Name: Eine Eins mit den 3Cs bekommen: Erfassung der Chromosomenkonformation für Studenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Lernen Sie die Chromosomenkonformationserfassung (3C) zur Untersuchung der Chromatinorganisation und Genexpression in C. elegans. Diese Methode ermöglicht Studenten praktische Forschungserfahrung in der Molekularbiologie.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM103430 und des Bryant Center of Health and Behavioral Sciences unterstützt.

Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) für Forschung und Lehre im Grundstudium

<ol><li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92(2014).</li>
<li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li>
<li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li>
<li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li>
<li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).</li>
<li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li>
<li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li>
<li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromatin+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li>
<li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li>
<li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li>
<li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li>
<li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning%3A+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li>
<li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li>
<li>Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley</a>. , PhD thesis (2012).</li>
<li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li>
<li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li>
<li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li>
<li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture%2C+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%26%2334%3BC%26%2334%3B+s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The three &#34;C&#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My5C%3A+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die 3C ist eine leistungsfähige Technik, die auf grundlegenden molekularen Techniken beruht. Es ist diese Grundlage grundlegender Werkzeuge, die 3C zu einer so faszinierenden Technik für Studenten macht. Bei so vielen neueren Studien, die die Chromatindynamik auf einer so breiten Skala beobachten, hat die Verwendung dieser Ergebnisse zur Entwicklung eines eng fokussierten Experiments an einem einzelnen Gen oder einer Genomregion das Potenzial, ein einzigartiges und wirkungsvolles Experiment in der Bachelor-Forschung zu schaffen. Oft werden solche Experimente als zu fortgeschritten für Studenten angesehen, aber mit sorgfältiger Planung sind sie leicht durchführbar. Es ist wichtig zu beachten, dass die Assays, die zur Untersuchung der von der 3C-Bibliothek erfassten Chromatinverbindungen entwickelt wurden, von der semiquantitativen Endpunkt-PCR bis zur Sequenzierung des gesamten Genoms variieren können. Tatsächlich wurden die Daten aus dem ersten 3C-Paper16 aus der qPCR generiert. Diese breite Palette von Assays kann alle verwendet werden, da alle 3C-Technologien das gleiche Produkt erzeugen - eine Bibliothek von DNA-Fragmenten, die 3D-Verbindungen im Zellkern darstellen.
Hier wird eine Adaption eines flexibleren und entgegenkommenderen Protokolls vorgestellt, das besser für Forscher im Grundstudium geeignet ist. Die oben aufgeführten Pausenzeiten implizieren nächtliche Verspätungen; Diese Pausen können sich jedoch über Wochenenden und im Falle der Zellen und Zellkerne über Wochen erstrecken. Die wichtigste Überlegung ist, wann die Arbeit erledigt wird. Oft gibt es in Protokollen zeitkritische Schritte, bei denen ein Anhalten keine Option ist. Abgesehen von einigen wenigen Punkten (Tag 1 und Tag 2) gibt es viele Stellen, an denen man anhalten und die Probe einfrieren kann. Diese sind von entscheidender Bedeutung, wenn Sie mit Studenten arbeiten, bei denen die Zeitpläne und Zeiten der Laborarbeit flexibel sein müssen. Zusätzlich zur Aufnahme dieser Stopps in das Protokoll werden die Studenten ermutigt, zu zweit oder sogar in kleinen Gruppen von drei oder vier Personen zu arbeiten. Gruppen eignen sich gut für dieses Protokoll, da sich die Schüler gegenseitig unterstützen und ein Buddy-System erstellen können, damit alle sicher arbeiten können. Auch die Arbeit im Labor macht mit anderen Beteiligten mehr Spaß. In Gruppen können die Schüler auch an einer Vielzahl von Fragen arbeiten, die sich auf die Organisation des Chromatins konzentrieren, während sie immer noch das gleiche Protokoll durchführen. Selbst wenn die Schüler an separaten Projekten arbeiten, verknüpft das Protokoll ihre Bemühungen, und so können sie sich gegenseitig unterstützen.
