Name: Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Erfahren Sie sauerstoffunabhängige Assays zur Messung mitochondrialer Funktion bei Säugetieren unter hypoxischen Bedingungen. Diese LC-MS-basierten Methoden nutzen stabile Isotopenmarkierung zur Analyse metabolischer Anpassungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die in dieser Handschrift entstandenen Figuren sind mit BioRender.com entstanden. Wir danken Amy Walker für ihr Feedback zu diesem Artikel. J.B.S. wurde durch das Worcester Foundation for Biomedical Research Grant unterstützt.

Stabile Isotopenverfolgung und LC-MS-Analyse zur Messung von DHODH- und SDH-Aktivitäten

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>Spinelli, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+is+a+terminal+electron+acceptor+in+the+mammalian+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain.</a> Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+cycle+with+complex+II+prioritizes+sulfide+quinone+oxidoreductase-dependent+H%282%29S+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435(2022).</li>
<li>Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+growth+of+cancer+cells+in+media+in+which+glucose+is+replaced+by+galactose%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%27s+Zeitschrift+f%C3%BCr+Physiologische+Chemie%22%5BJournal%5D)">On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose.</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
<li>Attardi, G., King, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+Repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
<li>Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory-deficient+human+fibroblasts+exhibiting+defective+mitochondrial+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication.</a> Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).</li>
<li>Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+auxotrophy+for+pyrimidines+of+respiration-deficient+chick+embryo+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).</li>
<li>Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+metabolism+using+LC-MS+and+isotope+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers.</a> Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).</li>
<li>Heinrich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+natural+isotope+abundance+and+tracer+impurity+in+MS-%2C+MS%2FMS-+and+high-resolution-multiple-tracer-data+from+stable+isotope+labeling+experiments+with+IsoCorrectoR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17910(2018).</li>
<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+can+shuttle+reducing+power+from+the+hypoxic+retina+to+the+O%282%29-rich+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium.</a> Cell Reports. 31 (2), 107606(2020).</li>
<li>Angebault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idebenone+increases+mitochondrial+complex+I+activity+in+fibroblasts+from+LHON+patients+while+producing+contradictory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration.</a> BMC Research Notes. 4, 557(2011).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
<li>Murphy, E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+and+mitochondrial+sodium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease.</a> Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52076(2015).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).</li>
<li>Xiao, Y., Meierhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+hydroethidine-based+probes+reliable+for+reactive+oxygen+species+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).</li>
<li>DeBerardinis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+aerobic+glycolysis%3A+Transformed+cells+can+engage+in+glutamine+metabolism+that+exceeds+the+requirement+for+protein+and+nucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).</li>
<li>Keeley, T. P., Mann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+physiological+normoxia+for+improved+translation+of+cell+physiology+to+animal+models+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).</li>
<li>Ast, T., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+mammalian+cell+culture%3A+Are+we+repeating+the+experiment+of+Dr.+Ox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox.</a> Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).</li>
<li>Gu, C., Jun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+hypoxia+decrease+the+metabolic+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Does hypoxia decrease the metabolic rate.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 668(2018).</li>
<li>Voorde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+metabolic+fidelity+of+cancer+models+with+a+physiological+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium.</a> Scientific Advances. 5 (1), 7314(2019).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+medium+rewires+cellular+metabolism+and+reveals+uric+acid+as+an+endogenous+inhibitor+of+UMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase.</a> Cell. 169 (2), 258-272 (2017).</li>
<li>MacPherson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+T+cell+expansion+media+activate+distinct+metabolic+programs+uncoupled+from+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function.</a> Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).</li>
<li>Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+cell+culture+media+tune+mitochondrial+bioenergetics+and+drug+sensitivity+in+cancer+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models.</a> Cancers. 14 (16), 3917(2022).</li>
<li>Chan, S. W., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mtDNA+damage+using+a+supercoiling-sensitive+qPCR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach.</a> Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).</li>
<li>Doherty, E., Perl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+mass+by+flow+cytometry+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Reactive+Oxygen+Species%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress.</a> Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).</li>
<li>Birsoy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+cell+proliferation+is+to+enable+aspartate+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis.</a> Cell. 162 (3), 540-551 (2015).</li>
<li>Beigneux, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-citrate+lyase+deficiency+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ATP-citrate lyase deficiency in the mouse.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).</li>
<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
<li>Fendt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+glutamine+metabolism+is+a+function+of+the+alpha-ketoglutarate+to+citrate+ratio+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells.</a> Nature Communications. 4, 2236(2013).</li>
<li>Lee, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+studies+of+isolated+mitochondria+from+normal+and+diseased+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu melden.

