Name: Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 47 s
Description: Lernen Sie eine methanolbasierte Whole-Mount-Methode zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen. Dieses Protokoll ermöglicht die langfristige Lagerung empfindlicher Netzhautproben für zukünftige Analysen.

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Diese Arbeit wurde durch das Hubei Key Laboratories Opening Project (Zuschussnummer 2021KFY055), die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Hubei (Zuschussnummer 2020CFB240) und den Fonds für Grundlagenforschung für die zentralen Universitäten (Zuschussnummer 2042020kf0065) finanziert.

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle verwendeten C57BL/6J-Mäuse stammen aus dem Versuchstierzentrum der Universität Wuhan, und alle damit verbundenen Experimente wurden vom Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Universität Wuhan genehmigt. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Mäuse zu minimieren.
1. Enukleation und Fixierung der Augen
<ol><li>Einschläfern Sie die Mäuse mit Kohlendioxid-Erstickung ein und entkernen Sie den Augapfel sanft mit einer zahnlosen Pinzette.</li>
	<li>Spülen Sie den Augapfel einmal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.</li>
	<li>Punktieren Sie den Augapfel mit einer Spritzennadel an der Hornhaut unter dem Mikroskop (Okular WF: 10x/22; kontinuierliches Vergrößerungsobjektiv: 0,67x-4,5x), um die Fixierung in den Augapfel zu beschleunigen und die Fixiereffizienz zu verbessern.</li>
	<li>Transfer auf eine 24-Well-Platte mit 4 % Paraformaldehyd (PFA).</li>
	<li>Fixieren Sie den Augapfel 45 Minuten lang in 4% PFA und übertragen Sie ihn dann auf 1x PBS, um überschüssiges PFA (dreimal waschen, 5 min/Zeit) sofort zu entfernen.</li>
</ol>2. Isolierung und Abflachung der Netzhaut
<ol><li>Übertragen Sie den Augapfel auf einen Objektträger und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop (Okular WF: 10x/22; Objektiv mit kontinuierlicher Vergrößerung: 0,67x-4,5x).</li>
	<li>Halten Sie die Pinzette in einer Hand und klemmen Sie damit den Rand der Hornhaut ab, um eine Bewegung des Augapfels zu verhindern. Halten Sie die Präparierschere mit der anderen Hand fest und schneiden Sie in ca. 1 mm Tiefe um die Hornhaut herum durch den Hornhaut-Limbus. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper.</li>
	<li>Halten Sie die Papille in der Mitte und schneiden Sie die Netzhaut mit einer Präparierschere radial entlang der vier Quadranten, wobei Sie etwa 2/3 des Radius der Netzhaut erreichen.</li>
	<li>Klemmen Sie eine der Sklerakanten mit einer gezahnten Pinzette. Halten Sie mit der anderen Hand den Rand der Sklera mit einer unverzahnten Pinzette fest und bewegen Sie sich von der Stelle, an der die Sklera durch die gezahnte Zange fixiert ist, zur Basis der Sklera. Schälen Sie die Netzhaut vorsichtig.</li>
	<li>Ziehen Sie PBS mit einer Pipette (200 μl) ab, um die Netzhaut zu spülen und zu befeuchten, und entfernen Sie dann überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück saugfähigem Papier. Glätten Sie die Netzhaut bei Bedarf vorsichtig mit einer kleinen Borstenbürste.</li>
	<li>Kaltes Methanol (vorgekühlt in einem −20°C Gefrierschrank) langsam tropfenweise auf die Innenfläche der Netzhaut pipettieren (das Methanolvolumen ist nicht fixiert, solange die Netzhaut vollständig vom Methanol bedeckt werden kann). Die Netzhaut verfärbt sich weiß und entwickelt eine erhöhte Zähigkeit.</li>
	<li>Glätten Sie die Netzhaut sanft und entfernen Sie Verunreinigungen wie Restpigmentmembranen und den Glaskörper mit kleinen Borstenbürsten. Drehen Sie die Netzhaut mit kleinen Borstenbürsten um und wiederholen Sie den oben genannten Vorgang.</li>
	<li>Übertragen Sie die mit Methanol behandelte Netzhaut in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und halten Sie sie in Methanol getränkt.</li>
	<li>Lagern Sie es 1-2 h lang bei −20 °C für eine sofortige Immunfärbung oder lassen Sie die Netzhaut in Methanol und lagern Sie es zur Langzeitlagerung bei −20 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie das Methanol von der 24-Well-Platte und spülen Sie die Netzhaut mit 1x PBS.</li>
</ol>3. Immunfluoreszenzfärbung der RGCs
<ol><li>Übertragen Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Kunststoff auf eine 24-Well-Hämagglutinationsplatte und blockieren Sie sie in 5 % PBS-TX-BSA (5 g Rinderserumalbuminpulver, gelöst in 100 ml 1x PBST-Lösung; das PBST wird durch Zugabe von 10 ml Triton X-100 zu 2.000 ml 1 x PBS) bei Raumtemperatur für 4 h oder über Nacht bei 4 °C. Halte das Ganglion mit der Seite nach oben.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS-TX-BSA und inkubieren Sie die Netzhaut bei 4 °C für 48-96 h, wobei 100 μl des ausgewählten Primärantikörpers (Meerschweinchen-Anti-RBPMS-Antikörper) in einer Verdünnung von 1:400 hinzugefügt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den primären Antikörper und spülen Sie die Netzhaut dreimal (jeweils 20 Minuten) mit 1x PBS unter Schütteln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubation der Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 °C mit 100 μL des entsprechenden Sekundärantikörpers (siehe Materialtabelle), Cyanin Cy3 affiniPure Esel Anti-Meerschweinchen IgG (H+L), in einer Verdünnung von 1:400.</li>
	<li>Spülen Sie die Netzhaut dreimal (je 20 min) mit 1x PBS.</li>
	<li>Legen Sie die Netzhaut flach mit der Ganglienzellschicht nach oben auf den Objektträger, tropfen Sie mit einer Pipette eine angemessene Menge Antifluoreszenzlöschmittel um die Netzhaut und decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab (achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen). Anmerkungen: Um die geeignete Menge an Anti-Fluoreszenz-Quencher zu bestimmen, stellen Sie sicher, dass sie die gesamte Netzhaut bedeckt. Decken Sie danach den Objektträger ab, ohne dass die Netzhaut schweben und sich leicht bewegen kann.</li>
	<li>Versiegeln Sie den Objektträger rundum mit einem Dichtungsmittel, um ein Verrutschen zu verhindern. Lagern Sie die Proben bei −20 °C und schützen Sie sie vor Licht.</li>
	<li>Stellen Sie die Netzhaut mit einem Fluoreszenz-/Konfokalmikroskop dar.</li>
</ol>