Andere Anpassungen sollen die Tatsache umgehen, dass bestimmte spezialisierte Werkzeuge und Geräte nicht unbedingt in allen Hochschulen zu finden sind. Zu diesen Geräten gehören unter anderem qPCR-Thermocycler, Geldokumentationssysteme und Nanovolumenspektrometer. In der Tat sind diese Ausrüstungsgegenstände praktisch, aber keine Voraussetzung. Hier wird auch die klassische Methode von 3C im Primer-Design-Teil beschrieben; Dabei geht es darum, einen interessierenden genomischen Locus zu identifizieren und daraus andere genomische Loci für weiter entfernte Chromatin-Kontaktpunkte zu untersuchen. Diese Technik funktioniert auch gut, wenn ein veröffentlichter Datensatz verwendet wird, z. B. ein Datensatz mit Hi-C, bei dem bekannte positive (verbindende) und negative (nicht verbindende) Loci identifiziert werden. Das Design von Experimenten mit diesen veröffentlichten Datensätzen ist eine weitere großartige Anpassung für Lehrlabore, da die Chance auf die erfolgreiche Identifizierung von Chromatinverbindungen in der Regel größer ist. Darüber hinaus kann der Forschungsartikel im Unterricht diskutiert und als Referenz verwendet werden.
Dieses Protokoll verwendet einen modifizierten qPCR-Ansatz, um die 3C-Produktbildung zu visualisieren. Kontrollen sind für den Erfolg der 3C-Technik unerlässlich. Bei jedem Experiment werden sowohl Probenkontrollen als auch Primerkontrollen verwendet, um den Abschluss des 3C-Verfahrens zu bestimmen. Die Probenkontrollen umfassen eine unverdaute Kontrolle (genomische DNA) und eine verdaute Kontrolle. Die unverdaute Kontrolle bestimmt das Basisliniensignal für die Primer-Sets und wird zusammen mit der vernetzten Aufschlusskontrolle verwendet, um die Aufschlusseffizienz zu bestimmen. Es wird erwartet, dass es bei allen Primern, die über eine Restriktionsstelle gerichtet sind, zu einem Produktabfall kommt. Der Vergleich dieses Wertes mit der unverdauten Kontrolle gibt Aufschluss darüber, wie gut die Probe verdaut wurde.
Die Primer für die PCR umfassen einen Kontrollprimer und Testprimer. Der Kontrollprimer ist ein Primer-Set, das sich in der Nähe der zu untersuchenden Genomregion befindet und keine Restriktionsstelle enthält. Dies bildet die Grundlage für die Bestimmung der Häufigkeit der PCR-Produkte des Testprimers. Testprimer sind Vorwärts- und Rückwärtsprimer, die eine Restriktionsstelle für einen bestimmten genomischen Locus von Interesse flankieren (Abbildung 3). Reaktionen mit diesen Primer-Sets werden verglichen, um die Aufschlusseffizienz zu bestimmen, da die Produktfülle sinken sollte, wenn die Restriktionsstelle geschnitten wurde. Bei der Bestimmung der Chromatinorganisation wird ein Testprimer von einem Locus mit einem anderen Testprimer aus einem anderen genomischen Locus gepaart, um festzustellen, ob diese beiden Loci im 3D-Raum nahe beieinander liegen. In diesem Fall wird erwartet, dass ein PCR-Produkt nur anhand der 3C-Probe als Vorlage gefunden wird.
Es ist wichtig zu beachten, dass auch validierte Primer zum Versagen neigen (Abbildung 4: r14-Primer-Set). Darüber hinaus werden PCR-Produkte häufig in Kontrollreaktionen und in Reaktionen identifiziert, bei denen eine Chromatinverbindung nicht vorhergesagt wird (wie z.B. die verdaute Kontrolle, da sie nicht ligiert ist). Diese Instanzen werden sequenziert und bestehen entweder die Sanger-Qualitätssicherung nicht oder werden ohne definierte Sequenz zurückgegeben (Abbildung 5). Darüber hinaus erzeugen herkömmliche 3C-Experimente eine "Kontrollschablone", eine unvernetzte, verdaute und ligierte DNA-Probe, die alle möglichen ligierten Fragmente darstellt, die mit einer bestimmten DNA-Menge hergestellt werden können. Das "Kontrolltemplate" spielt eine wichtige Rolle beim Vergleich der Intensitäten von qPCR-Signalen zwischen zwei genomischen Loci, um festzustellen, ob das Signal eine echte Interaktion oder nur eine zufällige Assoziation darstellt. Die Erstellung einer "Kontrollmatrize" kann problematisch sein, da ein großer Teil des zu untersuchenden Chromatins in Form eines künstlichen Chromosoms erfasst und zusammen mit den 3C-Proben verarbeitet werden muss. Die Sicherung eines solchen Konstrukts ist möglicherweise nicht möglich, und die Erstellung eines solchen Konstrukts könnte außerhalb des Rahmens eines Semesterprojekts liegen. Aufgrund dieser Schwierigkeiten empfehlen wir die Verwendung einer Kontrollgrundierung. Der Kontrollprimer ersetzt nicht alle Funktionen der "Kontrollvorlage", bietet aber dennoch die Möglichkeit, die Daten zu analysieren, um "Anwesenheit" oder "Abwesenheit" zu bestimmen.
