Ein Workflow zur Optimierung der Formulierung von Lipid-Nanopartikeln (LNP) unter Verwendung von Experimenten mit designten Mischungsprozessen und selbstvalidierten Ensemblemodellen (SVEM)

Dieser Artikel bietet Wissenschaftlern einen Arbeitsablauf, um eine Versuchsplanungstabelle zu erstellen und experimentelle Ergebnisse über eine Vielzahl von Mischungs- und Prozessfaktoren zu analysieren, ohne dass langwierige und potenziell volatile statistische Entscheidungen erforderlich sind. Die resultierenden Modelle können gemeinsam über mehrere Antwortvariablen optimiert und verwendet werden, um aussagekräftige Grafiken zu erstellen, die sowohl die gemeinsame Antwortfläche als auch die Vorhersagen der einzelnen Antworten zusammenfassen. Diese Grafiken sind einfacher zu interpretieren als die Parameterschätzungen aus den zugrunde liegenden statistischen Modellen und sind hilfreich bei der Darstellung der Faktoreinstellungen, die die wünschenswertesten Antwortvariablen erzeugen.

Wissenschaftler bei der Formulierung von Lipiden und Nanopartikeln müssen häufig neue Rezepturen für unterschiedliche Nutzlasten oder bei der Änderung von Lipiden oder Prozesseinstellungen konstruieren. Wir bieten einen robusten Ansatz zur Formulierungsoptimierung, der das Fehlerpotenzial bei der Konstruktion minimiert und die Notwendigkeit umfangreicher Statistiken und Kenntnisse während der Analyse vermeidet. Fassen Sie den Zweck des Experiments in einem Dokument mit Datumsstempel zusammen.

Listen Sie die Antworten auf, die während des Experiments gemessen werden. Wählen Sie die Faktoren aus, die variiert werden, und diejenigen, die während der Studie konstant gehalten werden. Legen Sie die Bereiche für die unterschiedlichen Faktoren und die jeweils relevante Dezimalgenauigkeit fest.

Bestimmen Sie die Größe des Studiendesigns mithilfe der minimalen und maximalen Heuristiken. Öffnen Sie den Sprung und navigieren Sie in der Menüleiste zu DOI, Special Purpose, Space Filling Design. Geben Sie die Antworten auf die Studie ein.

Geben Sie die Studienfaktoren und die Bereiche ein. Geben Sie die vorgegebene Anzahl von Durchläufen für den Versuchsplan ein. Generieren Sie die raumfüllende Versuchsplantabelle für die ausgewählten Faktoren und die Laufgröße.

Fügen Sie der Tabelle eine Notizspalte hinzu, um manuell erstellte Ausführungen mit Anmerkungen zu versehen. Integrieren Sie ggf. manuell Benchmark-Kontrollläufe in die Entwurfstabelle. Fügen Sie eine Replikation für einen der kontrollierten Benchmarks hinzu.

Markieren Sie den Namen des Benchmarks in der Spalte "Notizen" und codieren Sie die Zeilen der Benchmark-Replizierung farblich, um eine einfache korrekte Identifizierung zu ermöglichen. Runden Sie die Mischung der Faktorstufen auf die entsprechende Granularität. Kopieren Sie die gerundeten Werte und fügen Sie sie in die ursprünglichen Spalten ein.

Löschen Sie die redundanten Kopien der gerundeten Spalten. Überprüfen Sie nach dem Runden der Lipidfaktoren, ob ihre Summe 100 % beträgtWenn eine Zeilensumme nicht gleich einem ist, passen Sie einen der Mischungsfaktoren manuell an und stellen Sie sicher, dass er innerhalb des Faktorbereichs bleibt. Löschen Sie die Summenspalte, nachdem die Anpassungen vorgenommen wurden.

Befolgen Sie das gleiche Verfahren wie beim Runden der Mischungsfaktoren, um die Prozessfaktoren auf ihre jeweilige Granularität zu runden. Formatieren Sie die Lipidspalten so, dass sie als Prozentsätze mit einer gewünschten Anzahl von Dezimalstellen angezeigt werden. Wenn Sie manuelle Ausführungen wie Benchmarks hinzugefügt haben, ordnen Sie die Reihenfolge der Tabellenzeilen neu und fügen Sie eine neue Spalte mit gerundeten Werten hinzu.