Da neue Forschungsergebnisse zeigen, dass Mitochondrien von Säugetieren ohne den Verbrauch von molekularem Sauerstoff funktionieren können, ist es für Forscher von größter Bedeutung, orthogonale Assays über OCR-Messungen hinaus zu verwenden, um die mitochondriale Funktion genau zu quantifizieren. Hier haben wir eine Reihe von Assays zusammengestellt, die verwendet werden können, um die Aktivitäten von Komplex I, Komplex II, Komplex V und DHODH direkt zu bewerten, indem das mitochondriale NAD+/NADH-Gleichgewicht, die Nutzung adaptiver terminaler Elektronenakzeptoren, die Produktion von ATP, die de novo Pyrimidinbiosynthese und mitochondriale ROS gemessen werden. Bemerkenswert ist, dass diese Assays die mitochondriale Funktion direkter messen als OCR-Messungen. Darüber hinaus bieten diese Assays den Forschern handhabbare Möglichkeiten zur Quantifizierung der mitochondrialen Funktion während der Hypoxie, für die OCR-Messungen weitgehend irrelevant sind, da Fumarat als bevorzugter terminaler Elektronenakzeptor verwendet wird. Schließlich sind die hier beschriebenen proliferationsbasierten Methoden kostengünstiger als klassische Respirometrie-Experimente und bieten somit eine allgemein zugängliche Möglichkeit, die mitochondriale Funktion in Säugetiersystemen zu untersuchen.
Bei der Verwendung dieser Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion in kultivierten Zellen sind wichtige Überlegungen zu berücksichtigen. In Bezug auf die Proliferationsassays ist es wichtig, die Anzahl der ausgesäten Zellen für die Verdopplungsrate jeder Zelllinie anzupassen. Die Zellen sollten zu mindestens 10 % Konfluenz ausgesät sein und genügend Platz für drei bis vier Verdopplungen bieten, damit Unterschiede in der Proliferation quantifiziert werden können. Eine weitere Überlegung für jeden Assay ist die Konzentration der kleinen Moleküle, die als Kontrollen für die Aktivitäten jedes ETC-Komplexes verwendet werden. Da verschiedene Zelllinien unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber diesen Inhibitoren aufweisen können, ist es wichtig, die Dosis dieser kleinen Moleküle zu testen, um die optimale Konzentration zu ermitteln.
Eine universelle Einschränkung von Assays zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion in vitro, einschließlich OCR-Messungen und aller hier beschriebenen Assays, ist die metabolische Zusammensetzung des Nährmediums. Standard-Zellkulturmedium neigt dazu, Systeme in ein oberflächlich hohes Niveau der mitochondrialen Funktion zu verzerren. Zum Beispiel erhöht der supraphysiologische Glutaminspiegel die Anaplerose des TCA-Zyklus25, was die mitochondriale NADH-Synthese antreibt und folglich die oxidative Phosphorylierung erhöht. In ähnlicher Weise liegt der Sauerstoffpartialdruck in Säugetiergeweben zwischen 3 mmHg und 100 mmHg (ca. 0,1%-13%O2), ist aber in vitro atmosphärisch (140 mmHg, ca. 21%) 26,27. Dieser Überschuss an O2 maximiert die mitochondriale Atmungskapazität und die Superoxidproduktion28. In jüngster Zeit wurden Anstrengungen unternommen, Nährmedien physiologischer zu gestalten29,30. Bemerkenswert ist, dass die Kultivierung von Zellen in humanen plasmaähnlichen Medien die mitochondriale Atmung in einigen Krebszelllinien30, die mitochondriale ROS in T-Zellen 31 und die mitochondriale Anpassung an Krebstherapeutika32 verringert. Daher ist es wichtig, auf die Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien zu achten und zu verstehen, wie sie sich auf die mitochondriale Funktion auswirken kann.
Eine weitere wichtige und universelle Einschränkung bei der Interpretation der mitochondrialen Funktion ist das Potenzial für Unterschiede in der Anzahl der Mitochondrien. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, den mitochondrialen Gehalt entweder durch die Quantifizierung von mtDNA33, die Messung der mitochondrialen Masse mit membranpotentialunempfindlichen Farbstoffen34 oder durch Western Blot von mitochondrialen Markern zu messen. Dies ist eine kritische Kontrolle, damit eine Abnahme der Anzahl der Mitochondrien nicht mit einer Abnahme der Mitochondrienfunktion verwechselt wird.