Bei der Durchführung der qPCR ist es wichtig, gleiche Mengen der Probe zu verwenden. Dies sollte auch bei Verwendung eines Nano-Spektralphotometers wie eines Nanotropfens bestimmt werden, indem eine Standardkurve aus genomischer DNA einer bekannten Konzentration erzeugt und die 3C-Proben an diese Linie angepasst werden. Diese Mengen sollten aufgezeichnet und in nachfolgenden PCRs verwendet werden. Wichtig ist auch die Qualität der PCR-Reaktion. Da die PCR in der qPCR läuft, wird die Produkthäufigkeit mittels Fluoreszenz gemessen und aufgezeichnet. Diese Aufnahme ist im Verstärkungsdiagramm zugänglich. Sobald das Programm beendet ist, ist es wichtig, das Amplifikationsdiagramm zu überprüfen und sicherzustellen, dass die Reaktionen (mit Ausnahme der Kontrollen ohne Vorlage) drei Phasen haben: eine Basislinie, eine Exponential- und eine Plateau-/Sättigungsphase. Es ist wichtig zu überprüfen, ob die Reaktionen eine exponentielle Phase haben, insbesondere für die Einstellung des Schwellenwerts (siehe unten). Darüber hinaus sollte bei seriell verdünnten Proben eine Verschiebung der Ct-Werte auftreten, die mit der Verdünnung der Probe übereinstimmt (die höchste Konzentration hat die niedrigsten Ct-Werte, während die niedrigste Konzentration die höchsten Ct-Werte aufweist). Proben, die diese Änderung im Amplifikationsdiagramm nicht widerspiegeln, erfordern eine neue Verdünnung oder weisen auf ein größeres Problem mit der 3C-Probenbildung hin. Schließlich berechnet die PCR-Software bei der Erstellung der Standardkurve die PCR-Effizienz und denR2-Wert . Die PCR-Effizienz sollte größer als 90 % und derR2-Wert größer als 0,99 sein. Wenn eine dieser Bedingungen nicht erfüllt ist, ist es wahrscheinlich, dass etwas mit der Probe oder den PCR-Primern nicht stimmt.
Nach der qPCR können der prozentuale Aufschluss und das Vorhandensein von 3C-Wechselwirkungen mit der qPCR Ct für jede Reaktion berechnet werden. Um diese zu bestimmen, muss zunächst der Schwellenwert für die PCR-Reaktion festgelegt werden. Dies geschieht normalerweise mit der Software, die mit dem qPCR-Gerät geliefert wird. Durch das Festlegen des Schwellenwerts wird die Konzentration des PCR-Produkts definiert, die zum Vergleich der Ct-Werte der Probe verwendet wird. Der Schwellenwert sollte die Amplifikationskurven der PCR-Reaktionen in der exponentiellen Phase der Amplifikation halbieren. Es können nur PCR-Reaktionen mit exponentieller Amplifikation verglichen werden (in diesem Fall die Kontrollprimer und die Testprimerreaktionen), da nur so sichergestellt werden kann, dass die Reaktionen die DNA mit der gleichen Geschwindigkeit amplifizieren und originalgetreu verglichen werden können. Bei der Analyse der 3C-Diagramme werden bedingt positive Reaktionen als solche mit mehr Produkt als die Kontrollproben, die genomische Kontrolle und die Verdauungskontrolle identifiziert (Abbildung 4B). Diese Proben müssen jedoch nach der Gelaufreinigung des PCR-Produkts mittels Sanger-Sequenzierung weiter validiert werden.
Nach der Sanger-Sequenzierung können Proben, die die Qualitätskontrolle bestehen, mit Blat. Das Ziel dieser Analyse ist es, festzustellen, ob die Probe die Sequenz beider genomischer Zielorte aufweist, die die Restriktionsstelle flankieren (DpnII im Falle dieses Protokolls). Wenn beide Sequenzen identifiziert sind, kann das 3C-Fragment als validiert betrachtet werden. Wenn die Ergebnisse des Blat nicht die erwartete Sequenz zurückgeben, kann dies darauf hindeuten, dass einer oder beide Primer nicht optimal sind, was zu einem falsch positiven qPCR-Ergebnis führt. Die Ablaufverfolgungsdateien für die falsch positiven Proben weisen undefinierte Basisspitzen auf, und die Seq-Berichte enthalten hauptsächlich "n" Basisaufrufe.
Die Sanger-Validierung ist unerlässlich, da falsch positive Ergebnisse aus der künstlichen PCR-Produktbildung möglich sind. Diese falsch positiven Ergebnisse können identifiziert werden, wenn die Sequenzierungsprodukte nicht die erwartete Zielsequenz oder eine DpnII-Stelle aufweisen, die für ein geeignetes 3C-Fragment charakteristisch ist (Abbildung 5). Die Sequenzierung der PCR-Fragmente liefert auch einen weiteren Datenpunkt für das Experiment und macht den Studenten klar, dass die 3C-Technik entfernte genomische Loci identifiziert, die im 3D-Raum innerhalb der Zellkerne zusammenkommen.
Die 3C-Technik bietet eine Fülle grundlegender molekularer Techniken für Studenten in einem flexiblen, unkomplizierten Verfahren. Diese 3C-Technik ist auch ein Ausgangspunkt für die anderen 3C-Techniken, die Next-Generation-Sequencing (NGS) beinhalten. Diese Art von Experimenten kann Studenten mit wichtigen Aspekten der Bioinformatik vertraut machen und ist in den hier skizzierten Grundprinzipien verwurzelt. Erfahrung und Engagement im Grundstudium sind der Schlüssel zu ihrem Erfolg und ihrer Entwicklung als junge Wissenschaftler. Durch die Bereitstellung dieser Möglichkeiten können Studenten ihr Verständnis der Grundprinzipien stärken und gleichzeitig ihr Selbstvertrauen aufbauen, um modernste Techniken und Fragen anzugehen.

