mit einer Mikropipettenabziehmaschine, um Spitzen mit einem Durchmesser von 0,5 mm zu erhalten. Die Einstellungen sind: Wärme = 800, Zug = 15, Geschwindigkeit = 5 und Zeit = 200 Einheiten. Legen Sie die gezogenen Kapillaren bis zur Verwendung in eine sterile Schachtel.</li>
		<li>Befestigen Sie eine 27-g-Nadel an einer 1-ml-Spritze. Führen Sie die gezogene Kapillare in die Nadel ein und verwenden Sie ein kleines Klebeband, um die Verbindung zu sichern.</li>
		<li>Fixieren Sie die Spritze fest in einem Kapillarhalter eines Mikromanipulators.</li>
		<li>Bereiten Sie als Nächstes die Maus auf die Operation vor, wie oben im voroperativen Verfahren beschrieben.</li>
	</ol></li>
	<li>Chirurgischer Eingriff<ol><li>Platzieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Rahmen. Nachdem Sie den Kopf wie zuvor beschrieben am Rahmen befestigt haben, drehen Sie die Knöpfe, um den Kopf so zu neigen, dass die Nase nach unten zeigt. Bringen Sie sterile Abdeckungen an, um den Operationsbereich zu sichern.</li>
		<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt auf der dorsalen Oberfläche, beginnend von der intraauralen Ebene bis zur kaudalen Seite. Anmerkungen: Achten Sie darauf, den Schlauch beim Einschnitt nicht zu beschädigen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Stütze vom Mauskörper und lassen Sie die Maus senkrecht ruhen, so dass der Hals nach hinten vollständig gestreckt ist.</li>
		<li>Mit Hilfe einer gebogenen stumpfen Pinzette halbieren Sie die hinteren Nackenmuskeln sanft von der Mittellinie aus, um ein kleines Fenster zu schaffen. Verwenden Sie dann einen feuchten Applikator mit Wattespitzen, um die Nackenmuskulatur sanft von der Mittellinie zur Peripherie zu verschieben.</li>
		<li>Beobachten Sie, ob die Cisterna magna freiliegt, die als dreieckiges Fenster mit einer transparenten Dura-Membran erscheint.</li>
		<li>Platzieren Sie die Mikromanipulatorbaugruppe auf dem stereotaktischen Rahmen neben der Maus und achten Sie darauf, dass die Kapillarspitze keine Oberfläche berührt.</li>
		<li>Brechen Sie die Kapillarspitze vorsichtig auf, ohne das Setup zu stören.</li>
		<li>Während Sie in die Lupe schauen (2,25-fache Vergrößerung), drehen Sie die entsprechenden Knöpfe am Mikromanipulator, um die Kapillarspitze langsam auszurichten und in Richtung der Cisterna Magna zu bewegen.</li>
		<li>Ein gewisser Widerstand ist zu spüren, sobald die Kapillarspitze die Membran der Cisterna magna berührt. Drücken Sie die Spitze mit Hilfe der Noppen sehr langsam gegen die Membran. Anmerkungen: Achten Sie darauf, keine Blutgefäße in der Membran zu beschädigen. Dieser Schritt ist sehr wichtig, um eine Blutkontamination im Liquor zu vermeiden.</li>
		<li>Stechen Sie sehr vorsichtig in die Membran. Der Liquor beginnt aufgrund des Unterdrucks in der Kapillare sofort in die Kapillare zu fließen.</li>
		<li>Lassen Sie den Aufbau einige Minuten stehen, bis ~10 μl Liquor in der Kapillare gesammelt sind.</li>
		<li>Ziehen Sie dann langsam die Kapillare aus der Cisterna Magna heraus und drücken Sie einen sterilen Applikator mit Wattestäbchen vorsichtig gegen die Öffnung der Cisterna Magna, um ein Auslaufen des Liquors zu verhindern.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Kapillare aus der Spritze und befestigen Sie sie an einem Mikrokappen-Bulb-Dispenser. Drücken Sie auf die Glühbirne, um den Liquor in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.</li>
