Name: Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Erfahren Sie Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie mit UV-TPF- und SHG-Bildgebung sowie KI-gestützter Analyse. Diese Methode optimiert die Identifizierung von Kristallisationsbedingungen für strukturbiologische Forschung.

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Wir möchten uns bei unseren Nutzern dafür bedanken, dass sie uns ihre wertvollen Proben für das Kristallscreening anvertraut haben, sowie für das kritische Feedback und die Wünsche, die uns geholfen haben, unsere Ressourcen zu verfeinern und weiterzuentwickeln, um der Gemeinschaft der Strukturbiologie besser zu dienen. Wir möchten uns auch bei Ethan Holleman, Dr. Lisa J Keefe und Dr. Erica Duguid bedanken, die die Entwicklung der MARCO Polo GUI vorangetrieben haben. Wir bedanken uns bei den HWI-Kolleginnen und -Kollegen für ihre Unterstützung und Anregungen, insbesondere bei Dr. Diana CF Monteiro. Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung durch die National Institutes of Health, R24GM141256.

1. Zubereitung oder Kauf von Cocktails für sechzehn 96-Well-Tiefbrunnenblöcke
<ol><li>Bereiten Sie intern erzeugte chemische Cocktails zu, indem Sie sie in 96-Well-Deep-Well-Blöcke (DW) dosieren. Verwenden Sie einen Roboter-Liquid-Handler, um Stammlösungen aus Salzen, Puffern, Polymeren und Wasser zu dosieren und zu mischen.</li>
	<li>Bereiten Sie intern modifizierte chemische Cocktails zu, indem Sie einen Roboter-Liquid-Handler oder eine Mehrkanalpipette verwenden, um zusätzliche Komponenten zu kommerziell erworbenen 96-Well-DW-Blockbildschirmen hinzuzufügen.</li>
	<li>Kaufen Sie handelsübliche DW-Blöcke.</li>
	<li>Lagern Sie gekennzeichnete 96-Well-DW-Blöcke 12-18 Monate bei −20 °C. HINWEIS: Die in Schritt 1.1 zubereiteten Cocktails. und 1.2. Füllen Sie 10/16 96-Well-DW-Blöcke und 5/16 96-Well-DW-Blöcke werden wie gekauft verwendet. Zum Zeitpunkt der Abgabe der 1.536-Well-Platte wird ein 96-Well-DW-Block im Sieb eingerichtet, um eine Ausfällung des Additivsiebs zu vermeiden (siehe Abschnitt 3).</li>
</ol>2. Ausgabe der Cocktails auf 384-Well-Teller
<ol><li>Tauen Sie die 96-Well-DW-Blöcke über Nacht bei 4 °C auf. Auf Raumtemperatur (20-23 °C) bringen, bevor mit der Vorbereitung der 384-Well-Platten begonnen wird. Anmerkungen: Für die Zubereitung der Cocktailteller ist Raumtemperatur geeignet. Das Hauptanliegen bei der Zubereitung dieser Platten besteht darin, Ausfällungen zu vermeiden, die Liquid-Handling-Geräte verstopfen und zu unvorhersehbaren Änderungen der Konzentrationen der Cocktailzutaten führen können.</li>
	<li>Mischen Sie die Blöcke nach Bedarf gründlich durch Inversion, um hartnäckige, undurchsichtige Ausfällungen aufzulösen. Wenn Vertiefungen Niederschlag enthalten, erwärmen Sie die Blöcke auf 30 °C, damit sie sich auflösen.</li>
	<li>Abgabe von 50 μl Cocktaillösung aus vier 96-Well-DW-Blöcken auf eine 384-Well-Platte mit einem Liquid-Handling-Roboter, der mit einer 96-Spritze oder einem Pipettierkopf ausgestattet ist. Die vier 96-Well-DW-Blöcke werden so in die 384-Well-Platte gestanzt, dass Quadranten gefüllt werden (z. B. A1 von 96-DW1 bis A1 von 384-Platte1, A1 von 96-DW2 bis B1 von 384-Platte1 usw.). (Abbildung 3).</li>
	<li>Liefern Sie 15 der 16 96-Well-DW-Blöcke zur Lagerung auf 384-Well-Platten.</li>
	<li>Lagern Sie die 384-Well-Platten bis zu 6 Monate bei −20 °C, um sie bei der Herstellung der 1.536-Well-Platten zu verwenden.</li>
</ol>3. Vorbereitung der 1.536-Well-Platten mit Öl und Kristallisationscocktails
<ol><li>Abgabe von 5 μl Paraffinöl an jede Vertiefung einer 1.536-Well-Platte mithilfe eines robotergestützten Liquid-Handling-Systems mit der Kapazität für eine langsame Aspiration und Abgabe. Lagern Sie die Ölplatten bis zu 6 Monate bei 4 °C.</li>
	<li>Tauen Sie die 384-Well-Platten aus Sektion 2 über Nacht bei 4 °C auf. Drehen Sie die Platten um, um die Lösungen zu mischen und den Niederschlag aufzulösen. Inkubieren Sie die Platten bei 30 °C, um hartnäckige Ausfällungen aufzulösen.</li>
	<li>Verwenden Sie zur Vorbereitung der additiven Siebkomponenten den endgültigen 96-Well-DW-Block mit 0,1 M HEPES pH 6,8, 30 % PEG3350, um ihn mit dem kommerziellen Additivsieb zu mischen, indem Sie entweder einen Liquid-Handling-Roboter oder eine Mehrkanalpipette verwenden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Additivsieblösungen vor, indem Sie eine 1:1-Mischung aus der in Schritt 3.3 hergestellten gepufferten PEG3350-Lösung und dem Additivsieb auf ein Endvolumen von 50 μl in der entsprechenden 384-Well-Platte dosieren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Liquid-Handling-Roboter, der mit einer 384-Spritze oder einem Pipettorkopf ausgestattet ist, um 200 nL Cocktaillösung in jede Vertiefung der 1.536-Well-Platte zu geben. Stanzen Sie vier 384-Well-Platten in die 1.536-Well-Platte, so dass die Quadranten gefüllt sind (z. B. A1 von 384-Platte1 bis A1 der 1.536-Well-Platte, A2 von 384-Platte1 bis A3 von der 1.536-Well-Platte usw.) (Abbildung 3).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platten bei 150 × g für 5 Minuten, bevor Sie sie bis zu 4 Wochen bei 4 °C lagern.</li>
</ol>4. Probeneinreichung
<ol><li>Um eine Probe einzureichen, senden Sie vor Ablauf der Reservierungsfrist eine Reservierungs-E-Mail für den bevorstehenden Screening-Lauf. Geben Sie die Anzahl der Screening-Experimente, den Namen, den PI und die Institution sowie alle besonderen Anforderungen an die Handhabung der Probe an. Die Screening-Läufe werden etwa einmal monatlich durchgeführt, was zu 12 Läufen pro Jahr führt.</li>
	<li>Füllen Sie ein Mustereinreichungsformular aus, bevor Sie die Probe versenden.<ol><li>Wählen Sie für neue Benutzer ein Kennwort , das zum Herunterladen der Kristallisationsbilder in Abschnitt 7 verwendet wird.</li>
		<li>Verwenden Sie für etablierte Benutzer ein vorhandenes Kennwort, oder ändern Sie das Kennwort in diesem Schritt.</li>
	</ol></li>
	<li>Reichen Sie die Probe in einem 1,5-ml-Röhrchen ein. Stellen Sie sicher, dass das Makromolekül homogen und ausreichend konzentriert ist, um die Kristallisation zu fördern. Verwenden Sie einen Vorkristallisationstest, der in der Regel aus Ammoniumsulfat oder PEG 4.000 besteht, um die geeignete Probenkonzentration zu untersuchen, indem Sie beobachten, ob die getesteten Probenkonzentrationen zu klaren Tropfen oder Ausfällenführen 34. HINWEIS: Zu den geeigneten Qualitätstests, die vor der Probeneinsendung durchgeführt werden können, um die Reinheit und Homogenität zu überprüfen, gehören unter anderem SDS-PAGE, Gelfiltration und dynamische Lichtstreuung (DLS). Die Kristallisation kann selbst durch das Vorhandensein geringfügiger Verunreinigungen beeinträchtigt werden. Derzeit wird ein Probenvolumen von 500 μl benötigt, um eine 1.536-Well-Platte aufzubauen. Es laufen Tests, um den Bedarf an Probenvolumen zu verringern.<ol><li>Vermeiden Sie die Verwendung von Pufferkonzentrationen von mehr als 50 mM sowie von Phosphaten, die im Sieb kristallisieren können.</li>
		<li>Vermeiden Sie übermäßige Lösungsvermittler, einschließlich Glycerinkonzentrationen von mehr als 10 % w/v.</li>
	</ol></li>
	<li>Verpacken Sie die Probe in einem verschlossenen Behälter, um eine angemessene Temperatur mit Trockeneis, Nasseis oder Kühlakkus aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Versenden Sie die Priorität der Probe über Nacht von Montag bis Mittwoch während des Laufs.</li>
	<li>Senden Sie die Sendungsverfolgungsnummer per E-Mail, sobald die Probe versandt wurde.</li>
</ol>5. Probenaufbau in den vorbereiteten 1.536-Well-Platten
<ol><li>Packen Sie die Proben aus und inkubieren Sie sie sofort bei der vom Benutzer gewünschten Temperatur.</li>
	<li>Nach dem Auftauen wird die Probe bei 10.000 × g für 2 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Beobachten Sie die Probe visuell, um Niederschlag, Farbe und Zustand der Probe vor dem Einrichten zu identifizieren.</li>
	<li>1.536-Well-Platte auf 23 °C erwärmen und bei 150 × g 5 min zentrifugieren. Bilden Sie den reinen Cocktailteller mit Hellfeld-Bildgebung als Negativkontrolle ab. HINWEIS: Alle Platten werden vor dem Probenaufbau mit Hellfeld-Bildgebung abgebildet, was die Identifizierung von Vertiefungen ermöglicht, die bereits Kristalle oder Trümmer enthalten, bevor die Probe als Negativkontrolle hinzugefügt wird. Darüber hinaus ermöglicht es die Identifizierung von Wells, in denen der Kristallisationscocktail nicht geliefert wurde. Durch das Erwärmen der Platte auf Raumtemperatur wird die Kondensation auf der Plattenoberfläche vermieden, was zu klaren Bildern führt.</li>
	<li>Geben Sie 200 nL Probe mit einem Liquid-Handling-Roboter in jede Vertiefung in der 1.536-Well-Platte. Zentrifugenplatte bei 150 × g und Inkubationsplatten bei 4 °C, 14 °C oder 23 °C. HINWEIS: Microbatch-Unteröl-Experimente können von Hand durchgeführt werden, indem das Protein und der Cocktail unter das gewünschte Öl gegeben werden. Es wird jedoch empfohlen, nicht weniger als 1 μl von jedem Protein und Cocktail zu verwenden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.</li>
</ol>6. Überwachung von 1.536-Well-Platten auf Kristallbildung
<ol><li>Nachdem die Probe zu den 1.536-Well-Platten hinzugefügt wurde, wird ein Bild mit Hellfeld-Bildgebung an Tag 1 und Woche 1, Woche 2, Woche 3, Woche 4 und Woche 6 aufgenommen.</li>