Das Genom eines Organismus enthält nicht nur alle Gene, die für die Funktion erforderlich sind, sondern auch alle Anweisungen, wie und wann sie zu verwenden sind. Das macht die Regulierung des Zugangs zum Genom zu einer der wichtigsten Funktionen der Zelle. Es gibt viele Mechanismen, um die Genfunktion zu steuern. Im Grunde beruht die Genregulation jedoch auf der Fähigkeit regulatorischer Transkriptionsfaktoren (trans-Faktoren), an ihre spezifischen DNA-Sequenzen (cis-regulatorische Sequenzen) zu binden. Dies ist keine angeborene Fähigkeit; Stattdessen wird sie durch die Organisation/Struktur des Genoms im Zellkern bestimmt, die die Verfügbarkeit/Exposition der cis-regulatorischen Sequenzen gegenüber den trans-Faktoren 1,2,3 steuert. Wenn die Transfaktoren ihre cis-regulatorischen Sequenzen nicht finden können, dann können die Transfaktoren ihre regulatorischen Aufgaben nicht erfüllen. Dies hat das Verständnis, wie Genome im Zellkern organisiert sind, zu einer wichtigen Quelle für die Forschung gemacht.
Es ist allgemein anerkannt, dass eukaryotische Chromosomen im Zellkern während der Interphase ihre eigene Domäne besetzen, die an der Kernlamina und der Kernmatrix verankert ist (Abbildung 1), wodurch das Chromosom eher wie ein Stück Pizza als wie eine Nudel auf einem Teller Spaghetti aussieht. Chromosomen werden teilweise durch Protein-DNA-Interaktionen (Chromatin) kondensiert, die Teile des Chromosoms verdrehen und schlängeln. Durch Elektronenmikroskopie, dreidimensionale DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und DNA-Markierungstechniken (d. h. Fluoreszenz- und künstliche DNA-Methylierung) wurde festgestellt, dass inaktive Chromatindomänen entlang der Kernperipherie dicht gepackt sind 4,5,6, während Teile von aktivem, weniger kondensiertem Chromatin im Inneren des Zellkerns gefunden werden 7,8,9, 10. Sonstiges Diese Experimente bieten einen Weitwinkelblick auf die Chromosomendynamik, tragen aber wenig dazu bei, die Veränderungen zu erfassen, die lokal um die Genpromotoren herum auftreten, die in Studien zu DNase11,12 und Nukleosom13,14,15 beobachtet wurden.
Der Schlüssel zur Erschließung einer höher aufgelösten Chromatindynamik war die Formulierung der 3D-Chromosomen-Kartierungstechnik 3C. Die 3C-Technik selbst besteht aus vier Hauptschritten: Vernetzung des Chromatins, Chromatinverdau durch Restriktionsenzyme, Chromatinligation und DNA-Reinigung (Abbildung 2). Die neuen künstlichen DNA-Fragmente, die durch diesen Prozess erzeugt werden, können dann charakterisiert werden, um die enge physikalische Verbindung zwischen linear entfernten DNA-Stücken aufzudecken16. Die 3C-Technik wurde zur Grundlage für die Entwicklung mehrerer Spin-off-Techniken, die die ersten Schritte von 3C nutzen, um breitere genomweite Fragen zu stellen (z. B. Hi-C, 4C, ChIP-C). Diese Familie von 3C-Techniken hat gezeigt, dass Chromosomen in mehreren diskreten Einheiten organisiert sind, die als topologisch assoziierte Domänen (TADs) bezeichnet werden. TADs sind im Genom kodiert und werden durch Chromatinschleifen definiert, die von ungeschliffenen Grenzen16,17,18,19 flankiert werden. Die TAD-Grenzen werden durch zwei evolutionär konservierte und ubiquitäre Faktoren aufrechterhalten, darunter der CCCT-Bindungsfaktor (CTCF) und die Kohäsion, die verhindern, dass Schleifen innerhalb separater TADs interagieren16,20. Die Schleifen werden durch die Interaktion von trans-Faktoren mit ihren regulatorischen Sequenzen sowie CTCF und Kohäsion vermittelt21.