Isolierung der Netzhaut von Mäusen und Methanolbehandlung zur Untersuchung von retinalen Ganglienzellen

<ol><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+types+of+retinal+ganglion+cells%3A+Current+status+and+implications+for+neuronal+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%2C+microglia+and+implications+for+retinal+ganglion+cell+survival+and+axon+regeneration+in+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 860070(2022).</li>
<li>Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells+resistant+to+advanced+glaucoma%3A+A+postmortem+study+of+human+retinas+with+the+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).</li>
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<li>Kole, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+protects+retinal+ganglion+cells+and+promotes+functional+preservation+after+optic+nerve+crush%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31(2020).</li>
<li>Nadal-Nicolás, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).</li>
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<li>Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+and+three+home-made+fixatives+for+the+substitution+of+formalin%3A+A+formaldehyde-free+laboratory+is+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible.</a> Environmental Health. 11, 59(2012).</li>
<li>Tang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+to+visualize+the+goblet+cell-associated+antigen+passages+and+identify+goblet+cells+in+the+intestine%2C+conjunctiva%2C+and+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway.</a> Immunobiology. 227 (6), 152260(2022).</li>
<li>Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+protocols+for+adherent+cultured+cells+applied+to+a+GFP+fusion+protein+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor.</a> Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).</li>
<li>Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+post-fixation+on+visualising+vimentin+in+the+retina+using+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Morphologica%22%5BJournal%5D)">The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method.</a> Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
<li>Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+methanol+to+preserve+retinas+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Using methanol to preserve retinas for immunostaining.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).</li>
<li>Kalesnykas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cell+morphology+after+optic+nerve+crush+and+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).</li>
<li>Parrilla-Reverter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+retinal+nerve+fibre+layer+degeneration+after+complete+intra-orbital+optic+nerve+transection+or+crush%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study.</a> Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).</li>
</ol>

Den Autoren sind keine Zugehörigkeiten, Mitgliedschaften, Finanzierungen oder finanziellen Beteiligungen bekannt, die die Objektivität dieser Studie beeinträchtigen könnten.

Die Fixierung ist ein wesentlicher Schritt zur Erhaltung der Netzhaut, der sich auf nachfolgende RGC-Untersuchungen auf der Grundlage der Morphologie auswirken kann. Eine erfolgreiche Fixation erfasst schnell die Struktur und den Zustand der Netzhaut in dem Moment, in dem sie dem Fixiermedium ausgesetzt wird, was für die weitere Analyse entscheidend ist. Obwohl Formaldehyd als eines der gebräuchlichsten Fixiermittel für die Fixierung und Konservierung von Gewebe und Zellen angesehen wird, eignet sich Formaldehyd allein n...