	<li>Führen Sie die SONICC-Bildgebung mit SHG und UV-TPEF zum 4-Wochen-Zeitpunkt für Platten durch, die bei 23 °C inkubiert werden, und zum 6-Wochen-Zeitpunkt für Platten, die bei 14 °C oder 4 °C inkubiert werden. HINWEIS: Der Zeitpunkt für die SONICC-Bildgebung ist für die 1.536-Mikroassay-Platte mit hohem Durchsatz auf 4 Wochen und 6 Wochen festgelegt, da zu diesen Zeitpunkten in der Regel Kristalle erscheinen. Für die Modifikation zu einem 96-Well-Mikrobatch unter Öl- oder Dampfdiffusionsexperimenten ist es ratsam, die SONC-Bildgebung früher im Zeitfenster durchzuführen.</li>
	<li>Greifen Sie über ein internes LIMS-System auf die experimentellen Bilder zu, die automatisch in das Benutzerkonto übertragen wurden. Benachrichtigen Sie die Benutzer über einen automatisierten htslab-E-Mail-Daemon, dass ein Imaging stattgefunden hat.</li>
</ol>7. Bildanalyse
<ol><li>Rufen Sie die Screening-Bilder von der HWI-FTP-Site für jede .rar Datei ab. HINWEIS: Die Bildausgabe des Bildschirms 1.536 führt zu einer Reihe von Dateien mit Hellfeldbildern, SHG-Bildern und UV-TPEF-Bildern. Jede Bildgebungsmodalität oder jeder Zeitpunkt ist eine separate .rar Datei. Jede .rar Datei enthält, wenn sie entpackt wird, ein Bild von jedem Well der 1.536-Well-Platte zu einem bestimmten Zeitpunkt unter Verwendung einer bestimmten Bildgebungsmodalität.<ol><li>Verwenden Sie den FileZilla-Client oder andere Optionen, um auf die FTP-Daten zuzugreifen. HINWEIS: Der FileZilla-Client ist die empfohlene Methode, um das große Dateiübertragungsvolumen zu verwalten, um Rechenabstürze zu minimieren.<ol><li>Wenn der FileZilla-Client auf dem Computer des Benutzers installiert werden muss, laden Sie die FileZilla-Software herunter.</li>
			<li>Wenn FileZilla Client bereits installiert ist oder bei der Installation, klicken Sie auf das FileZilla-Symbol , um die Software zu öffnen.</li>
			<li>Melden Sie sich von FileZilla aus beim Remote-FTP-Server an, indem Sie die Host-FTP-Website, den Benutzernamen und das Passwort eingeben.</li>
			<li>Laden Sie die .rar Dateien in das gewünschte Verzeichnis herunter.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie die KI-fähige Open-Source-GUI, um die Kristallisationsbilder anzuzeigen, zu bewerten und zu analysieren. HINWEIS: Die GUI kann auf den meisten Windows-, Mac- und Linux-Betriebssystemen verwendet werden, und betriebssystemspezifische Anweisungen zum Herunterladen finden Sie auf der GitHub-Website. MARCO Polo ist eine Open-Source-GUI, die Metadaten aus dem Hochdurchsatz-Kristallisationsbildschirm 1.536 enthält, der im HTX Center implementiert ist. Es kann von jedem von GitHub heruntergeladen werden, um es an die spezifischen Bedürfnisse anderer Laborgruppen anzupassen.<ol><li>Öffnen Sie die .rar Datei in der GUI, nachdem die Datei heruntergeladen wurde (siehe ergänzende Abbildung S1).<ol><li>Klicken Sie auf Importieren, wählen Sie Bilder aus dem Dropdown-Menü und wählen Sie dann Aus RAR-Archiv/Verzeichnis.</li>
			<li>Klicken Sie im Popup-Fenster auf Nach Ordner suchen und navigieren Sie dann zu dem Ordner, der die Bilder enthält.</li>
			<li>Wählen Sie die gewünschte(n) Datei(en) aus und importieren Sie sie in die GUI, indem Sie auf Öffnen klicken. Warten Sie, bis die Datei(en) im Fenster " Ausgewählte Pfade" angezeigt werden. Wählen Sie eine oder mehrere Dateien aus, die Sie in die GUI herunterladen möchten, und klicken Sie auf Ausführungen.</li>
		</ol></li>
		<li>Zeigen Sie das Bild für das erste Well im Fenster des Slideshow-Viewers in der GUI an, indem Sie auf das > -Symbol links neben dem Beispielnamen klicken und dann mit einem Doppelklick darauf den entsprechenden Lesevorgang auswählen (Lesevorgänge werden nach Datum und Typ des Bildhellfelds, UV-TPEF oder SHG aufgelistet).</li>
		<li>Vergrößern Sie das Bild, indem Sie die Größe des gesamten Fensters ändern. Das Feld Bilddetails enthält Informationen zum Bild, einschließlich der Bewertungsinformationen (leer, bis der Lesevorgang bewertet wurde). Das Feld " Cocktaildetails" enthält Metadaten zu den Cocktailkomponenten.</li>
		<li>Wechseln Sie zum nächsten Feld, indem Sie im Navigationsbereich auf die Schaltfläche Weiter klicken oder die rechte Pfeiltaste auf der Tastatur drücken. Navigieren Sie zu einem bestimmten Bohrloch, indem Sie die Bohrlochnummer in das Fenster Nach Bohrlochnummer eingeben.</li>
		<li>Zeigen Sie alle Lesevorgänge (der in die GUI importierten) an, indem Sie das Kontrollkästchen Alle Daten anzeigen aktivieren.</li>
		<li>Zeigen Sie alle Spektren (der in die GUI importierten Spektren an), indem Sie das Kontrollkästchen Alle Spektren anzeigen aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Spektrum austauschen , um jedes Spektrumbild einzeln anzuzeigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bewerten Sie die Kristallbilder mit dem MARCO-Algorithmus, indem Sie zuerst einen bestimmten Lauf aus der Liste auf der linken Seite des Fensters markieren. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Ausgewählten Lauf klassifizieren . Zeigen Sie die MARCO-Scoring-Informationen im Fenster " Bilddetails" an, sobald eine Bildgebung für alle 1.536 Bohrlöcher ausgewertet wurde. HINWEIS: Die Klassifizierung dauert in der Regel zwischen 2 und 5 Minuten, abhängig von der Computergeschwindigkeit und dem verfügbaren Speicher. Der Algorithmus generiert Scores, die den Inhalt in "kristalline", "klare", "ausfallende" oder "andere" Klassen klassifizieren. Die numerischen Werte, die der Klassifizierung der einzelnen Vertiefungen zugeordnet sind, spiegeln die Wahrscheinlichkeit wider, dass die Vertiefung Objekte dieser Klasse enthält.<ol><li>Zeigen Sie eine Teilmenge der bewerteten Bilder an, indem Sie die gewünschten Kästchen im Bereich "Bildfilterung " ankreuzen und auf die Schaltfläche "Filter senden " klicken. Zeigen Sie beispielsweise nur die Bilder an, die von MARCO als Kristalle klassifiziert wurden, indem Sie die Kästchen Kristalle und MARCO ankreuzen und auf Filter senden klicken.</li>
	</ol></li>
	<li>Bewerten Sie die Kristallbilder manuell, um den Satz "menschlich bewertet" zu generieren. Weisen Sie einem Bohrloch eine Punktzahl zu, indem Sie auf die entsprechende Schaltfläche klicken (die Schaltflächen "Kristall", "Löschen", "Niederschlagen" oder "Andere" befinden sich im Klassifizierungsfenster am unteren Rand des Fensters). Alternativ können Sie den Nummernblock auf der Tastatur verwenden, um die Partitur zuzuweisen (1 = "Kristall", 2 = "Löschen", 3 = "Niederschlag", 4 = "Andere"). Bestimmen Sie ein von Menschen bewertetes Bild als "Favorit", indem Sie das Häkchen bei Favorit? Schachtel. HINWEIS: Sehen Sie sich nur die Bilder an, die von einem Menschen als Kristalle klassifiziert wurden, indem Sie die Kästchen Kristalle und Mensch ankreuzen und auf Filter senden klicken. Wenn Sie im Bedienfeld "Filter" auf das Feld "Favoriten" klicken, werden die zurückgegebenen Bilder weiter eingegrenzt, sodass nur die von Menschen bewerteten Kristallbilder zurückgegeben werden, die ebenfalls Favoriten sind.</li>
	<li>Verwenden Sie die Registerkarte Plate Viewer , um mehrere Wells gleichzeitig anzuzeigen. Wählen Sie auf der zweiten Registerkarte " Plattenbetrachter " im Bedienfeld "Einstellungen " 16, 64 oder 96 Bilder aus dem Dropdown-Menü im Abschnitt " Bilder pro Platte" aus. Verwenden Sie die Registerkarte Bildfilterung , um Bilder, die nicht von Interesse sind, auszugrauen. Aktivieren Sie das Feld Filter anwenden , um die Bilder zu filtern. HINWEIS: Wenn Sie z. B. die Kästchen "Mensch" und "Kristall" auswählen, sind nur die Vertiefungen gut sichtbar, die von einem Menschen als Kristall markiert wurden.<ol><li>Navigieren Sie auf der Registerkarte Plate Viewer , indem Sie auf die Schaltfläche Weiter klicken, um den nächsten Satz von 16/64/96-Bildern anzuzeigen. Standardmäßig sind Bilder, die als Kristalle bewertet werden, rot, die als klar bewerteten blau, diejenigen, die als Niederschlag bewertet werden, grün und diejenigen, die als andere bewertet werden, orange. Ändern Sie die Farben mithilfe der Dropdown-Menüs.</li>
		<li>Wählen Sie die Informationen aus, die in den Vertiefungen angezeigt werden sollen, indem Sie verschiedene Kästchen auf der Registerkarte Beschriftungen ankreuzen .</li>
		<li>Klicken Sie auf Ansicht speichern, um eine Bilddatei der aktuellen Ansicht zu speichern .</li>
		<li>Klicken Sie auf Spektrum tauschen , um zwischen Hellfeld-, SHG- und UV-TPEF-Bildern für das Multiple-Well-Bild umzuschalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie den entsprechenden Dateityp aus dem Dropdown-Menü aus, um die bewerteten Dateien für die Verwendung in anderen Programmen zu exportieren. HINWEIS: CSV-Dateien (durch Kommas getrennte Werte) sind mit Tabellenkalkulationsprogrammen wie Microsoft Excel oder Google Sheets kompatibel. JSON-Dateien (JavaScript Object Notation) können mit den meisten Texteditoren geöffnet werden. PPTX (PowerPoint-Präsentation) kann verwendet werden, um Bilder aus Polo anzuzeigen, einschließlich eines Vergleichs von Hellfeld-, UV-TPEF- und SHG-Bildern. Die Dateien werden im .xtal-Format gespeichert, um in der GUI von MARCO Polo erneut geöffnet zu werden.<ol><li>Speichern Sie eine Datei im .xtal-Format, indem Sie oben auf der Seite auf Datei klicken und dann entweder Ausführung speichern oder Ausführung speichern unter auswählen. Geben Sie einen Dateinamen und einen Speicherort des Verzeichnisses an.</li>
		<li>Öffnen Sie Dateien im .xtal-Format, indem Sie auf Importieren klicken und Bilder und dann Aus gespeicherter Ausführung auswählen. Suchen Sie nach dem entsprechenden Dateispeicherort, klicken Sie auf den Dateinamen und dann auf Öffnen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Hochdurchsatz-Screening für die Proteinkristallisation