Obwohl viele Studien mit 3C-Technologien breite genomweite Fragen stellen und komplizierte Probenentnahmetechniken anwenden, basiert die Formulierung der 3C-Technik auf grundlegenden molekularbiologischen Techniken. Dies macht 3C für den Einsatz sowohl in Forschungs- als auch in Lehrlabors interessant. Die 3C-Technik kann für kleinere fokussierte Fragen eingesetzt werden und ist von Natur aus flexibel für die Skalierung nach oben oder unten (einzelne Gene22, Chromosomen16 und/oder Genome18), je nach Fokus und Richtung der gestellten Fragen. Diese Technik wurde auch auf eine Vielzahl von Modellsystemen 7,16,19,23 angewendet und hat sich in ihrer Anwendung als vielseitig erwiesen. Dies macht 3C zu einer hervorragenden Technik für Studenten, da die Studierenden Erfahrungen in gängigen molekularbiologischen Techniken sammeln und gleichzeitig wertvolle Erfahrungen bei der Beantwortung gezielter Fragen sammeln können.
Hier wird ein angepasstes Protokoll für die Herstellung von 3C-Bibliotheken vorgestellt, das auf den zuvor veröffentlichten Protokollen24,25,26,27 basiert. Dieses Protokoll wurde für ca. 1 × 107 Zellen optimiert, obwohl es 3C-Bibliotheken mit nur 1 × 105 Zellen generiert hat. Dieses Protokoll hat sich als vielseitig erwiesen und wurde verwendet, um 3C-Bibliotheken aus Zebrafischembryonen, Zebrafischzelllinien und Caenorhabditis elegans (Fadenwurm) für junge Erwachsene (YA) zu generieren. Das Protokoll sollte auch für Säugetierzelllinien und, mit weiterer Anpassung, für Hefen geeignet sein.
Das Ziel dieser Anpassungen ist es, 3C für Studenten zugänglicher zu machen. Es wurde darauf geachtet, Techniken zu verwenden, die denen ähneln, die in einem Lehrlabor für Studenten durchgeführt werden können. Die 3C-Technik bietet Studenten viele Lernmöglichkeiten, um grundlegende molekularbiologische Techniken zu erlernen, die ihrer Entwicklung am Labor, im Klassenzimmer und in ihren Bemühungen nach dem Abschluss zugute kommen.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyd&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Millapore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MP Biomedizinisches</td><td>215350280</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Millapore-Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Millapore-Sigma</td><td>COEDTAF-RO</td><td>gemischt auf 50x in Wasser. Verdünnt auf 1x in Saccharosepuffer und GB-Puffer frisches</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>D0632</td><td>1 M Aktien, verdünnt auf 500 &; Mikro; M in Saccharosepuffer und GB-Puffer frisch</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>NEB</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Millapore-Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millapore-Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>methylgrünes Pyronin&nbsp; &nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>HT70116</td><td></td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>Thermowissenschaftliche</td><td>1222530</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Phenol-Chloroform&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millapore-Sigma</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05406</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Fertigmischung (Phire Taq etc)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>KCQS07</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>108319</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