Es gibt auch spezifische Einschränkungen und Fehlerbehebungen, die für die hier beschriebenen Assays gelten. Da sich differenzierte Zellen nicht vermehren, sind die proliferationsbasierten Assays in diesem Zusammenhang nicht für die Beurteilung der mitochondrialen Funktion geeignet. Eine wesentliche Einschränkung des 13-C-4-Aspartat-Tracing-Protokolls zur Messung der DHODH-Aktivität besteht darin, dass die Aspartataufnahme in Zellen äußerst ineffizient sein kann35. Um diese potenzielle Einschränkung zu überwinden, können Forscher den Aspartattransporter SLC1A3 überexprimieren, um die Aufnahme von 13C4-Aspartat zu erleichtern35.
Eine Einschränkung des Protokolls, das die 13-C-5-Glutamin-Verfolgung zur Messung der SDH-Aktivität verwendet, besteht darin, dass dieser Assay erfordert, dass die Zellen den reduktiven Carboxylierungsweg nutzen, um die M+3-Isotopologenanzureichern, um die umgekehrte Aktivität zu messen. Einige Zelllinien sind aufgrund einer niedrigen ATP-Citrat-Lyase-Expression36, einer unzureichenden HIF-Stabilisierung 37 oder eines zu niedrigen α-KG-Citrat-Verhältnisses 38 nicht in der Lage, einen reduktiven Carboxylierungsfluss durchzuführen38. Um diese Einschränkung zu überwinden, könnte man 13 C4-Aspartat-Tracing verwenden, um die SDH-Vorwärts- und Rückwärtsaktivitäten zu messen 7. In diesem Assay kann die SDH-Vorwärtsaktivität durch das Verhältnis von Fumarat M+2:Succinat M+2 und die Rückreaktion von Succinat M+4:Fumarat M+4 gemessen werden. Bemerkenswert ist, dass durch diese Rückverfolgung die meisten Enzyme im reduktiven Carboxylierungsweg umgangen werden.
Eine Einschränkung des Komplex-I-Aktivitäts-Assays mit DCPIP-Reduktion als Auslese besteht darin, dass die Mitochondrien strukturell nicht intakt sind. Der Prozess des Einfrierens der Mitochondrien, um ihre NADH-Aufnahme für den Assay zu ermöglichen, kann sicherlich die strukturelle Integrität der mitochondrialen Membran beeinträchtigen39. Dieser Assay sollte parallel zu Assays wie dem Komplex-I-Proliferations-Assay durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die beobachteten Veränderungen der Komplex-I-Aktivität auch bei intakten Zellen zutreffen.
In zukünftigen Studien können einige dieser Techniken für die Messung der mitochondrialen Funktionen in vivo an Modellorganismen wie Mäusen und Caenorhabditis elegans angepasst werden.Die aktuellen Methoden, die zur Messung der mitochondrialen Funktion in vivo verwendet werden, konzentrieren sich auf die OCR auf organismischer Ebene, insbesondere auf die respiratorische Austauschrate bei Verwendung von Mausmodellen. Eine klare Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass Sauerstoff über seine Rolle als ubiquitärer terminaler Elektronenakzeptor in der mitochondrialen ETC hinaus viele biochemische und Signalfunktionen erfüllt. Zum Beispiel wird Sauerstoff durch die katalytische Aktivität von Enzymen aus der Familie der Dioxygenasen "verbraucht". Obwohl diese Enzyme zum zellulären Sauerstoffverbrauch beitragen, sind sie nicht an der mitochondrialen Funktion beteiligt, regulieren sie nicht und spiegeln sie nicht wider. Klassische Respirometrie-Experimente in vitro kontrollieren in der Regel die "nicht-mitochondriale OCR", während Organismus-Experimente mit dem respiratorischen Austauschverhältnis (RER) dies nicht kontrollieren können, was die Interpretation der RER als Metrik für die mitochondriale Funktion in vivo einschränkt. Es ist jedoch möglich, die Protokolle so anzupassen, dass die DHODH-Aktivität über die 13-C-4-Aspartat-Rückverfolgung, die Komplex-II-Aktivität über die 13-C-5-Glutamin-Rückverfolgung, die Komplex-I-Aktivität auf Mitochondrien, die aus Geweben gereinigt wurden, und diemitochondriale ROS unter Verwendung von LC-MS-freundlichen Verbindungen wie MitoB gemessen werden, um die mitochondriale Funktion in vivo zu messen. Diese direkten Assays zur Untersuchung der mitochondrialen Funktionen in Kombination mit klassischen Respirometrie-Experimenten ermöglichen den Forschern eine umfassendere und genauere Beurteilung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen und -geweben.