		<li>Platzieren Sie eine Stütze unter der Maus und drehen Sie die stereotaktischen Knöpfe, um den Kopf auszurichten.</li>
		<li>Verschließen Sie die Wunde mit Nylonnähten.</li>
		<li>Injizieren Sie 300 μl sterile Kochsalzlösung subkutan, bevor Sie die Maus aus dem Gerät nehmen.</li>
		<li>Pflegen Sie die Tiere wie oben beschrieben, bis es Zeit ist, die Fäden zu entfernen - ~ 7-10 Tage nach der Operation.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Glukose-Assay
<ol><li>Befolgen Sie das Protokoll, wie es im kolorimetrischen Glukose-Assay-Kit beschrieben ist.</li>
	<li>Die im Kit enthaltene Natriumphosphat-Pufferlösung wird in Reinstwasser auf eine Konzentration von 50 mM verdünnt.</li>
	<li>Bereiten Sie Glukosestandards in den Bereichen 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 und 50 mg/dl aus der im Kit enthaltenen 1.000 mg/dl Stammlösung in verdünnter Pufferlösung vor.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 7-fache Verdünnung der Liquorproben im Puffer vor. Wenn beispielsweise das gesammelte Gesamtvolumen des Liquors 10 μl beträgt, beträgt das siebenfach verdünnte Volumen 70 μl.</li>
	<li>Pipettieren Sie 15 μl Glukosestandards und verdünnten Liquor in Duplikaten in eine 96-Well-Platte.</li>
	<li>Pipettieren Sie 85 μl verdünnten Puffer in jede der Vertiefungen mit Standards und Liquor.</li>
	<li>Geben Sie 6 ml verdünnten Puffer in die Durchstechflasche mit der kalorimetrischen Glukoseenzymmischung und wirbeln Sie sie einige Sekunden lang, um sie gründlich zu mischen.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl der Enzymmischung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu starten.</li>
	<li>Verschließen Sie die Platte mit einer Abdeckfolie und klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Reagenzien zu mischen.</li>
	<li>Stellen Sie die Platte für 10 Minuten in einen Inkubator bei 37 °C. Fläschchen mit hohem Glukosespiegel beginnen sich sofort violett zu verfärben.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 10 Minuten die Abdeckung und messen Sie die Absorption bei 500-520 nm mit einem Plattenleser.</li>
	<li>Berechnen Sie die Glukosekonzentration in den Liquorproben, indem Sie ihre Werte aus der Standardkurve interpolieren.</li>
</ol>6. Blutzuckertest
<ol><li>Machen Sie mit einer Rasierklinge einen kleinen seitlichen Schnitt in den Mausschwanz und verwenden Sie einen Tropfen Blut, um den Blutzucker mit einem Blutzuckermessgerät gemäß den Anweisungen der Bedienungsanleitung zu messen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll zur Erhöhung der Liquorglukose bei Mäusen durch die Verwendung osmotischer Minipumpen, die an eine Kanüle angeschlossen sind, die in den Seitenventrikel implantiert wird. Die chronische Infusion von Glukose in das Mäusegehirn durch dieses Verfahren wird nützlich sein, um die Auswirkungen einer langfristigen Hyperglykorrhachie auf die Kognition, den systemischen Glukosestoffwechsel und den Energiehaushalt zu beschreiben und die Pathogenese von Diabeteskomplikatione...