eine eins mit den 3cs bekommen: erfassung der chromosomenkonformation für studenten

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Die Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das eine Familie ähnlicher Techniken hervorgebracht hat (z. B. Hi-C, 4C und 5C, hier als 3C-Techniken bezeichnet), die detaillierte Informationen über die dreidimensionale Organisation des Chromatins liefern. Die 3C-Techniken wurden in einer Vielzahl von Studien eingesetzt, von der Überwachung der Veränderungen in der Chromatinorganisation in Krebszellen bis hin zur Identifizierung von Enhancer-Kontakten mit Genpromotoren. Während viele der Studien, die diese Techniken verwenden, große genomweite Fragen mit komplizierten Probentypen stellen (z. B. Einzelzellanalyse), geht oft verloren, dass die 3C-Techniken auf grundlegenden molekularbiologischen Methoden basieren, die auf einem breiten Spektrum von Studien anwendbar sind. Durch die Behandlung von eng fokussierten Fragen der Chromatinorganisation kann diese hochmoderne Technik verwendet werden, um die Forschungs- und Lehrlaborerfahrung im Grundstudium zu verbessern. Dieser Beitrag stellt ein 3C-Protokoll vor und bietet Anpassungen und Schwerpunkte für die Implementierung an primär grundständigen Einrichtungen in Forschung und Lehre.