Sortieren Sie diese Spalte in aufsteigender Reihenfolge, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Spaltenüberschrift klicken, und löschen Sie dann die Spalte. Generieren Sie ternäre Diagramme, um die Versuchsplanpunkte über den Lipidfaktoren zu visualisieren. Untersuchen Sie auch die Laufverteilung über die Prozessfaktoren.

Die Formulierungswissenschaftler sollten die Machbarkeit aller Durchläufe bestätigen. Wenn nicht durchführbare Ausführungen vorhanden sind, starten Sie den Entwurf unter Berücksichtigung der neu entdeckten Einschränkungen neu. Führen Sie das Experiment in der Reihenfolge aus, die in der Entwurfstabelle angegeben ist.

Notieren Sie die Messwerte in der Spalte, die in die Versuchstabelle eingebaut ist. Zeichnen Sie die Messwerte auf und untersuchen Sie die Verteilung der Antwortvariablen. Untersuchen Sie den relativen Abstand zwischen den farbcodierten Replikatläufen, falls einer enthalten war, dies ermöglicht das Verständnis des Gesamtprozesses und der analytischen Streuung am Benchmark im Vergleich zur Variabilität aufgrund der Änderungen der Faktoreinstellungen über den gesamten Faktorraum.

Stelle die Läufe auf einem ternären Grundstück her. Färben Sie die Punkte entsprechend den Antwortvariablen ein, um eine modellunabhängige Ansicht des Verhaltens über die Mischungsfaktoren zu erhalten. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der resultierenden Diagramme, wählen Sie Zeilenlegende und dann die Antwortspalte aus.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Antwort. Erstellen Sie ein unabhängiges Modell für jede Antwortvariable in Abhängigkeit von den Studienfaktoren. Löschen Sie die Modellskripte, die durch den raumfüllenden Entwurf erstellt wurden.

Wählen Sie "Analysieren" und "Modell anpassen" aus. Konstruieren Sie ein vollständiges Modell, das alle Kandidateneffekte enthält. Dieses Modell sollte die Haupteffekte jedes Faktors, Zwei- und Drei-Wege-Wechselwirkungen, quadratische und partielle kubische Terme in den Prozessfaktoren und kubische Scheffe-Terme für die Mischungsfaktoren enthalten.

Wählen Sie alle Studienfaktoren aus. Ändern Sie den Eintrag für Grad von der Standardeinstellung von zwei auf drei. Wählen Sie dann eine Fakultät für Grad aus.

Wählen Sie nur die Nicht-Mischungsfaktoren aus, und wählen Sie dann Makros, Teilkubisch aus. Wählen Sie nur die Mischungsfaktoren aus, und wählen Sie dann Makros, Scheffe Cubic. Deaktivieren Sie die Standardoption no intercept.

Geben Sie die Antwortspalte an, und ändern Sie die Persönlichkeit in Generalisierte Regression. Speichern Sie dieses eingerichtete Modell in der Datentabelle, damit Sie es leicht abrufen können. Wählen Sie In Datentabelle speichern aus.

Klicken Sie auf Ausführen. Wählen Sie für die Schätzmethode die Option SVEM-Vorwärtsauswahl aus. Erweitern Sie die Menüs "Erweiterte Steuerelemente Begriffe erzwingen" und deaktivieren Sie die Kontrollkästchen, die den Haupteffekten der Mischung entsprechen.

Nur der Intercept-Begriff bleibt aktiviert. Klicken Sie auf Los.Stellen Sie die tatsächlichen Antwortvariablen anhand der vorhergesagten Antworten aus dem SVEM-Modell dar, um eine angemessene Vorhersagbarkeit zu überprüfen. Klicken Sie auf das rote Dreieck neben SVEM-Vorwärtsauswahl, und wählen Sie Spalten speichern, Vorhersageformel speichern aus.

Dadurch wird eine neue Spalte erstellt, die die Vorhersageformel in der Datentabelle enthält Wiederholen Sie die Modellerstellungsschritte für jede Antwortvariable. Nachdem alle Antwortvariablen über Vorhersagespalten in der Datentabelle gespeichert wurden, zeichnen Sie die Antwortablaufverfolgungen für alle vorhergesagten Antwortspalten mithilfe einer Profilerfunktion. Wählen Sie Diagrammprofiler aus, und wählen Sie alle Vorhersagespalten aus, die im vorherigen Schritt für die Y-Vorhersageformel erstellt wurden, und klicken Sie auf OK.