Sowohl Typ-1- als auch Typ-2-Diabetes beeinträchtigen die Gehirnfunktion 1,2,3. Zum Beispiel erhöht Diabetes das Risiko für kognitiven Verfall und neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit 3,4. Darüber hinaus haben Menschen mit Diabetes eine gestörte Glukosewahrnehmung im Gehirn 5,6. Dieser Defekt trägt zur Pathogenese der Hypoglykämie-assoziierten Unwissenheit und einer unzureichenden gegenregulatorischen Reaktion auf Hypoglykämie bei7,8, die tödlich sein kann, wenn sie nicht sofort behandelt wird.
In Anbetracht der Tatsache, dass Diabetes den Glukosespiegel sowohl im Blut als auch im Liquor cerebrospinalis (CSF)9 erhöht, ist es wichtig festzustellen, ob einer oder beide dieser Faktoren zu einer Beeinträchtigung der Gehirnfunktion beitragen. Ob Diabetes allein durch einen hohen Liquorglukosespiegel oder in Kombination mit anderen Faktoren wie Insulinmangel oder Insulinresistenz Hirnschäden verursacht, ist ebenfalls eine offene Frage. Tiermodelle für Typ-1- und Typ-2-Diabetes zeigen neben einem gestörten Energiehaushalt und peripheren Glukosestoffwechsel auch kognitiven Verfall und Neurodegeneration10,11,12,13. Aus diesen Modellen ist es jedoch nicht möglich, die selektiven Effekte von hohen Liquorglukose- und Blutzuckerspiegeln bei der Vermittlung der Komplikationen von Diabetes auf die Gehirnfunktion zu entkoppeln.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Entwicklung eines Mausmodells für Hyperglykorrhachie, um die Auswirkungen chronisch hoher Liquorglukosespiegel auf die Gehirnfunktion, den Energiehaushalt und die Glukosehomöostase zu testen. Das mit dieser Technik entwickelte Mausmodell stellt ein Werkzeug für Studien dar, die die ätiologische Rolle der dysregulierten Glukosehomöostase auf die neuronale und Verhaltensfunktion untersuchen.
Daher wird der vorgeschlagene Ansatz nützlich sein, um die direkten Auswirkungen erhöhter Liquorglukosespiegel bei verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Spritzenfilter</td><td>Membranlösungen</td><td>SFPES030022S</td><td></td></tr><tr><td>1 mL sterile Spritze (Luer-Lok-Spitze)</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1 mL TB Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>100 mL Glasbecherglas</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol (Koptec)</td><td>DLI</td><td>UN170</td><td>Verwenden Sie eine 70%ige Verdünnung, um den Operationsbereich zu reinigen</td></tr><tr><td>50 mL konisches Röhrchen</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zündanzeiger</td><td>KOPF</td><td>1905</td><td></td></tr><tr><td>Alzet Gehirn Infusionskit</td><td>DURECT</td><td>Kit # 3; 0008851</td><td>Schlauch im Kit auf 1 Zoll Länge schneiden</td></tr><tr><td>Alzet osmotische Pumpe</td><td>DURECT</td><td>2004</td><td>Durchflussmenge 0,25 &micro; L/h</td></tr><tr><td>Anästhesiesystem</td><td>Kent Scientific</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Lösung</td><td>Avrio Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 . 2H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Kanülenhalter</td><td>KOPF</td><td>1966</td><td></td></tr><tr><td>Zentrierendoskop</td><td>KOPF</td><td>1915</td><td></td></tr><tr><td>Dental Cement Liquid</td><td>Lang Dental REF1404</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental Zement Pulver</td><td>Lang Dental</td><td>REF1220-C</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Elektrische Bohrmaschine</td><td>KOPF</td><td>1911</td><td>Beim Bohren eines Lochs ein Reißen der Dura Mater vermeiden</td></tr><tr><td>Augenschmiermittel (Optixcare)</td><td>CLC Medica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlensterilisator (Germinator 500)</td><td>VWR</td><td>101326-488</td><td>Legen Sie Instrumente vor der Operation in steriles Wasser, um sie abkühlen zu lassen</td></tr><tr><td>Glukose-Assay-Kit</td><td>Cayman chemisches</td><td>10009582</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009-500ml</td><td>3% H2O2 auf die Schädeloberfläche auftragen, um die Schädelnähte sichtbar zu machen.</td></tr><tr><td>Haarschneider</td><td>WAHL N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Heatpax</td><td>19520483</td><td></td></tr><tr><td>Hämostat</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (Fluriso)</td><td>Zoetis</td><td>NDC1385-046-60</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>0395-500g</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer</td><td>WPI</td><td>M1</td><td></td></tr><tr><td>Vergrößerungs-Schreibtischleuchte</td><td>Brightech</td><td>LightView Pro Flex 2</td><td></td></tr><tr><td>Metallspatel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 . 6H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator (Rechtshänder)</td><td>WPI</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator mit Digitalanzeige</td><td>KOPF</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 . 7H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5Kg</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 . H2O</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin</td><td>Johnson & Johnson</td><td>N/A</td><td>Topische Salbe zur Vorbeugung von Infektionen auftragen</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>DM-999</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml</td><td>Zoetis</td><td>N/A</td><td>5 mg/kg, subkutan, zur Analgesie</td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Allignmentsystem</td><td>KOPF</td><td>1900</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 27-Gauge-Nadel</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Wattestäbchen-Applikatoren (Solon)</td><td>AMD Medicom</td><td>56200</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Nylonnähte (5.0)</td><td>Oasis</td><td>MV-661</td><td>Verwenden Sie zum Verschließen der Wunde ein nicht absorierbares Nahtmaterial</td></tr><tr><td>Sterile scharfe Schere&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile OP-Klingen</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>OP-Handschuhe (Nitril)</td><td>Ammex</td><td>N/A</td><td>Handschuhwechsel bei Verdacht auf Kontamination</td></tr><tr><td>Tablett</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