Die Funktion der Mitochondrien ist eine entscheidende Kennzahl für die Zellgesundheit, da sie wichtige biosynthetische, bioenergetische und Signalfunktionen in Säugetierzellen aufrechterhält1. Die überwiegende Mehrheit der mitochondrialen Funktionen erfordert den Elektronenfluss durch die Elektronentransportkette (ETC), und Störungen des Elektronenflusses im ETC verursachen schwere mitochondriale Erkrankungen2. Die ETC besteht aus einer Reihe von Reduktions- und Oxidationsreaktionen (Redoxreaktionen), die in die innere Mitochondrienmembran eingebettet sind, und diese Elektronentransferreaktionen setzen freie Energie frei, die zur Unterstützung der ATP-Synthese, physiologischer Prozesse wie der Thermogenese, Biosynthesewege wie der de novo Pyrimidinbiosynthese und des Gleichgewichts des Redoxstatus von Co-Faktoren wie NADH genutzt werden kann. Die ETC-Komplexe I und III produzieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS)3,4,5, die wiederum wichtige Signalwege wie HIF, PI3K, NRF2, NFκB und MAPK 6 regulieren. Folglich werden Metriken des Elektronenflusses im ETC klassischerweise als Proxy für die mitochondriale Funktion in Säugetierzellen verwendet.
Respirometrie-Experimente werden häufig eingesetzt, um die mitochondriale Funktion in Säugetierzellen zu messen. Da O2 der am weitesten verbreitete terminale Elektronenakzeptor für die ETC von Säugetieren ist, wird seine Reduktion als Proxy für die mitochondriale Funktion verwendet. Neue Erkenntnisse zeigen jedoch, dass Mitochondrien von Säugetieren Fumarat als Elektronenakzeptor einsetzen können, um mitochondriale Funktionen aufrechtzuerhalten, die von der ETC abhängen, einschließlich der de novo Pyrimidinbiosynthese 7, der NADH-Oxidation7 und der Entgiftung von Schwefelwasserstoff8. Daher liefern Messungen derO2-Verbrauchsrate (OCR) in bestimmten Kontexten, insbesondere in hypoxischen Umgebungen, keinen präzisen oder genauen Hinweis auf die mitochondriale Funktion.
Hier skizzieren wir eine Reihe von Assays, die zur Messung der mitochondrialen Funktion unabhängig von der OCR eingesetzt werden können. Wir bieten Assays zur direkten Messung der komplexen I-vermittelten NADH-Oxidation, der Dihydroorotat-Dehydrogenase-vermittelten de novo Pyrimidinbiosynthese, der komplexen V-abhängigen ATP-Synthese, der Nettodirektionalität des Succinat-Dehydrogenase-Komplexes (SDH) und der mitochondrialen ROS an. Diese Assays sind für die Durchführung an kultivierten Säugetierzellen gedacht, obwohl viele angepasst werden können, um mitochondriale Funktionen in vivo zu untersuchen.Bemerkenswert ist, dass die in diesem Protokoll beschriebenen Assays direktere Messungen der mitochondrialen Funktionen sind als die OCR. Darüber hinaus ermöglichen sie die Messung der mitochondrialen Funktion bei Hypoxie, einem Kontext, in dem die OCR keine indikative Messung ist. Zusammengenommen werden diese Assays in Kombination mit klassischen Respirometrie-Experimenten den Forschern eine umfassendere Bewertung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 1,5-ml-Tube</td><td>Cell Treat</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>2,0-ml-Tube</td><td>Cell Treat</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten-Cell</td><td>Treat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platten-Cell</td><td>Treat</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-Aspartat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutamin</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Cell Treat</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Cell Treat</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Gewebekulturschale</td><td>Cell Treat</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- Dichlorphenolindophenol</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumcarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>Flaschenaufsatzfilter 500 mL, 0,22 & Mikro; m, PES 9 9 mm Membrandurchmesser</td><td>Cell Treat</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade</td><td>Cell Treat</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Cold Trap</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>vollständiger Proteaseinhibitor Tabletten</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>Schar Thekenbecher</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Decylubichinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glukosefreies DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminfreies DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Qualität 35% Ammoniumhydroxid</td><td>Thermo</td><td>Scientific 460801000</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td> in HPLC-Qualität <td>900667</td><td></td></tr><tr>Chloroform <td>Sigma-Aldrich</td> in<td>HPLC-Qualität</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure in HPLC-Qualität</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol in HPLC-Qualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr>MeOH <td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>in HPLC-Qualität</td><td></td>900688</tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Humane Osteosarkom-Zelllinie 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Isotonpuffer</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue-Grinder, Größe 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvatfreie DMEM-Medien</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver Inkubator</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gekühlter Centrivap Tisch-Vakuumkonzentrator</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu; m 150 x 2,1 mm Analysesäule</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC Schutzkit</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, Pellets</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Tert-Butylhydroperoxid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Schar Partikelanzahl und -größe Analysator</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