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Die Methode beschreibt eine Hochdurchsatz-Pipeline für das Proteinkristallisations-Screening, die nur 500 μl Probe für 1.536 einzelne Kristallisationsexperimente im Microbatch-unter-Öl-Format benötigt. Die Pipeline stützt sich auf Liquid-Handling-Robotik, um den Versuchsaufbau schnell und reproduzierbar zu unterstützen, sowie auf die computergestützte Bildanalyseressource MARCO Polo, die für die Analyse von 1.536-Well-Plattenbildern mit dem MARCO-Algorithmus zur Identifizierung und Isolierung von Kristalltreffern angepasst ist.
Das geringe Volumen der einzelnen Screening-Tropfen (insgesamt 400 nL bei einem Verhältnis von 1:1 von Probe zu Cocktail) bedeutet, dass extrem kleine Probenvolumina erforderlich sind, um positive Kristallisationsbedingungen zu identifizieren. Diese kleinen Tropfengrößen erzeugen zwangsläufig kleine Kristalle, die mit herkömmlichem Looping nicht gefischt werden können. Es wurden Methoden entwickelt, um von den 1.536 Platten37 zu ernten; Zusätzlich wurden die Platten mit Kristallen direkt an Synchrotronquellen für die in situ Datenerfassung verwendet38. Wenn eine robuste Methode zur Gewinnung dieser Kristalle entwickelt würde, würden Fortschritte in der Synchrotrontechnologie und mikrofokussierte Strahlen es ermöglichen, nützliche Datensätze zu erhalten. Darüber hinaus könnten die gewonnenen Kristalle potenziell als Seeds für Optimierungsbemühungen verwendet werden.
Die SONICC-Bildgebung ist eindeutig vorteilhaft bei der Identifizierung sowohl kleiner Proteinkristalle als auch von Proteinkristallen, die unter dem Niederschlag verborgen sind. Trotz dieser Vorteile sind nicht alle Probentypen für die SHG- und UV-TPEF-Bildgebung geeignet. Zum Beispiel zeigen Proteine mit wenigen oder keinen aromatischen Tryptophanresten ein mehrdeutiges UV-TPEF-Signal. Darüber hinaus werden Kristalle in bestimmten Raumgruppen, einschließlich zentrosymmetrischer Gruppen oder der Punktgruppe 432, von der SHG-Bildgebung nicht entdeckt. Proben mit Fluorophoren stören manchmal das SHG-Signal, was zur Auslöschung des Signals oder zu einer erhöhten Intensität führt, was bedeutet, dass eine sorgfältige Interpretation von SHG-Signalen für metallhaltige Proteine und Proteine mit fluoreszierenden Einheiten erforderlich ist. In vielen Fällen ist es jedoch möglich, das Fehlen eines SHG- oder UV-TPEF-Signals zu rationalisieren, und das Fehlen dieser Signale sollte nicht unbedingt das Vorhandensein eines Proteinkristalls ausschließen.
Das Microbatch-under-Oil-Format bietet eine Alternative zur gebräuchlicheren Dampfdiffusionsmethode, die für die Hochdurchsatz-Kristallographie verwendet wird. Wichtig ist, dass sich das Kristallisationsformat auf die Trefferidentifikation39 auswirkt, was eine Begründung für die Verwendung verschiedener Kristallisationsformate für Hochdurchsatz-Screening-Bemühungen liefert. Automatisierte Bildgebung und SONICC-fähige Modalitäten helfen bei der schnellen Identifizierung von Proteinkristallen während des 6-wöchigen experimentellen Verlaufs. Schließlich ermöglicht die MARCO Polo GUI den Anwendern die schnelle Analyse von Bildern aus 1.536 Bedingungen, um vielversprechende Hit-Wells für die Optimierung zu identifizieren. Die Fähigkeiten des HTX-Zentrums, einschließlich des robotergestützten Hochdurchsatz-Versuchsaufbaus, in Verbindung mit den hochmodernen Bildgebungs- und Computerwerkzeugen für Analysen, leisten einen wichtigen Beitrag zur Gemeinschaft der Strukturbiologie, indem sie die Forscher in die Lage versetzen, einen primären Engpass in der kristallbasierten Strukturarbeit effektiv zu beheben: die Suche nach Kristallisationsbedingungen.