osmotische minipump-implantation zur erhöhung der glukosekonzentration im liquor der maus

Osmotic Minipump Implantation for Increasing Glucose Concentration in Mouse Cerebrospinal Fluid

Diabetes erhöht das Risiko eines kognitiven Verfalls und beeinträchtigt die Gehirnfunktion. Ob dieser Zusammenhang zwischen hohem Glukosespiegel und kognitiven Defiziten ursächlich ist oder nicht, bleibt unklar. Darüber hinaus ist auch unklar, ob diese Defizite durch einen Anstieg des Glukosespiegels im Liquor und/oder Blut vermittelt werden. Es gibt nur sehr wenige Studien, die die direkten Auswirkungen eines hohen Liquorglukosespiegels auf die Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS), insbesondere auf das Lernen und das Gedächtnis, untersuchen, da die aktuellen Diabetesmodelle nicht ausreichend entwickelt sind, um solche Forschungsfragen zu beantworten. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur chronischen Erhöhung des Liquorglukosespiegels für 4 Wochen durch kontinuierliche Infundierung von Glukose in den Seitenventrikel mit osmotischen Minipumpen bei Mäusen. Das Protokoll wurde durch die Messung des Glukosespiegels im Liquor validiert. Dieses Protokoll erhöhte den Liquorglukosespiegel auf ~328 mg/dl nach Infusion einer 50%igen Glukoselösung bei einer Flussrate von 0,25 μl/h, verglichen mit einer Liquorglukosekonzentration von ~56 mg/dl bei Mäusen, die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) erhielten. Darüber hinaus hatte dieses Protokoll keinen Einfluss auf den Blutzuckerspiegel. Daher kann diese Methode verwendet werden, um die direkten Auswirkungen einer hohen Liquorglukose auf die Gehirnfunktion oder eine bestimmte Nervenbahn unabhängig von Veränderungen des Blutzuckerspiegels zu bestimmen. Insgesamt wird der hier beschriebene Ansatz die Entwicklung von Tiermodellen erleichtern, um die Rolle einer hohen Liquorglukose bei der Vermittlung von Merkmalen der Alzheimer-Krankheit und/oder anderer neurodegenerativer Erkrankungen im Zusammenhang mit Diabetes zu testen.

Männlichen Mäusen wurde eine Kanüle implantiert, die an eine osmotische Minipumpe angeschlossen war (Abbildung 1), um einen Liquor oder eine 50%ige Glukoselösung in ihre Seitenventrikel zu infundieren (Abbildung 2). Der Liquor wurde 10 Tage nach der Operation entnommen (Abbildung 3), um die Wirksamkeit dieses Verfahrens zu validieren. Die Ergebnisse zeigten einen Anstieg des Liquorglukosespiegels (Mittelwert: 327,7 mg/dl) bei Mäusen...

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor cerebrospinalis (CSF) von Mäusen. Dieser Ansatz kann nützlich sein, um die Auswirkungen einer hohen Liquorglukose auf die Neurodegeneration, die Kognition und den peripheren Glukosestoffwechsel bei Mäusen zu untersuchen.

Osmotische Minipump-Implantation zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor der Maus

Diabetes increases the risk of cognitive decline and impairs brain function. Whether or not this relationship between high glucose and cognitive deficits ...