sauerstoffunabhängige assays zur messung der mitochondrialen funktion bei säugetieren

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Der Elektronenfluss in der mitochondrialen Elektronentransportkette (ETC) unterstützt vielfältige biosynthetische, bioenergetische und Signalfunktionen in Säugetierzellen. Da Sauerstoff (O2) der allgegenwärtigste terminale Elektronenakzeptor für die ETC von Säugetieren ist, wird dieO2-Verbrauchsrate häufig als Proxy für die mitochondriale Funktion verwendet. Neue Forschungsergebnisse zeigen jedoch, dass dieser Parameter nicht immer auf die mitochondriale Funktion hinweist, da Fumarat als alternativer Elektronenakzeptor eingesetzt werden kann, um mitochondriale Funktionen bei Hypoxie aufrechtzuerhalten. Dieser Artikel stellt eine Reihe von Protokollen zusammen, die es Forschern ermöglichen, die mitochondriale Funktion unabhängig von derO2-Verbrauchsrate zu messen. Diese Assays sind besonders nützlich, wenn es darum geht, die Funktion der Mitochondrien in hypoxischen Umgebungen zu untersuchen. Insbesondere beschreiben wir Methoden zur Messung der mitochondrialen ATP-Produktion, der de novo Pyrimidinbiosynthese, der NADH-Oxidation durch Komplex I und der Superoxidproduktion. In Kombination mit klassischen Respirometrie-Experimenten werden diese orthogonalen und ökonomischen Assays den Forschern eine umfassendere Bewertung der mitochondrialen Funktion in ihrem interessierenden System ermöglichen.