Auch in Zeiten enormer Fortschritte in der Strukturbiologie ist die Röntgenkristallographie nach wie vor eine zuverlässige und beliebte Methode, um qualitativ hochwertige Strukturmodelle von Makromolekülen zu erstellen. Über 85 % aller dreidimensionalen Strukturmodelle, die in der Proteindatenbank (PDB) hinterlegt sind, stammen aus kristallbasierten Strukturmethoden (Stand: Januar 2023). 1 Darüber hinaus ist die Röntgenkristallographie nach wie vor unverzichtbar für die Aufklärung von Protein-Ligand-Strukturen, eine entscheidende Komponente des Wirkstoffentdeckungs- und -entwicklungsprozesses2. Obwohl die Proteinkristallisation seit über einem halben Jahrhundert die dominierende Technik der Strukturbiologie ist, stecken Methoden zur Vorhersage der Kristallisationswahrscheinlichkeit auf der Grundlage der physikalischen Eigenschaften3 oderder Sequenz 4,5 noch in den Kinderschuhen.
Die Vorhersage der Kristallisationsbedingungen ist noch unklarer; Bei der Vorhersage wahrscheinlicher Kristallisationsbedingungen wurden selbst für Modellproteine nur begrenzte Fortschritte erzielt 6,7. Andere Studien haben versucht, Kristallisationsbedingungen auf der Grundlage der Proteinhomologie und der Bedingungen zu identifizieren, die aus dem PDB 8,9,10 gewonnen wurden. Die Vorhersagekraft in der PDB ist jedoch begrenzt, da nur die endgültigen, erfolgreichen Kristallisationsbedingungen hinterlegt werden, was zwangsläufig die oft umfangreichen Optimierungsexperimente vermissen lässt, die zur Feinabstimmung des Kristallwachstums erforderlich sind. Darüber hinaus fehlen vielen PDB-Einträgen Metadaten, die diese Details enthalten, einschließlich der Cocktailformeln, des Kristallisationsformats, der Temperatur und der Kristallisationszeit11,12. Daher ist für viele Proteine von Interesse der einfachste Weg, die Kristallisationsbedingungen zu bestimmen, die experimentelle Verwendung so vieler Bedingungen wie möglich über ein breites Spektrum chemischer Möglichkeiten.
Mehrere Ansätze, um das Kristallisationsscreening so fruchtbar und gründlich wie möglich zu gestalten, wurden mit großem Erfolg untersucht, einschließlich spärlicher Matrices 13, unvollständiger faktorieller Screening 14, Additive 15, 16, Seeding 17 und Nukleierungsmittel 18. Das National HTX Center am Hauptman-Woodward Medical Research Institute (HWI) hat eine effiziente Pipeline für das Kristallisationsscreening unter Verwendung des Microbatch-under-Oil-Ansatzes19 entwickelt, die automatisierte Liquid-Handling- und Bildgebungsmodalitäten nutzt, um die Identifizierung anfänglicher Kristallisationsbedingungen bei vergleichsweise minimalen Proben- und Cocktailvolumina zu rationalisieren (Abbildung 1). Das Set von 1.536 einzigartigen Cocktails basiert auf Bedingungen, die zuvor als förderlich für das Wachstum von Proteinkristallen eingestuft wurden, und ist so konzipiert, dass sie chemisch vielfältig sind, um eine große Bandbreite möglicher Kristallisationsbedingungen zu testen20,21,22. Die breite Abtastung der Kristallisationsbedingungen erhöht die Wahrscheinlichkeit, eine oder mehrere Kristallisationsleitungen zu beobachten.
In der Literatur sind nur wenige formale Analysen darüber erschienen, wie viele Bedingungen für das Screening erforderlich sind. Eine Studie konzentrierte sich auf das Stichprobenlayout verschiedener Bildschirme und stellte fest, dass die Zufallsstichprobe von Komponenten (ähnlich einer unvollständigen Fakultät) die gründlichste und effizienteste Stichprobenmethode darstellte23. Eine andere Studie über das Screening stellte fest, dass es zahlreiche Fälle gegeben hat, in denen das sehr gründliche 1.536-Sieb nur einen Einkristalltreffer24 ergeben hat, und eine sehr aktuelle Studie hob hervor, dass die meisten kommerziellen Siebe den Kristallisationsraum, von dem bekannt ist, dass er mit Screening-Treffern25 in Verbindung gebracht wird, untermessen. Nicht alle Kristallisationsleitungen ergeben aufgrund der inhärenten Unordnung innerhalb des Kristalls, der Beugungsbeschränkungen oder der Kristallfehler einen Kristall mit Beugungsqualität, der für die Datenerfassung geeignet ist. Daher hat das Auswerfen eines breiteren Netzes für Bedingungen den zusätzlichen Vorteil, dass alternative Kristallformen für die Optimierung bereitgestellt werden.
Auch das Format der Proteinkristallisationsexperimente hat einen Einfluss auf den Erfolg des Screenings. Die Dampfdiffusion ist der am häufigsten verwendete Aufbau für Hochdurchsatz-Kristallisationsanwendungen und wird in hochmodernen Kristallisationszentren eingesetzt, darunter die Hochdurchsatz-Screening-Zentren des EMBL Hamburg und des Institut Pasteur26,27,28. Das HTX-Zentrum verwendet die Microbatch-under-Oil-Methode; Obwohl es weniger häufig verwendet wird, handelt es sich um eine robuste Methode, die den Verbrauch von Proben- und Kristallisationscocktails minimiert20,21,22. Ein Vorteil der Microbatch-unter-Öl-Methode, insbesondere bei Verwendung eines hochviskosen Paraffinöls, besteht darin, dass während des Versuchs nur eine geringe Verdunstung innerhalb des Tropfens auftritt, so dass die Gleichgewichtskonzentration beim Tropfenmischen erreicht wird. Wenn positive Kristallisationsergebnisse in der Mikrobatch-unter-Öl-Methode beobachtet werden, ist die Reproduktion dieser Bedingungen in der Regel einfacher als bei Dampfdiffusionsaufbauten, bei denen die Kristallisation an einem undefinierten Punkt während des Gleichgewichts zwischen dem Kristallisationstropfen und dem Reservoir stattfindet. Die Reproduzierbarkeit von Treffern ist wünschenswert für Hochdurchsatz-Kristallisationsansätze, die unerschwinglich kleine Proteinkristalle erzeugen, die typischerweise für Einkristall-Röntgenexperimente optimiert werden müssen.
Das Hochdurchsatz-Kristallisationssieb für lösliche Proteine besteht aus Cocktails, die im eigenen Haus zubereitet werden, vorgefertigten kommerziellen Sieben und intern modifizierten kommerziellen Sieben22. Die Cocktails wurden zunächst unter Verwendung der unvollständigen faktoriellen Strategie unter Verwendung zuvor erfolgreicher Kristallisationscocktailsentwickelt 20. Zu den kommerziell erhältlichen Reagenzien im Screening gehören Arrays von Polymeren, Kristallisationssalzen, PEG und Ionenkombinationen sowie Screens, die dünne Matrizen und unvollständige faktorielle Ansätze verwenden. Es gibt auch Reagenzien, die vor der Aufnahme in das Sieb modifiziert werden: ein Additiv-Screen, ein pH- und Puffer-Screen, ein Ionen-Flüssig-Additiv-Screening und ein Polymer-Screen.
Die Leistungsfähigkeit bekannter Kristallisationsbedingungen und -strategien wurde in den 1.536 Kristallisationscocktails zusammen mit den Vorteilen des Microbatch-under-Oil-Systems genutzt, um eine Pipeline zu erstellen, die automatisiertes Liquid Handling, automatisierte Hellfeld-Bildgebung und nichtlineare Bildgebung zweiter Ordnung von chiralen Kristallen (SONICC) einsetzt. Die Automatisierung sowohl des Liquid Handlings als auch der Bildgebung bietet die Vorteile von weniger Nasslaborstunden und höherer Reproduzierbarkeit. Der hohe Durchsatz des automatisierten Kristallisationsscreenings erfordert die Automatisierung des Prozesses der Überwachung des Kristallwachstums. Diese Fortschritte werden durch modernste Bildgebungstechnologien erreicht, die bei der Identifizierung positiver Kristalltreffer helfen. Sowohl die Standard-Hellfeld-Bildgebung von Platten als auch Multi-Photonen-Methoden zur verbesserten Detektion werden über ein Kristall-Bildgebungssystem mit SONICC verwendet (Abbildung 2). SONICC kombiniert die Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation (SHG)29 und die ultraviolette Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (UV-TPEF)30 , um sehr kleine Kristalle sowie solche, die durch Niederschlag verdeckt sind, zu detektieren. Die SONC-Bildgebung gibt Aufschluss darüber, ob die Wells Proteine (über UV-TPEF) und Kristalle (über SHG) enthalten. Über die positive Identifizierung von Proteinkristallen hinaus können auch mit modernsten bildgebenden Verfahren zusätzliche Informationen gewonnen werden. Die reine Cocktail-Bildgebung vor der Probenzugabe dient als Negativkontrolle; Anhand dieser Bilder kann das Erscheinungsbild des Bohrlochs vor der Probenzugabe identifiziert werden, auch in Bezug auf Salzkristalle und Ablagerungen. Darüber hinaus helfen SHG- und UV-TPEF-Bildgebung bei der Unterscheidung von Proteinkristallen von Salzkristallen und können zur Visualisierung von Protein-Nukleinsäure-Komplexmaterialverwendet werden 31.
Hochdurchsatz-Kristallisationsexperimente, die wiederholt durch Bildgebung überwacht werden, führen zu einer sehr großen Menge an Bildern, die untersucht werden müssen. Automatisierte Kristall-Scoring-Methoden wurden entwickelt, um den Anwender zu entlasten und die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, positive Kristalltreffer zu identifizieren. Das HTX Center beteiligte sich an der Entwicklung des MAchine Recognition of Crystallization Outcomes (MARCO) Scoring-Algorithmus, einer trainierten neuronalen Netzwerkarchitektur mit tiefer Faltung, die von einem Konsortium aus akademischen, gemeinnützigen, Regierungs- und Industriepartnern entwickelt wurde, um Hellfeld-Brunnenbilder zu klassifizieren32. Der Algorithmus wurde mit fast einer halben Million Hellfeldbildern aus Kristallisationsexperimenten mehrerer Institutionen mit unterschiedlichen Kristallisationsmethoden und unterschiedlichen Bildsensoren trainiert. Der Algorithmus gibt einen probabilistischen Score aus, der angibt, ob ein bestimmtes Bild in vier mögliche Bildklassen fällt: "crystal", "clear", "precipitate" und "other". MARCO hat eine gemeldete Klassifizierungsgenauigkeit von 94,5 %. Die Kristallerkennung wird durch eine Software weiter verbessert, die den Algorithmus implementiert und eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) für eine zugängliche und einfache Bildbetrachtung bietet, die mit den KI-fähigen Scoring-Funktionen 32,33 ermöglicht wird. Die MARCO Polo GUI ist so konzipiert, dass sie nahtlos mit der Einrichtung des Bildgebungs- und Datenmanagementsystems im HTX Center zusammenarbeitet, um Treffer auf dem 1.536-Well-Bildschirm zu identifizieren, wobei menschliches Engagement die Ausgabe sortierter Listen untersucht. Darüber hinaus ist die GUI als Open-Source-Software, die auf GitHub verfügbar ist, leicht verfügbar, um sie an die spezifischen Bedürfnisse anderer Laborgruppen anzupassen.
Hier wird der Prozess des Aufbaus eines Hochdurchsatz-Mikrobatch-unter-Öl-Experiments beschrieben, bei dem robotergestütztes Liquid Handling verwendet wird, um sowohl den Cocktail als auch das Protein zu liefern. Das HTX Center verfügt über eine einzigartige Auswahl an Instrumenten und Ressourcen, die in anderen Institutionen nicht zu finden sind, mit dem Ziel, interessierten Benutzern Screening-Dienste und Bildungsressourcen zur Verfügung zu stellen. Die Demonstration der Methoden und Fähigkeiten von robotergestützten Hochdurchsatztechniken wird es der Gemeinschaft ermöglichen, Kenntnisse über verfügbare Technologien zu erwerben und Entscheidungen für ihre eigenen Bemühungen zur Strukturbestimmung zu treffen.