Diese Technik erhöht den Liquorglukosespiegel bei Mäusen, ohne ihre Blutzuckerkonzentration zu beeinflussen. Dies hilft, die direkten Auswirkungen eines hohen Liquorglukosespiegels auf die Gehirnfunktion des Tieres zu untersuchen. Mit dieser Technik können Tiermodelle etabliert werden, um die theologische Rolle eines höheren Liquorglukosespiegels bei kognitiven Dysfunktionen zu untersuchen.Dies führte zur Entdeckung neuer molekularer Ziele zur Verbesserung der kognitiven Funktion. Die Methode wird auch dazu beitragen, festzustellen, ob ein hoher Liquorglukosespiegel ausreicht, um Phänotypen neurodegenerativer Erkrankungen bei Mäusen zu vermitteln. Es muss auf die richtige Montage und Vorbereitung der Kanüle geachtet werden und die Kanüle an den richtigen Koordinaten in das Gehirn eingeführt werden.Um die Operation für die Osmotische Minipumpenimplantation zu beginnen, legen Sie die anästhesierte Maus auf den stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie den Kopf des Tieres auf die Schneidezahnstange. Bedecken Sie die Nase mit dem Nasenkegel, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, und verbinden Sie den Isofluoranfluss mit einer Rate von 1,5 bis 2 % mit dem Nasenkegel. Legen Sie ein Heizkissen unter die Maus, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.Nachdem Sie den Operationsbereich desinfiziert und einen Schnitt gemacht haben, legen Sie die Schädeloberfläche mit einem Spatel frei und wischen Sie das Blut, falls vorhanden, mit Wattestäbchen ab. Verwenden Sie einen Kauterisator, wenn Sie stark bluten. Reiben Sie mit einer in 3%iges Wasserstoffperoxid getauchten Wattespitze, um die Schädelnähte freizulegen.Achten Sie bei der Arbeit unter dem Mikroskop auf Bregma und Lambda, um die Schädelkoordinaten zu navigieren. Setzen Sie alle Koordinaten bei bremma auf Null. Machen Sie mit einer Bohrmaschine vorsichtig und ohne die Dura mater zu reißen, ein Loch an den Koordinaten 0,5 Millimeter hinter Bregma und 1 Millimeter seitlich zur Mittellinie nach rechts.Setzen Sie einen Hämostat ein und öffnen und schließen Sie ihn vorsichtig, um eine Tasche für die Minipumpe zu erhalten. Halten Sie die Pumpe an der Spitze des Durchflussmodulators fest und drücken Sie sie durch die eingeschnittene Haut in die entstandene Tasche. Tragen Sie etwas Kleber auf die Unterseite der Kanüle auf und befestigen Sie sie in der Kanülenhalterung.Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht verstopft ist und die Lösung richtig fließt. Dann senken Sie die Kanüle langsam durch das gebohrte Loch, zwei Millimeter ventral zur Schädeloberfläche. Lassen Sie es dort mindestens fünf Minuten einwirken, damit sich der Kleber verfestigen kann.Klemmen Sie mit Hilfe einer Schere die Oberseite der Kanüle ab, um sicherzustellen, dass sie sich nicht von der Schädeloberfläche löst. Decken Sie die Kanüle mit einer Schicht Zahnzement ab, um zusätzlichen Halt zu erhalten. Für die Entnahme von Liquor oder Liquor legen Sie die richtig betäubte Maus auf den stereotaktischen Rahmen.Nachdem Sie den Kopf wie zuvor gezeigt am Rahmen befestigt haben, drehen Sie die Knöpfe, um den Kopf so zu neigen, dass die Nase nach unten zeigt. Nachdem Sie den Operationsbereich desinfiziert und einen Schnitt gemacht haben, entfernen Sie die Stütze vom Mauskörper und lassen Sie die Maus senkrecht ruhen, so dass der Hals nach dorsal vollständig gestreckt ist. Mit einer gebogenen, stumpfen Pinzette halbieren Sie die hinteren Nackenmuskeln sanft von der Mittellinie aus, um ein kleines Fenster zu schaffen.Verwenden Sie dann einen Applikator mit feuchter Wattestäbchenspitze, um die Nackenmuskulatur sanft von der Mittellinie zur Peripherie zu verschieben. Beobachten Sie, ob die Cisterna magna als dreieckiges Fenster mit einer transparenten Dura-Membran freigelegt ist. Platzieren Sie die Mikromanipulatorbaugruppe auf dem stereotaktischen Rahmen neben der Maus und achten Sie darauf, dass die Kapillarspitze keine Oberfläche berührt.Brechen Sie die Kapillarspitze vorsichtig auf, ohne das Setup zu stören. Drehen Sie die entsprechenden Knöpfe am Mikromanipulator, um sie langsam auszurichten, und bewegen Sie die Kapillarspitze in Richtung der Cisterna magna. Ein gewisser Widerstand ist zu spüren, sobald die Kapillarspitze die Membran der Cisterna magna berührt.Drücken Sie die Spitze mit Hilfe der Noppen sehr langsam gegen die Membran und achten Sie darauf, keine Blutgefäße in der Membran zu beschädigen. Wenn die Membran durchstochen wird, fließt der Liquor aufgrund des Unterdrucks sofort in die Kapillare. Lassen Sie den Aufbau einige Minuten stehen, bis sich etwa 10 Mikroliter Liquor in der Kapillare angesammelt haben.Entfernen Sie vorsichtig die Kapillare aus der Spritze und befestigen Sie sie an einem Mikrokappen-Bulb-Dispenser. Drücken Sie auf die Glühbirne, um den Liquor in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Platzieren Sie die Stütze unter der Maus und drehen Sie die stereotaktischen Knöpfe, um den Kopf zu nivellieren.Verschließen Sie die Wunde mit Nylonnähten. Injizieren Sie 300 Mikroliter sterile Kochsalzlösung subkutan, bevor Sie die Maus aus dem Gerät nehmen. Kümmern Sie sich postoperativ um die Tiere, bis es Zeit ist, die Fäden zu entfernen, etwa 7 bis 10 Tage nach der Operation.Der Liquor, der 10 Tage nach der Operation entnommen wurde, zeigte einen etwa sechsfachen Anstieg des Glukosespiegels bei Mäusen, die mit 50 % Glukose infundiert waren, im Vergleich zu Mäusen, die mit Liquor infundiert waren. Die Blutzuckerwerte unterschieden sich jedoch nicht zwischen den Gruppen. Während Sie die Kanüle im Gehirn absenken, ziehen Sie sie zurück und prüfen Sie, ob der Liquor aus dem Loch kommt.Es ist auch wichtig, die Cisterna magna korrekt zu identifizieren und eine Kontamination des Liquors mit Blut zu verhindern. Diese Technik kann auch verwendet werden, um jedes Medikament zu verabreichen, das nicht in der Lage ist, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, um seine Wirkung auf die Gehirnfunktion zu testen. Es gibt nur eine sehr begrenzte Anzahl von Tiermodellen für Diabetes, und sie stören die Glukosehomöostase in der peripheren Umgebung.Dieses Modell hilft jedoch, gehirnspezifische Veränderungen in der Glukoseregulation auf die neuronale Funktion zu untersuchen.