Bei diesem Verfahren werden eine experimentelle 3C-Probe und zwei Kontrollproben (unverdaut und verdaut) erzeugt. Mit diesen drei Proben wurde eine qPCR durchgeführt. Aus diesen Ergebnissen wurde der Aufschlusswirkungsgrad berechnet (Gleichung 1) und aufgezeichnet (Tabelle 1). Aus diesen Berechnungen wurde ermittelt, dass die 3C-Probe eine Verdauungseffizienz von etwa 88 % (Durchschnitt von Tabelle 1) über die sieben getesteten genomischen Loci aufwies.
Als nächstes wurden die Proben auf das Vorhandensein von langreichweitigen Chromatinkontakten zwischen den verschiedenen genomischen Loci untersucht, wobei Kombinationen aus Loci-spezifischen Primern (Tabelle 2) und qPCR verwendet wurden. Anhand dieser Ergebnisse wurden die Produkthäufigkeiten relativ zu einem Kontrollprimer-Set berechnet (Gleichung 2) und zum Vergleich grafisch dargestellt (Abbildung 4). Diese Daten deuten darauf hin, dass 8 der 10 Reaktionen bedingt positiv für langreichweitige Interaktionen waren.
Die PCR-Reaktionen wurden dann auf einem Agarose-Gel durchgeführt. Das erwartete PCR-Produkt für die acht bedingt positiven und eine negative Reaktion wurde gelgereinigt und zur Sanger-Sequenzierung geschickt. Die Ergebnisse für repräsentative positive (blauer Pfeil, blauer Kasten) und negative (roter Pfeil, roter Kasten) Reaktionen sind dargestellt (Abbildung 5).
<img alt="Diagramm der Proteinfaltung; Veranschaulicht Strukturänderungen von ungefalteten zu gefalteten Zuständen mit Anmerkungen." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Chromosomenstruktur im Zellkern. Hypothetische Chromosomenorganisation im Zellkern. (A) Kernhülle, schwarze Linien; (B) Kernschicht, orange; (C) Heterochromatin, verdichtete Linien; (D) Euchromatin, lose Schleifen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Chromosomen-Crossover-Diagramm; veranschaulicht die genetische Rekombination, den Prozess des Chromatidaustauschs." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Schematische Darstellung des 3C-Protokolls. Entfernte Anteile linearer Chromosomen (blau, gelb und rosa) werden innerhalb des Zellkerns durch regulatorische Schleifen nahe zusammengebracht. (A) Die Schleifenstrukturen werden durch Transkriptionsfaktoren (grauer Kreis und schwarzer Stern) vermittelt; Diese Wechselwirkungen bleiben durch chemische Vernetzung erhalten. (B) Die Schleifen werden durch enzymatische Verdauung unterbrochen (schwarze Linien). (C) Entfernte Chromatinstücke werden durch die durch die Verdauung entstehenden Enden zusammengefügt. (D) Die DNA wird von Proteinen gereinigt. (E) Die Sequenz innerhalb der Fragmente wird identifiziert und auf das Genom zurückgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Chromosomendiagramm, DpnII-Stellen, RepeatMasker-Daten, Genkartierung, genomische Sequenzanalyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: Das 3C-Primer-Schema. Die 3C-Primer sind um Restriktionsstellen herum in unterschiedlichen Abständen von der interessierenden genomischen Stelle konzipiert. Die rosafarbenen Pfeile stellen die experimentellen Primer-Sets dar, die eine DpnII-Stelle umgeben. Die experimentellen Primer können gemischt und aufeinander abgestimmt werden, um die Chromatinschleife in der Region zu beurteilen. Die orangefarbenen Primer stellen eine Negativkontrolle ohne DpnII-Stelle dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Balkendiagramme zum Vergleich der Testprimer-Gehalte in unverdauten und verdauten gDNA-Proben, 3C-Ergebnisse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4: Repräsentative qPCR-Daten für ein 3C-Experiment. Relative Häufigkeit der 3C-Testprimer-Sets. (A) Kontrolldiagramm, das die relative Häufigkeit des Produkts in der unverdauten Kontrolle (blau), der verdauten Kontrolle (grau) und der 3C-Probe (orange) zeigt. (B) Das 3C-Experiment; die relative Häufigkeit des Produkts aus Kombinationen von Testprimern in der unverdauten Kontrollprobe (blau), der verdauten Kontrolle (grau) und der 3C-Probe (orange). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Ergebnis der Elektrophorese und Sequenzierung; Analyse von DNA-Fragmenten; enzymatische Verdauung; genetische Studie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5: Visualisierung der 3C-qPCR-Produkte. Oben, Gel mit den qPCR-Endpunktprodukten mit den angegebenen Proben. Unten, repräsentative Sanger-Sequenz-Trace-Dateien für die angegebenen Reaktionen. Die orangefarbene Probe ist ein Beispiel für ein falsch positives Ergebnis (siehe Abbildung 4, r38/34), und die blaue Probe ist ein Beispiel für ein richtig positives Ergebnis mit der DpnII-Stelle, die über der Spur angegeben ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Platz</td>
			<td>% Verdauung</td>
		</tr><tr><td>R8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>R3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>R38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>R34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>R33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>R14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>R47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Berechnete Aufschlusseffizienz.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name</td>
			<td colspan="3">Reihenfolge</td>
			<td>Genomische Loci</td>
		</tr><tr><td>r3 Frontantrieb</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 Frontantrieb</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 Frontantrieb</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 Frontantrieb</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 Frontantrieb</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 Frontantrieb</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 Frontantrieb</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>Zündhülse FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>Primer zur Kontrolle RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Primer für das repräsentative 3C-Experiment.