<table><tbody><tr><td>1536 Well Imp@ct LBR LoBase</td><td>Greiner Bio-One</td><td>790 801</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-853</td><td></td></tr><tr><td>AlumaSeal II Siegelfolie</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-069</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbromid</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-247</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-691</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-855</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumnitrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-665</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumphosphat zweibasisch</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-629</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumphosphat monobasisch</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-555</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-541</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Thiocyanat</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-301</td><td></td></tr><tr><td>Bicin pH 9,0</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-723</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris Propan pH 7,0</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-993-08</td><td></td></tr><tr><td>Calciumacetat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-567</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-557</td><td></td></tr><tr><td>CAPS pH 10,0</td><td>Rigaku Reagenzien</td><td>keine gegeben</td><td></td></tr><tr><td>ClearSeal Film</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-521</td><td></td></tr><tr><td>Kobaltsulfat-Heptahydrat</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-42</td><td></td></tr><tr><td>Kristallsieb HT-Sieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Formulierer</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-623</td><td></td></tr><tr><td>Gryphon Liquid-Handling-Roboter</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,0</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-902-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,5</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-902-08</td><td></td></tr><tr><td>HWI HTX Center Probeneinreichungsformular</td><td></td><td></td><td>https://hwi.buffalo.edu/high-throughput-crystallization-screening-center-sample-submission-form/&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-581</td><td></td></tr><tr><td>Index HT Sieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>Ionic Liquid Sieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-214</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumbromid</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-312</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumchlorid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-631</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumsulfat Monohydrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-545</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetat-Tetrahydrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-561</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-559</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumnitrat-Hexahydrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-657</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-821</td><td></td></tr><tr><td>Manganchlorid-Tetrahydrat</td><td>Millipore Sigma</td><td>63535-50G</td><td></td></tr><tr><td>Mangansulfat-Monohydrat</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-310</td><td></td></tr><tr><td>MARCO Polo GUI download</td><td></td><td></td> https://hauptman-woodward.github.io/Marco_Polo/ <td></td></tr><tr><td>Matrix Platemate 2 x 3 Liquid-Handling-Roboter</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES pH 6,0</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-943-09</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito Liquid Handling Roboter</td><td>SPTLabtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffinöl/Weißes Mineralöl Saybolt Viskosität 340-365 bei 100 &deg; F&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PX0045-3</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-523</td><td></td></tr><tr><td>PEG 2000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-592</td><td></td></tr><tr><td>PEG 20000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-609</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-527</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-529</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-533</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-535</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion HT-Schirm</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRx HT-Schirm</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>Tellerreservierung</td><td></td><td></td><td>htslab@hwi.buffalo.edu</td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-671</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumbromid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-779</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumcarbonat</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-311</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-649</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumnitrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-663</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat dibasisch</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-635</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat-monobasisch</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-553</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat-dreibasisch</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-309</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumthiocyanat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-695</td><td></td></tr><tr><td>Rock Imager 1000 mit SONICC</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rock Imager 54</td><td>Formeltrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubidiumchlorid</td><td>Millipore Sigma</td><td>R2252-10G</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx HT Sieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Silver Bullets Sieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-096</td><td></td></tr><tr><td>Scheibe pH Sieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-070</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat pH 5,0</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-933-15</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbromid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-699</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-637</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat pH 4,2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-935-01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat pH 5,6</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-735</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-583</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Molybdat-Dihydrat</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD2-100-207</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-661</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-551</td><td></td></tr><tr><td>Natriumthiosulfat-Pentahydrat</td><td>Molekulare Abmessungen</td><td>MD-100-307</td><td></td></tr><tr><td>StockOptions Polymer-Sieb</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-227</td><td></td></tr><tr><td>Tacsimate pH 7</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-755</td><td></td></tr><tr><td>TAPS pH 9,0</td><td>bioWORLD</td><td>40121071</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-900-11</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8,5</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-725</td><td></td></tr><tr><td>ViaFLO 384</td><td>Integra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViaFLO 384 384 Kanal Pipettierkopf (0,5-12,5&Mikro; L)</td><td>Integra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViaFLO 384 96-Kanal-Pipettierkopf (300 Mikro; L)</td><td>Integra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zinkacetat-Dihydrat</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-563</td><td></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-screening zur gewinnung von kristalltreffern für die proteinkristallographie