Die Aktivitäten von DHODH, Komplex I und Komplex V können alle mit Hilfe von Proliferationsassays bewertet werden. Nach dem Entzug von Uridin aus dem Nährmedium werden die Zellen für die Pyrimidinbiosynthese abhängiger vom de novo Weg. Wenn Zellen also aufgefordert wurden, sich in einem uridinfreien Medium zu vermehren, reagierten sie empfindlicher auf die Hemmung der DHODH-Aktivität durch Brequinar als Zellen, die in einem uridinhaltigen Medium kultiviert wurden (Abbildung 6A). In ähnlicher Weise macht der Entzug von Pyruvat aus dem Nährmedium die Zellen abhängiger von der Aktivität des Komplexes I für die Proliferation. Wenn Zellen also aufgefordert wurden, sich in einem pyruvatfreien Medium zu vermehren, reagierten sie empfindlicher auf die Hemmung der Komplex-I-Aktivität durch Rotenon als Zellen, die in einem Pyruvat-haltigen Medium kultiviert wurden (Abbildung 6B). Die Aktivität des Komplexes V kann beurteilt werden, indem Zellen aufgefordert werden, sich in einem Medium zu vermehren, das Galaktose anstelle von Glukose enthält. Da Galaktose in der Glykolyse Netto-Null-ATP liefert, sind Zellen, die in diesem Brennstoff wachsen, stärker auf die mitochondriale ATP-Synthese über die Komplex-V-Aktivität angewiesen. Daher waren Zellen, die sich in einem galaktosehaltigen Medium vermehrten, empfindlicher auf die Hemmung des Komplexes V durch Oligomycin als Zellen, die sich in einem glukosehaltigen Medium vermehrten (Abbildung 6C).
Die SDH-Aktivität kann mit Hilfe von 13C-5-Glutamin-Tracing und durch Überwachung des Einbaus in Fumarat- und Succinat-Isotopologen gemessen werden. Unter fahrzeugbehandelten Bedingungen begünstigte der SDH-Komplex die Vorwärtsaktivität, und der Einbau von 13 C 4-Succinat in 13 C4-Fumarat war höher als der Einbau von 13 C 3-Fumarat in 13C 3-Succinat (Abbildung 7). Unter Antimycin-behandelten Bedingungen begünstigte der SDH-Komplex die umgekehrte Aktivität, und der Einbau von 13 C-3-Fumarat in 13 C-3-Succinat war größer als der Einbau von 13 C-4-Succinat in 13 C4-Fumarat (Abbildung 7).
Die Superoxidproduktion in den Mitochondrien kann mit dem Fluoreszenzreporter MitoSox gemessen werden, der bei Reaktion mit Superoxid 2-Hydroxy-Mitoethidium erzeugt. In dieser Studie wiesen Zellen, die mit MitoSox in Gegenwart von Tertbutylwasserstoffperoxid behandelt wurden, höhere Konzentrationen von 2-Hydroxy-Mitoethidium auf, die durch die Zugabe von NAC, einem Antioxidans, das zelluläre ROS löscht, unterdrückt wurde (Abbildung 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> Abbildung 1: Mechanistische Grundlage für den komplexen V-Proliferations-Assay. Oxidation von Glukose und Galaktose durch Glykolyse. Glukose liefert netto zwei ATP aus der Glykolyse, während Galaktose netto null ATP liefert, da die UTP-Synthese für UDP-Galaktose erforderlich ist. Daher sind Zellen, die in Galaktose gezüchtet werden, aufgrund eines Mangels an ATP, das aus der Glykolyse hergestellt wird, stärker von der mitochondrialen ATP-Synthese abhängig. Abkürzungen: GALK = Galactokinase; GALT = Galaktose-1-phosphat-Uridylyltransferase; PGM1 = Phosphoglucomutase 1; GPI = Glucose-6-phosphat-Isomerase, UGP = UDP-Glucose-Pyrophosphorylase; GALE = UDP-Galaktose-4-Epimerase; NDK = Nukleotid-Diphosphat-Kinase; UMPK = Uridinmonophosphat-Kinase; HK = Hexokinase; PFK = Phosphofructokinase; ALDO = Aldolase; TPI = Triosephosphat-Isomerase; GAPDH = Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; PGK = Phosphoglyceratkinase; PGM = Phosphoglucomutase; ENO = enolase; PK = Pyruvatkinase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> Abbildung 2: Mechanistische Grundlage für den Komplex-I-Proliferationsassay. Schematische Darstellung der Stoffwechselwege, die durch die Hemmung der Komplex-I-Aktivität verändert werden. In Medien mit hohem Pyruvatgehalt wird die Komplex-I-Hemmung durch LDH-vermittelte NADH-Oxidation umgangen. In Medien mit niedrigem Pyruvatgehalt ist diese Anpassung weniger durchführbar, so dass die Zellen stärker auf die Aktivität des Komplexes I angewiesen sind, um NADH zu reoxidieren. Abkürzungen: LDH = Laktatdehydrogenase; TCA-Zyklus = Tricarbonsäure-Zyklus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> Abbildung 3: Schematische Darstellung