osmotic-minipump-implantation-for-increasing-glucose-concentration

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Als neurowissenschaftliche Untersuchung wird immer anspruchsvoller, die Untersuchung von Hirnstrukturen und-Schaltung erfordert eine verbesserte Genauigkeit und eine höhere Auflösung. Wir haben ein Verfahren zur Herstellung und Implantation einer chronischen Infusion System im Gehirn unter Verwendung einer Borosilikat Mikrokanüle mit einer Spitze Durchmesser von 50 Mikrometer entwickelt.

Bau-und Implantation eines Mikroinfusion System für Nachhaltige Lieferung von Neuroactive Agents.

Ein mikrofluidischen Insel perifusion Gerät wurde für die Beurteilung der Dynamik der Insulinsekretion von mehreren Inselchen und gleichzeitige Fluoreszenz-Imaging von Calcium-Einstrom und die mitochondriale möglichen Veränderungen entwickelt.

Ein Multi-Parametric Islet Perifusion System innerhalb eines mikrofluidischen Perifusion Geräte

In diesem Video demonstrieren wir den Zusammenbau eines mikroosmotischen Pumpen-Gehirninfusionssystems, gefolgt von seiner chirurgischen Implantation in den Schädel der Maus. Dieses System ermöglicht die kontinuierliche Verabreichung potenzieller Medikamente und erleichtert die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf das Gehirn und das Hirngewebe.