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

Die Röntgenkristallographie ist die am häufigsten eingesetzte Technik zur Unterscheidung makromolekularer Strukturen, aber der entscheidende Schritt, ein Protein in ein geordnetes Gitter zu kristallisieren, das für Beugung geeignet ist, bleibt eine Herausforderung. Die Kristallisation von Biomolekülen ist weitgehend experimentell definiert, und dieser Prozess kann für Forscher an Einrichtungen mit begrenzten Ressourcen arbeitsintensiv und unerschwinglich sein. Im National High-Throughput Crystallization (HTX) Center wurden hochgradig reproduzierbare Methoden implementiert, um das Kristallwachstum zu erleichtern, einschließlich eines automatisierten Hochdurchsatz-1.536-Well-Mikrobatch-unter-Öl-Plattenaufbaus, der für die Entnahme einer breiten Palette von Kristallisationsparametern ausgelegt ist. Die Platten werden über einen Zeitraum von 6 Wochen mit modernsten Bildgebungsmodalitäten überwacht, um Einblicke in das Kristallwachstum zu erhalten und wertvolle Kristalltreffer genau zu unterscheiden. Darüber hinaus rationalisiert die Implementierung eines trainierten Scoring-Algorithmus mit künstlicher Intelligenz zur Identifizierung von Kristalltreffern in Verbindung mit einer benutzerfreundlichen Open-Source-Oberfläche zum Betrachten experimenteller Bilder den Prozess der Analyse von Kristallwachstumsbildern. Hier werden die wichtigsten Verfahren und Instrumente für die Herstellung der Cocktails und Kristallisationsplatten, die Abbildung der Platten und die Identifizierung von Treffern in einer Weise beschrieben, die die Reproduzierbarkeit gewährleistet und die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Kristallisation erhöht.