Identifizieren Sie geeignete optimale Formulierungen. Legen Sie die Erwünschtheitsfunktion für jede Antwort fest, ob sie maximiert, minimiert oder mit einem Ziel abgeglichen werden soll. Dazu gehört auch, dass die Gewichtungen der relativen Wichtigkeit für jede Antwort festgelegt werden.

Um den ersten Kandidaten zu generieren, legen Sie für alle primären Antworten die Wichtigkeitsgewichtung 1,0 und für alle sekundären Antworten die Wichtigkeitsgewichtung 0,2 fest. Weisen Sie den Profiler an, die optimalen Faktoreinstellungen zu finden, die die Erwünschtheitsfunktion maximieren. Wählen Sie "Optimierung Erwünschtheit" und dann "Erwünschtheit maximieren" aus.

Notieren Sie die optimalen Faktoreinstellungen zusammen mit einem Hinweis auf die Wichtigkeitsgewichtungen, die für jede Antwort verwendet werden. Für kategoriale Faktoren, wie z. B. den ionisierbaren Lipidtyp, finden Sie die bedingt optimalen Formulierungen für jede Faktorstufe. Legen Sie zunächst die gewünschte Stufe jedes Faktors im Profiler fest.

Halten Sie dann die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie mit der linken Maustaste in das Diagramm dieses Faktors und wählen Sie Faktoreinstellung sperren. Diese ausgewählte Optimierung und Erwünschtheit maximiert die Erwünschtheit, um das bedingte Optimum zu finden, wobei dieser Faktor in seiner aktuellen Einstellung gesperrt ist. Wenn Sie fertig sind, entsperren Sie die Faktoreinstellungen, bevor Sie fortfahren.

Wiederholen Sie den Optimierungsprozess, nachdem Sie die Wichtigkeitsgewichtungen der Antwortvariablen geändert haben, indem Sie möglicherweise nur die primären Antwortvariablen optimieren oder einige der sekundären Antwortvariablen so einstellen, dass sie mehr oder weniger wichtig sind, wodurch ihr Ziel auf keine festgelegt wird. Notieren Sie den neuen optimalen Kandidaten. Erstellen Sie grafische Zusammenfassungen der optimalen Bereiche des Faktorraums.

Erstellen Sie eine Datentabelle, die 50.000 Zeilen enthält, die mit zufällig generierten Faktoreinstellungen innerhalb des zulässigen Faktorraums gefüllt werden, zusammen mit den entsprechenden vorhergesagten Werten aus den reduzierten Modellen für jede der Antwortvariablen sowie der gemeinsamen Erwünschtheitsfunktion. Wählen Sie Zufallstabelle ausgeben aus. Ändern Sie den Wert für die Anzahl der zu simulierenden Durchläufe in 50.000, und klicken Sie auf OK.

Fügen Sie in der neu erstellten Tabelle eine neue Spalte hinzu, die das Perzentil der Erwünschtheitsspalte berechnet. Verwenden Sie diese Perzentilspalte in den ternären Diagrammen anstelle der unformatierten Erwünschtheitsspalte. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Spaltenüberschrift "Erwünschtheit", und wählen Sie "Neue Formelspalte", "Verteilung", "Kumulative Wahrscheinlichkeit" aus.

Generieren Sie die folgenden Grafiken. Ändern Sie wiederholt das Farbschema der Grafiken, um die Vorhersagen für jede Antwortvariable und für die Spalte mit der kumulativen Wahrscheinlichkeit anzuzeigen. Konstruieren Sie ternäre Diagramme für die vier Lipidfaktoren.

Navigieren Sie in der Tabelle zum ternären Diagramm des Diagramms. Wählen Sie die Mischungsfaktoren für die X-Darstellung aus, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in eines der resultierenden Diagramme, wählen Sie Zeilenlegende aus, und wählen Sie dann die Spalte für die vorhergesagte Antwort aus.

Ändern Sie das Dropdown-Menü "Farben" in "Jet". Dies zeigt die Regionen mit der besten und schlechtesten Leistung in Bezug auf die Lipidfaktoren. Die aktuelle Abbildung zeigt die Perzentile der Gelenkerwünschtheit, wenn man die Maximierung der Potenz mit einer wichtigen Folge von 1 und die Minimierung der Größe mit einer wichtigen Folge von 0,2 in Betracht zieht.