der DHODH-Reaktion bei 13C4-Aspartat-Tracing. Brequinar hemmt die Oxidation von Dihydroorotat zu Orotat und verhindert so die nachgeschaltete Synthese von UMP. 13C4-Aspartat wird über DHODH-Aktivität in 13 C3-UMPeingebaut. Abkürzungen: OMM = äußere Mitochondrienmembran; IMM = innere Mitochondrienmembran; DHODH = Dihydroorotat-Dehydrogenase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> Abbildung 4: Messung der Vorwärts- und Rückwärtsaktivität des Komplexes II mittels 13C 5-Glutamin-Tracing. Um die Aktivität des Vorwärtskomplexes II (links) zu messen, wird der Einbau von 13 C-5-Glutamin in 13 C4-Succinat und 13 C4-Fumarat überwacht. Um die Reverse-Complex-II-Aktivität (rechts) zu messen, wird der Einbau von 13 C-5-Glutamin in 13C-3-Succinat und 13 C3-Fumarat überwacht. Abkürzungen: SDH = Succinat-Dehydrogenase; CytC = Cytochrom C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> Abbildung 5: MitoSox-Rot-Reaktion mit Superoxid. Die Reaktion von MitoSox mit mitochondrialen Superoxiden zu 2-OH-MitoE2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> Abbildung 6: Proliferationsbasierte Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion (A) Proliferation von 143B-Osteosarkomzellen, die mit 5 μM Brequinar, einem DHODH-Inhibitor, in Medium mit ±100 μg/ml Uridin behandelt wurden. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; N = 3 pro Bedingung. (B) Proliferation von 143B-Osteosarkomzellen, die mit dem 2 μM-Rotenon, einem Komplex-I-Inhibitor, in Medium mit ±5 mM Pyruvat behandelt wurden. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; N = 3 pro Bedingung. (C) Proliferation von 143B-Osteosarkomzellen, die mit dem 5 μM-Oligomycin, einem Komplex-V-Inhibitor, behandelt wurden, in einem Medium mit entweder 10 mM Glukose oder 10 mM Galaktose als einziger zentraler Kohlenstoffquelle. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; N = 3 pro Bedingung. * zeigt p &lt; 0,05 bei Verwendung eines einfaktoriellen ANOVA-Tests in Graphpad Prism an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> Abbildung 7: 13C 5-Glutamin-Verfolgung zur Messung der Komplex-II-Aktivität. Succinatoxidation und Fumaratreduktion (SDH reverse) in DMSO- und 500 nM Antimycin A-behandelten Caki1- und DLD1-Zellen. Die Daten stellen den Mittelwert ± REM dar. N = 3 pro Bedingung. zeigt p &lt; 0,05 an, wobei ein ungepaarter t-Test in GraphPad Prism verwendet wird. Abkürzungen: SDH = Succinatoxidation; SDH-Umkehr = Fumarat-Reduktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> Abbildung 8: LCMS-basierter MitoSox-Assay zum Nachweis von Superoxid. Extrahiertes Ionenchromatogramm von 2-OH-Mito E2+ , isoliert aus Caki1-Zellen, die 30 min lang mit MitoSox behandelt wurden, in Gegenwart von tBuOOH ± NAC. Abkürzungen: LCMS = Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; NAC = N-Acetylcystein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1: Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Puffer und Medien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, wie Mitochondrien metabolische Stressoren wahrnehmen und sich an sie anpassen. Ein wichtiger metabolischer Stressfaktor ist Hypoxie, die auftritt, wenn Zellen unter Sauerstoffmangel leiden. Wir entwickeln bessere Assays, um die Funktion der Mitochondrien in sauerstoffarmen Umgebungen zu untersuchen.Hochauflösende Massenspektrometrie wurde eingesetzt, um die Zell- und Gewebemetabolitenkonzentration zu untersuchen. Wir haben Stabilisotopen-Tracing-Studien verwendet, um das Schicksal bestimmter Metaboliten zu verfolgen und neue Stoffwechselwege aufzudecken, die für die Physiologie gesunder und kranker Säugetiere relevant sind. Die Gruppe hat herausgefunden, dass die Mitochondrien von Säugetieren in sauerstoffarmen Umgebungen wichtige Funktionen aufrechterhalten können.Mechanistisch verwenden sie Fumarat als alternatives elektronisches Zepter für die Elektronentransportkette. Dieses Protokoll stellt mehrere Assays zusammen, mit denen Forscher die mitochondriale Funktion in Säugetierzellen besser beurteilen können. Wichtig ist, dass diese Protokolle verwendet werden können, um die mitochondriale Funktion bei Hypoxie zu untersuchen, da klassische Respirometrie-Experimente nicht ausreichen.