Kontinuierliches Medikamenteninfusionssystem im Mausmodell: Ein chirurgischer Eingriff zur Implantation eines mikroosmotischen Pumpeninfusionssystems in das Gehirn der Maus für eine kontinuierliche Wirkstoffabgabe

Dieses Video zeigt die Wirkung einer kontinuierlichen Infusion von Medikamenten in das Gehirn von Mäusen auf den Blutzuckerspiegel. Der Glukosestoffwechsel wird beurteilt, indem Blut aus dem Schwanz einer nüchternen Maus entnommen und der Glukosespiegel vor und nach der oralen Glukoseverabreichung gemessen wird. Die Insulintoleranz wird durch Injektion von Insulin in die Maus bewertet, wobei der Glukosespiegel in bestimmten Abständen aufgezeichnet wird.

Bewertung der Wirkung einer kontinuierlichen Infusion von Medikamenten in das Gehirn von Mäusen auf den peripheren Glukosespiegel

Quelle: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Methode zur Verabreichung von Neurotherapeutika mit einer osmotischen Pumpe in einem demyelinisierten Mausmodell. Die kontrollierte Wirkstofffreisetzung fördert die Remyelinisierung, indem sie myelinproduzierende Zellen im Corpus callosum aktiviert.

 Osmotische Pump-basierte neurotherapeutische Wirkstoffabgabe in einem demyelinisierten Mausmodell

Die Aktivität der einzelnen Neuronen aus erwachsenen Alters Mäusen kann durch distanziert Neuronen aus bestimmten Hirnregionen und unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff Membranpotential Bildgebung untersucht werden. Durch Prüfung Antworten auf Veränderungen in Glucose, kann diese Technik verwendet, um die Glucoseempfindlichkeit von Erwachsenen ventromedialen Hypothalamus-Neuronen zu untersuchen.

Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Um die Reorganisation des Gehirns unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen, haben wir miniosmotische Pumpen für die direkte Proteinabgabe ins Gehirn verwendet, wobei die Blut-Hirn-Schranke umgangen wird. Anschließend werden Tract Tracer injiziert, um Veränderungen in der Gehirnkonnektivität unter dem Einfluss des Proteins zu untersuchen.

Die Implantation von miniosmotische Pumpen und Lieferung von Tract Tracer Brain Reorganisation in pathophysiologischen Bedingungen Studieren

Dieses Protokoll untersucht die Rolle der Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 5 (CCL5) im Hypothalamus durch die Bereitstellung von Antagonist MetCCL5, in das Gehirn der Maus mit einem Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System. Diese vorübergehende Hemmung der CCL5 Aktivität unterbrochen Hypothalamus Insulin Signalisierung, Glukoseintoleranz und periphere systemische Insulinsensitivität führen.

Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus

Die chronische Verabreichung von Isoproterenol über eine implantierte osmotische Pumpe wurde weit verbreitet verwendet, um fortgeschrittene Herzinsuffizienz bei Mäusen zu imitieren. Hier beschreiben wir detaillierte Methoden der chirurgischen Mini-Pump-Implantation für die kontinuierliche Isoproterenol-Verabreichung über 3 Wochen sowie die echokardiographische Beurteilung der erfolgreichen Modellerstellung.

Implantation einer Isoproterenol Mini-Pumpe zur Induzieren von Herzinsuffizienz bei Mäusen

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Implantation von osmotischen Pumpen und Induktion von Stress zur Etablierung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3 Dystonie

Die Demyelinisierung findet bei multiplen Erkrankungen des zentralen Nervensystems statt. Eine zuverlässige In-vivo-Arzneimittelabgabetechnik ist für remyelinisierende Arzneimitteltests erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt eine osmotische pumpbasierte Methode, die eine langfristige Arzneimittelabgabe direkt in das Gehirnparenchym ermöglicht und die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels verbessert, mit breiter Anwendung in der Remyelinisierungsforschung.

Osmotische pumpbasierte Wirkstoffabgabe für die In-vivo-Remyelinisierungsforschung am zentralen Nervensystem

Lernen Sie die stereotaxische Implantation osmotischer Minipumpen zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor cerebrospinalis von Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Funktionen.

Osmotische Minipump-Implantation zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor der Maus

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