Die Ergebnisse des 1.536-Well-Kristallscreening-Experiments bestehen aus sieben vollständigen Hellfeld-Bildsätzen, die an Tag 0 (Negativkontrolle), Tag 1, Woche 1, Woche 2, Woche 3, Woche 4 und Woche 6 gesammelt wurden (Abbildung 4). Die SONICC-Bilder werden bei Platten, die bei 23 °C inkubiert werden, nach 4 Wochen und bei Platten, die bei 4 °C oder 14 °C inkubiert werden, zum Zeitpunkt von 6 Wochen aufgenommen. Insgesamt können die Benutzer nach dem Versand einer Probe davon ausgehen, dass ihre Platten innerhalb von 1 Tag nach Ankunft aufgestellt werden. Die Bilder werden hochgeladen, sobald sie gesammelt werden. Das Kristallisations-Screening-Experiment ist nach 6 Wochen abgeschlossen.
Der 1.536-Well-Plattenaufbau ermöglicht es, alle Screening-Experimente innerhalb derselben Platte durchzuführen, wodurch der Probenverbrauch begrenzt und die Bildgebung und der direkte Vergleich zwischen den Bildgebungsmodalitäten erleichtert wird. Repräsentative Ergebnisse für den zeitlichen Verlauf des Kristallwachstums für eine einzelne Cocktail-Bedingung sind in Abbildung 4 dargestellt. Die automatisierte Plattenabbildung während des gesamten Experiments ermöglicht die Identifizierung sowohl schnell als auch langsam wachsender Kristalle durch Hellfeld-Bildgebung. Die UV-TPEF- und SHG-Bildgebung ermöglichen eine Kreuzvalidierung der durch Hellfeld-Bildgebung beobachteten Treffer und zeigen, dass die beobachteten Kristalle proteinhaltig bzw. kristallin sind (Abbildung 5A,B). Darüber hinaus ermöglicht die SONICC-Bildgebung die Identifizierung von Kristallen, die visuell durch Niederschlag oder Filme (Abbildung 5C) oder Mikrokristalle verdeckt sind, die andernfalls mit Niederschlag verwechselt werden könnten (Abbildung 5D). Für einige Kristalle ist ein fehlendes SHG-Signal nicht disqualifizierend, da einige Punktgruppen kein SHG-Signalerzeugen 35,36, wie der tetragonale Thaumatinkristall in Abbildung 5C zeigt. Umgekehrt sollte ein fehlendes UV-TPEF-Signal für Proteine ohne Tryptophanreste erwartet werden. Die Beobachtung von UV-TPEF- und SHG-Signalen erleichtert auch die Identifizierung von Nicht-Protein-Salzkristallen, die im Hellfeld erscheinen und ein starkes positives SHG-Signal aufweisen, aber kein UV-TPEF-Signal aufweisen (Abbildung 5E).
Die Bildanalyse für das Platten-Setup wird durch die MARCO Polo GUI optimiert, die auch die FTP-Datenübertragung von den HWI-Servern bündelt (als Alternative zur Übertragung von Dateien mit FileZilla). Die MARCO Polo GUI ermöglicht eine leicht navigierbare Platten- und Bildbetrachtung und führt eine computergestützte Bildbewertung mit dem MARCO-Algorithmus durch, so dass die Bildergebnisse schnell vom HTX Center heruntergeladen, angezeigt und analysiert werden können. Der MARCO-Scoring-Algorithmus, wie er in der MARCO Polo GUI implementiert ist, ist in der Lage, Bilder von der gesamten 1.536-Well-Platte in weniger als 5 Minuten zu bewerten. Bilder, die vom MARCO-Algorithmus als kristallin gekennzeichnet wurden, können anschließend von der Polo-GUI für die Anzeige sortiert werden. Da der MARCO-Algorithmus für die Identifizierung von Kristallen und die Minimierung falsch negativer Ergebnisse optimiert wurde, um keine positiven Treffer zu verpassen, kann die Bewertung zu falsch positiven Flags führen. Nichtsdestotrotz führt die Fähigkeit von MARCO, die Menge der zu untersuchenden Bilder zu begrenzen, indem die Aufmerksamkeit auf die Vertiefungen gerichtet wird, die mit hoher Wahrscheinlichkeit Kristalle enthalten, zu einer erheblichen Verringerung des Datenverarbeitungsaufwands für die Benutzer. Die komfortable Implementierung des Algorithmus in die benutzerfreundliche MARCO Polo-Anzeigeplattform mit ihrer Fähigkeit, Bilder basierend auf MARCO-Scores zu sortieren, verbessert die Fähigkeit des Benutzers, den Datensatz schnell zu analysieren und Kristalltreffer genau zu bestimmen, erheblich.
<img alt="Diagramm der Proteinkristallisation: Setup- und Imaging-Prozess mit Roboter-Handlern, MARCO Polo-Analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Hochdurchsatz-Kristallisations-Screening-Experiments mit 1.536 Wells, das am HTX Center durchgeführt wurde. (1) In diesem Schritt werden 5 μl Paraffinöl und 200 nL Cocktail in jede Vertiefung gegeben (Protokollschritt 3.1 und Schritt 3.5). Auf der rechten Seite wird eine Cartoon-Illustration eines Brunnens gezeigt, der nur Öl und Cocktail enthält, sowie ein repräsentatives Bild. (2) Die Proben treffen im HTX Center ein (Protokollschritt 5.1). 3) In diesem Schritt werden 200 nL Probe in jede Vertiefung gegeben (Protokollschritt 5.4). (4) Alle 1.536 Wells werden über die Zeit mit Hilfe von Hellfeld-Bildgebung (5) sowie den UV-TPEF- und SHG-Modalitäten (Protokollschritt 6) überwacht. 6) Die KI-fähige Open-Source-GUI wird verwendet, um die Kristallisationsbilder anzuzeigen, zu bewerten und zu analysieren (Protokollschritt 7). Abkürzungen: HTX = Hochdurchsatzkristallisation; UV-TPEF = UV-Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz; SHG = Erzeugung der zweiten Harmonischen; KI = künstliche Intelligenz; GUI = grafische Benutzeroberfläche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Mikroplatten-Bildgebung: 7x sichtbar, UV-TPEF, SHG-Methoden zur Materialanalyse und optischen Anregung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Einzelne 1.536-Well-Platten mit Screening-Experimenten, aufgenommen mit Hellfeld-, UV-TPEF- und SHG-Bildgebung. Die 1.536-Well-Platten sind mit einem amerikanischen Penny als Maßstab dargestellt (oben). Jedes Screening-Experiment wird einmal vor dem Aufbau und sechsmal nach der Probenzugabe mit Hellfeld-Bildgebung abgebildet (insgesamt sieben Hellfeld-Bildsätze, links). Die Platten werden nach 4 oder 6 Wochen einer UV-TPEF- (Mitte) und SHG-Bildgebung (rechts) unterzogen. Abkürzungen: UV-TPEF = UV-Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz; SHG = Erzeugung der zweiten Harmonischen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="96-, 384- und 1536-Well-Plattentransferprozess; Diagramm, das die Einrichtung der Mikroplatte und das Datenmapping zeigt." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: Schematische Darstellung der Erzeugung der 1.536-Well-Platten. Sechzehn 96-Well-DW-Blöcke werden verwendet, um vier 384-Well-Platten auszustanzen, wobei jeder Quadrant jeder 384-Well-Platte durch die Abgabe von Kristallisationscocktails gefüllt wird. Vier 96-Well-DW-Blöcke füllen eine 384-Well-Platte (Mitte). Vier 384-Well-Platten werden verwendet, um die einzelne 1.536-Well-Platte (rechts) auszustanzen. Abkürzung: DW = Tiefbrunnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Hellfeldmikroskopische Wachstumsanalyse, SHG- und UV-TPEF-Fluoreszenzbilder, Wochenvergleich." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4: Repräsentativer zeitlicher Verlauf eines einzelnen Wells in einem Screening-Experiment mit 1.536 Wells. Die Platten werden vor dem Probenaufbau (Tag 0) sowie mit Hellfeldaufnahmen an Tag 1, Woche 1, Woche 2, Woche 3, Woche 4 und Woche 6 abgebildet. Die bei 23 °C inkubierten Platten werden in Woche 4 mit SONICC abgebildet. Maßstabsbalken = 80 μm (Hellfeld), 200 μm (SHG, UV-TPEF). Abkürzungen: SONICC = nichtlineare Abbildung chiraler Kristalle zweiter Ordnung; UV-TPEF = UV-Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz; SHG = Erzeugung der zweiten Harmonischen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Mikroskopische vergleichende Untersuchung von Kristallen; Hellfeld-, UV-TPEF- und SHG-Methoden; Skala 200μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65211/65211fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5: Repräsentative Bildgebungsergebnisse für die HT 1.536 Kristall-Screening-Experimente. Hellfeld-, UV-TPEF- und SHG-Bildgebungsergebnisse werden für fünf Beispielwells gezeigt. (A,B) Proteinkristalle, die durch Hellfeld-, UV-TPEF- und SHG-Bildgebung beobachtet werden, sind in allen drei Bildgebungsmodalitäten deutlich erkennbar. (C) Ein Proteinkristall, der in der Hellfeld-Bildgebung durch einen Film verdeckt wird, ist durch UV-TPEF-Bildgebung sichtbar; Der Kristall wird durch die SHG-Bildgebung aufgrund der Inkompatibilität der Punktgruppe nicht beobachtet. (D) Beispiel für Mikrokristalle, die durch UV-TPEF- und SHG-Bildgebung verifiziert wurden und ansonsten als Niederschlag angesehen werden könnten. (E) Beispiel für Salzkristalle, die durch Hellfeld- und SHG-Bildgebung kristallin erscheinen, aber kein UV-TPEF-Signal aufweisen. Maßstabsbalken = 200 μm. Brunnendurchmesser = 0,9 mm. Abkürzungen: UV-TPEF = UV-Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenz; SHG = Erzeugung der zweiten Harmonischen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/65211fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Öffnen von Bilddateien in MARCO Polo. Bilddateien können in der MARCO Polo GUI geöffnet werden, indem Sie auf den Menüpunkt Importieren | Registerkarte "Bilder" oben (a). Beachten Sie, dass Dateien auch über das Tool From FTP direkt in MARCO Polo (a) oder über FileZilla übertragen werden können, wie in Protokollschritt 7.2 beschrieben. Um Dateien zu importieren, die bereits heruntergeladen wurden, wählen Sie Bilder | Aus dem RAR-Archiv/Verzeichnis. Wählen Sie im angezeigten Popup-Fenster die Option Nach Ordner suchen (b) aus, und navigieren Sie zu dem Dateiverzeichnis, in dem die Plattenbilddateien gespeichert sind. Sobald sich die Dateien im Fenster "Ausgewählte Pfade" (c) befinden, markieren Sie eine Datei und klicken Sie auf "Ausführungen" importieren (d). Die MARCO Polo GUI identifiziert die korrekten Metadaten der Cocktail-Datei, die mit den Bildern importiert werden sollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65211/SuppFig1.png" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Kristallisationsscreening, das von der Vorbereitung der 1.536 Mikroassayplatten bis zum Ende eines 6-wöchigen experimentellen Zeitfensters reicht. Es werden Details über den Probenaufbau, die erhaltene Bildgebung und die Art und Weise enthalten, wie Benutzer Analysen mithilfe einer auf künstlicher Intelligenz basierenden grafischen Benutzeroberfläche durchführen können, um makromolekulare Kristallisationsbedingungen schnell und effizient zu identifizieren.