oxygen-independent-assays-to-measure-mitochondrial-function-in-mammals

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien...

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Der Vergleich des mitochondrialen Membranpotentials zwischen Proben liefert wertvolle Informationen über den zellulären Status. Detaillierte Schritte zur Isolierung von Mitochondrien und zur Beurteilung des Ansprechens auf Inhibitoren und Entkoppler mittels Fluoreszenz werden beschrieben. Die Methode und der Nutzen dieses Protokolls werden anhand eines Zellkultur- und Tiermodells für zellulären Stress veranschaulicht.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Die vorgestellten Methoden bieten Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung einer Sammlung von mikrotiterplattenbasierten respirometrischen Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien aus minimalen Mengen von Maus-Skelettmuskeln. Diese Assays sind in der Lage, mechanistische Veränderungen/Anpassungen des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs in einem häufig verwendeten Tiermodell zu messen.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Hier präsentieren wir eine Modifikation einer zuvor berichteten Methode, die die Isolierung von qualitativ hochwertigen und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Verfahren führt zu hochgradig gekoppelten Mitochondrien, die während mikrotiterplattenbasierter Respirometirc-Assays mit hoher Funktion atmen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

In diesem Papier wird eine Methode zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch mit hochauflösender respirometrie in permeabilized Thoraxes von Drosophila beschrieben. Diese Technik erfordert eine minimale Menge an Gewebe im Vergleich zur klassischen mitochondriale Isolierung-Technik und die erzielten Ergebnisse mehr physiologisch relevant sind.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Wir entwickelten ein praktisches Protokoll und einen analytischen Ansatz zur Bewertung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung und Der Elektronentransferkapazität in frischen Tumorhomogenaten. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Funktionen zu überwachen, die zur Entstehung, Progression und Ansprechen auf die Behandlung von Krebs beitragen.

Analytische Bestimmung der mitochondrialen Funktion von exzidierten soliden Tumorhomogenaten

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

Ein Protokoll wird für die Produktion von tRNA (UUU) und die Analyse von tRNA (UUU) im Komplex mit dem Enzym TcdA durch Agarose-Gel-Retardierungs-Assays vorgestellt.

Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardations-Assays für die Analyse der<em&gt; N.</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosin TcdA-Funktion

Erfahren Sie sauerstoffunabhängige Assays zur Messung mitochondrialer Funktion bei Säugetieren unter hypoxischen Bedingungen. Diese LC-MS-basierten Methoden nutzen stabile Isotopenmarkierung zur Analyse metabolischer Anpassungen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Weitere Videos entdecken