Hier stellen wir eine Adaption der Technik zur Erfassung der Chromosomenkonformation (3C) im Detail vor, wobei der Schwerpunkt auf der Beteiligung und dem Lernen von Studenten liegt.

Eine Eins mit den 3Cs bekommen: Erfassung der Chromosomenkonformation für Studenten

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Unsere Forschung zielt darauf ab, herauszufinden, wie die Chromatinorganisation die Genexpression steuert. Der Fokus liegt darauf, zu bestimmen, welche Faktoren das Chromatin auf Genebene regulieren, um die Genaktivität zu steuern. Derzeit werden Technologien verwendet, die der Chromosomenbestätigung (3C) ähneln, um Fortschritte auf diesem Gebiet zu erzielen.Investitionen in Probenentnahme- und Sequenzierungstechnologien haben uns gezeigt, was die 3C-Techniken uns zeigen können. Die größte experimentelle Herausforderung besteht derzeit darin, Proben mit einheitlicher Chromatinarchitektur zu sammeln. Die Heterogenität der Proben führt zu verwirrenden Ergebnissen.In Zukunft werden wir uns darauf konzentrieren, welche Rolle Veränderungen in der Chromatinorganisation bei Krebs spielen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Hallo-C-Methode ermöglicht unvoreingenommene, genomweite Identifizierung von Chromatin-Wechselwirkungen (1). Hallo-C Paare Ligationssysteme und massiv parallele Sequenzierung. Die resultierenden Daten können verwendet werden, um genomische Architektur auf mehreren Skalen zu studieren: die ersten Ergebnisse identifizierten Features wie Chromosom Gebiete, Segregation von offenen und geschlossenen Chromatin und Chromatin-Struktur an der Megabasen.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Erzeugung von hoher Auflösung in Situ Hi-C-Bibliotheken von dicht vor Gastrulation Drosophila Melanogaster inszeniert Embryonen.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Chromatin looping spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation; Allerdings gab es keine technologische Fortschritte, die eine selektive und reversible Änderung des Chromatins Schleifen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein leistungsfähiges System für Chromatin Schleife Reorganisation Loci gezielt mit CRISPR-dCas9 (CLOuD9) gezeigt, um selektiv und reversibel Genexpression zu modulieren.

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Wir berichten über die Anwendung der quantitativen Chromosomenkonformationsaufnahme, gefolgt von einer Hochdurchsatzsequenzierung in embryonalen Körpern, die aus embryonalen Stammzellen erzeugt werden. Diese Technik ermöglicht es, die Kontakte zwischen vermeintlichen Enhancern und Promotorregionen eines bestimmten Gens während der embryonalen Stammzelldifferenzierung zu identifizieren und zu quantitieren.

Identifizierung von Enhancer-Promoter-Kontakten in embryoiden Körpern durch quantitative Chromosomenkonformationserfassung (4C)

Hi-C 3.0 ist ein verbessertes Hi-C-Protokoll, das Formaldehyd- und Disuccinimidylglutarat-Vernetzer mit einem Cocktail aus DpnII- und DdeI-Restriktionsenzymen kombiniert, um das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung der Chromatin-Interaktionsdetektion zu erhöhen.

Erfassung der Chromosomenkonformation über Längenskalen hinweg

Dieses Protokoll beschreibt die Capture Hi-C-Methode, die verwendet wird, um die 3D-Organisation von megabasierten Zielgenomregionen mit hoher Auflösung zu charakterisieren, einschließlich der Grenzen topologisch assoziierender Domänen (TADs) und langreichweitiger Chromatininteraktionen zwischen regulatorischen und anderen DNA-Sequenzelementen.

Entschlüsselung der hochauflösenden 3D-Chromatinorganisation über Capture Hi-C

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Wir beschreiben eine einfache, schnelle und relativ kostengünstige Methode zur Erzeugung von gen gestört Streptococcus Mutans Stämme; Diese Technik kann für die Generierung von gen gestört Stämme verschiedener Arten angepasst werden.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Lernen Sie die Chromosomenkonformationserfassung (3C) zur Untersuchung der Chromatinorganisation und Genexpression in C. elegans. Diese Methode ermöglicht Studenten praktische Forschungserfahrung in der Molekularbiologie.

Eine Eins mit den 3Cs bekommen: Erfassung der Chromosomenkonformation für Studenten

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