Bei der Mittelung über alle Faktoren, die nicht auf der ternären Diagrammachse angezeigt werden. Ändern Sie wiederholt das Farbschema der Grafiken, um die Vorhersagen für jede Antwortvariable anzuzeigen. Zeichnen Sie in ähnlicher Weise die 50.000 farbcodierten Punkte, die eindeutige Formulierungen darstellen, gegen die nicht gemischten Prozessfaktoren entweder einzeln oder gemeinsam auf und suchen Sie nach Beziehungen zwischen den Antwortvariablen und den Faktoren.

Suchen Sie nach den Faktoreinstellungen, die die Punktausbeute in der höchsten Erwünschtheit erzeugen. Diese Abbildung zeigt die gemeinsame Erwünschtheit aller Formulierungen, die mit jedem der drei ionisierten Lipidtypen gebildet werden konnten. Die begehrtesten Formulierungen verwenden H102, wobei H101 einige potenziell wettbewerbsfähige Alternativen bietet.

Untersuchen Sie verschiedene Kombinationen von Faktoren, die zu unterschiedlichen Reaktionen führen können. Speichern Sie den Vorhersageprofiler und die gespeicherten Einstellungen wieder in der Datentabelle. Bereiten Sie eine Tabelle vor, in der die optimalen Kandidaten aufgeführt sind, die zuvor identifiziert wurden.

Schließen Sie das Benchmark-Steuerelement in den Satz von Kandidatenläufen ein, die formuliert und gemessen werden. Wenn sich herausstellt, dass eine der Formulierungen aus dem Experiment die gewünschten Ergebnisse liefert, z. B. indem sie den Benchmark übertrifft, wählen Sie die besten aus, um sie der Kandidatentabelle hinzuzufügen, und testen Sie sie zusammen mit neuen Formulierungen erneut. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die gespeicherte Einstellungstabelle im Profiler, und wählen Sie In Datentabelle umwandeln aus.

Führen Sie die Bestätigungsläufe durch, konstruieren Sie die Rezepturen und sammeln Sie die Messwerte. Vergleichen Sie die Leistung der optimalen Rezepturen. Der Workflow wurde in vielen Anwendungen verwendet.

In den meisten Fällen haben wir eine mindestens vier- bis fünffache Verbesserung der Wirksamkeit beobachtet, wenn wir sie mit Benchmark-Formulierungen vergleichen, die mit jeweils einem Faktor festgelegt wurden. Verbesserungen machen sich vor allem dann bemerkbar, wenn Sekundärreaktionen gemeinsam ausgerichtet werden. Es ist auch möglich, die Simulation zu verwenden, um die erwartete Qualität der optimalen Kandidaten zu zeigen, die durch dieses Verfahren erzeugt werden.

Unter Verwendung einer bekannten Datengenerierungsfunktion für das in der Arbeit beschriebene Beispielexperiment können wir die Qualität der optimalen Rezepturen, die aus den raumfüllenden Designs und der SVEM-basierten Analyse in diesem Workflow erhalten werden, mit denen vergleichen, die aus den traditionellen Mischungsanalysetechniken erhalten werden. Mit der Qualität der optimalen Formulierung auf der vertikalen Achse und der Anzahl der Durchläufe im Design auf der horizontalen Achse stellen die blauen Punkte die Leistung des unreduzierten vollständigen statistischen Modells über 150 Simulationen dar. Die gelben Punkte stellen die Leistung der traditionellen Einzelschuss-Vorwärtsauswahl dar, die auf der AICC-Zielfunktion basiert.

Die grünen Punkte stellen die Leistung des SVEM-basierten Vorwärtsauswahlansatzes dar, der in diesem Workflow verwendet wird. Die SVEM-Analyse ermöglicht es uns, bessere optimale Kandidaten und weniger Durchläufe zu erhalten. Es wird gelegentlich Studien mit zusätzlicher Komplexität geben, die die Hilfe eines Statistikers für Design und Analyse erfordern.

Studien, die eine extrem hohe Priorität haben, bei denen die Durchlaufgröße begrenzter als üblich ist, oder bei denen es eine große Anzahl kategorialer Faktoren oder einen einzelnen kategorialen Faktor mit einer großen Anzahl von Stufen gibt, können von einem Statistiker anders angegangen werden. Verwenden Sie entweder optimale oder hybride Designs anstelle des im Workflow angegebenen raumfüllenden Designs.