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Einen Kristall für Beugungsexperimente zu gewinnen, bleibt eine Herausforderung, da es schwierig ist, vorherzusagen, welche Parameter die Kristallisation beeinflussen werden. Wir bevorzugen den Experimentator, indem wir 1536 Kristallisationsbedingungen in einer einzigen Platte untersuchen und fortschrittliche Bildgebungstechnologien verwenden, um selbst die kleinsten Kristalltreffer zu identifizieren. Die Techniken der Strukturbiologie entwickeln sich rasant und das Gebiet wurde durch die computergestützte Strukturvorhersage revolutioniert.Dies hat dazu geführt, dass das Feld integrativer geworden ist, wobei mehrere experimentelle oder computergestützte Ansätze häufiger kombiniert werden, um eine detailliertere und genauere Darstellung biologischer Mechanismen zu erstellen. Das Erzeugen von Kristalltreffern ist ein wichtiger Schritt zur Durchführung von Einkristall-Röntgenbeugungsexperimenten und zur Entwicklung von Techniken wie Mikro-ED und serieller Kristallographie. Durch den Einsatz fortschrittlicher Bildgebungsmethoden helfen uns UVTBF und SHG zusammen mit der Leistungsfähigkeit des Marco-Algorithmus, nützliche Kristalle auf allen Größenskalen zu identifizieren.Unsere Hochdurchsatz-Kristallisationsmethoden haben eine große Menge an Daten generiert, um Fragen zur Effizienz von Kristallisationscocktailkomponenten zu untersuchen. Die spezialisierte Bildgebung zeigt, wie nichtlineare optische Methoden eingesetzt werden können, um verschwindend kleine Kristalle zu detektieren. Das Auffinden von Kristallisationsbedingungen ist entscheidend für kristallbasierte Strukturmethoden, die 90% aller Strukturmodelle in der Proteindatenbank ausmachen.Im Jahr 2021 wurden fast 2 Millionen Dateien pro Tag von der PDB heruntergeladen, was den Einfluss von Strukturen auf den Weg für weitere wissenschaftliche Untersuchungen unterstreicht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die 3-D-Struktur eines Moleküls liefert ein einzigartiges Verständnis dafür, wie das Molekül Funktionen. Die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung in nahezu atomarer Auflösung ist Röntgenstrukturanalyse. Hier zeigen wir die aktuellen Methoden zur Gewinnung von dreidimensionalen Kristallen von jedem Makromolekül, die sich für die Strukturbestimmung mittels Röntgen-Kristallographie.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine ​​(MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung,...

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für zufällige microseed Matrix-Screening. Diese Technik wird gezeigt, dass die Erfolgsrate der Proteinkristallisation Screening-Experimenten deutlich erhöhen, reduzieren die Notwendigkeit für Optimierung, und bieten eine zuverlässige Versorgung von Kristallen für die Datenerhebung und-Ligand-Einweichen Experimenten.

Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Ansätze für die biophysikalischen und strukturelle Charakterisierung von Glykoproteinen präsentieren wir mit der Immunglobulin-Falte Biolayer Interferometrie, Isothermen Titration Kalorimetrie und Röntgen-Kristallographie.

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Erzeugung von Proteinkristallen dar, die mit I3C (5-Amino-2,4,6-Triiodoisophthalsäure) mit Mikrosaatierung zur Erzeugung neuer Kristallisationsbedingungen in spärlichen Matrix-Bildschirmen deaktiviert werden. Die Schalen können mit Flüssigkeitsdosierrobotern oder von Hand aufgestellt werden.

Ableitung von Proteinkristallen mit I3C mit Random Microseed Matrix Screening

Das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin erfolgt über einen Workflow mit dedizierten Compound-Bibliotheken, Kristall-Handling-Tools, schnellen Datenerfassungsmöglichkeiten und weitgehend automatisierter Datenanalyse. Das vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, den Output solcher Experimente zu maximieren, um vielversprechende Ansatzpunkte für das nachgelagerte strukturbasierte Ligandendesign zu schaffen.

Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin

Dieser Artikel beschreibt den kompletten XChem-Prozess für kristallbasiertes Fragment-Screening, beginnend mit der Beantragung des Zugangs und allen nachfolgenden Schritten bis hin zur Datenverbreitung.

Effizientes Fragment-Screening in der XChem-Anlage an der Diamond Light Source

Hier beschreiben wir, wie die automatisierten makromolekularen Kristallographie-Pipelines für Protein-zu-Struktur, schnelle Liganden-Protein-Komplex-Analyse und großflächiges Fragment-Screening basierend auf der CrystalDirect-Technologie im HTX-Labor in EMBL Grenoble verwendet werden können.

Die automatisierten Kristallographie-Pipelines in der EMBL HTX-Anlage in Grenoble

Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen einfachen Ansatz für das Screening der Proteinkristallisationsbedingungen und des Kristallwachstums unter Verwendung einer 96-Well-Hochdurchsatz-Dialyseplatte. Der Einsatz von Dialysatorröhrchen für die großskalige Züchtung von Mikrokristallen wird auch für serielle Kristallographie und MicroED-Anwendungen demonstriert.

Hochdurchsatz-Proteinkristallisation mittels Mikrodialyse

Wir präsentieren ein Protokoll für die Kristallisation von Proteinen unter Verwendung der Kristallisationsanlage im Forschungskomplex in Harwell und die anschließende in-situ-Röntgenkristallographie-Datenerfassung von Kristallen innerhalb der Platten an der Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) Beamline von Diamond.  Wir beschreiben Probenanforderungen, Kristallisationsprotokolle und Richtlinien für die Datenerfassung.

Kristallisations- und In-situ-Raumtemperatur-Datenerfassung mit der Kristallisationsanlage in Harwell und der Beamline VMXi, Diamantlichtquelle

Erfahren Sie Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie mit UV-TPF- und SHG-Bildgebung sowie KI-gestützter Analyse. Diese Methode optimiert die Identifizierung von Kristallisationsbedingungen für strukturbiologische Forschung.

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

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