Retinale Ganglienzellen (RGCs) sind die einzigen Projektionsneuronen in der Netzhaut, und sie integrieren und übertragen visuelle Informationen von außen an das Gehirn1. Viele neurodegenerative Erkrankungen wie das Glaukom und die traumatische Optikusneuropathie sind durch irreversible Schädigung und Verlust von RGCs gekennzeichnet 2,3. Die Analyse der morphologischen und quantitativen Veränderungen von RGCs ist ein entscheidender Schritt, um zu bestimmen, wie neurodegenerative Erkrankungen entstehen und fortschreiten 4,5.
Der indirekte Immunfluoreszenz-Assay ist eine weithin anerkannte Methode zur Überwachung der Verteilung von Proteinen und der Zellzählung. Im Labor wird die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut häufig in experimentellen Studien an RGCs verwendet, um die physiologischen und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten6. Zu den gebräuchlichsten Markern, die für die RGC-Quantifizierung in der gesamten Netzhaut verwendet werden, gehören Brn3a, RNA-bindendes Protein mit multiplem Spleißen (RBPMS) usw. 7,8. Die Charakterisierung der Menge und Verteilung von RGCs erfordert eine qualitativ hochwertige Immunfärbung der gesamten Netzhaut. Im Allgemeinen wird die Netzhaut bei Immunfärbeprotokollen in chemische Fixiermittel getaucht, bevor sie in Antikörpern inkubiert wird. Ideale Fixiermittel sollten die Form der Zellen, die Zugänglichkeit oder Affinität der Epitope für Antikörper oder die linearen Abmessungen des Gewebes nicht verändern 9,10.
Aufgrund der komplexen Struktur der Netzhaut treten bei der Herstellung eines Whole-Mount-Netzhautpflasters häufig Probleme wie Fragilität und Faltung der Netzhaut sowie einige häufige Schwierigkeiten wie Zellschrumpfung und unklare Zellkerne auf, was sich negativ auf die experimentelle Forschung auswirkt. Darüber hinaus werden nicht alle Netzhäute sofort immungefärbt, insbesondere wenn es sich um die Netzhaut von transgenen Mäusen handelt, die zu teuren Preisen wertvoller Herkunft sind, was die Konservierung der zusätzlichen Netzhautproben für die weitere Verwendung erforderlich macht.
Die geeignete Fixierlösung kann das Gewebe schnell fixieren, eine Gewebeautolyse vermeiden, die normale Morphologie und Struktur der Gewebezellen erhalten und die Antigenität von Proteinen und anderen Substanzen erhalten10. Gegenwärtig wird die Fixierung auf Formaldehydbasis häufig in verschiedenen Geweben eingesetzt, darunter getrennte Netzhaut, halbgeschnittene Augenmuscheln und ganze Augäpfel10. Die Schrumpfung des Gewebes und die morphologische Veränderung von Zellen sind die beiden entscheidenden Herausforderungen, die nach dem Eintauchen in Formaldehydauftreten 11. Darüber hinaus werden zunehmend modifizierte Fixierungsformulierungen entwickelt, um die Erhaltung der ursprünglichen Eigenschaften der Netzhaut und der Zielzellen zu maximieren 9,10. Verschiedene Netzhautfixationsbehandlungen können die Netzhautstruktur, die Proteinimmunogenität, die Fluoreszenzanregung und den Abschwächungslöschzyklus unterschiedlich beeinflussen12,13. Netzhäute, die mit Davidson-Lösung fixiert wurden, sind morphologisch intakter als solche, die mit Formalin fixiert wurden, aber Davidsons Lösung ist weniger kompatibel mit einigen Antikörpern, wie z. B. dem Mikroglia-Marker-ionisierten Kalzium-bindenden Adaptermolekül 112. Angesichts der Zerbrechlichkeit der Netzhaut würden sich die Forscher natürlich fragen, ob sich die Integrität der Netzhaut sowie die Eigenschaften und die Morphologie der Zielzellen nach längerer Lagerung verändern werden. Über die möglichen Auswirkungen der Fixierlösung auf die Morphologie der Netzhaut und der RGC-Zellen nach mehrmonatiger Lagerung wurde jedoch nur selten berichtet. Die Optimierung der Netzhautfixierung ist entscheidend für die Beurteilung und Erhaltung von RGCs.
Wir bieten eine detaillierte Beschreibung einer zuverlässigen und technisch unkomplizierten Methode, die wir für die Total-Mount-Färbung der murinen Netzhaut verwenden. Unsere Methode legt den Schwerpunkt auf die richtige Präparation und Lagerung von Netzhäuten für die RGC-Untersuchung, wobei die Notwendigkeit der Langzeitlagerung von Netzhautgewebe sowie spezifische Aspekte der Fluorophorbildung oder des Fluorophorabbaus berücksichtigt werden.

<table><tbody><tr><td>24-Well-Zellkultur-Cluster</td><td>Costar</td><td></td><td>Augapfel-Fixierung</td></tr><tr><td>24-Well-Hämagglutinationsplatte</td><td>Labedit Unternehmen</td><td></td><td>Inkubation Antikörper</td></tr><tr><td>Adhäsionsmikroskop-Objektträger</td><td>Citotest</td><td></td><td>Oder ähnliches</td></tr><tr><td>Anti-Fluoreszenz-Quenching-Eindeckmittel</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td>Slow down Fluoreszenz-Quenching</td></tr><tr><td>BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>Servicebio</td><td>GC305010</td><td>Blockierungsreagenz</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td>Apply 40x Objektivlinse</td></tr><tr><td>Gebogene Schere</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>RWD Life Science Co.,LTD&nbsp;</td><td>77001S</td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Präparierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>20210624</td><td>GC&ge; 99.5%</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>SecheVite</td><td></td><td>Versiegelungsmittel</td></tr><tr><td>Nadeln&nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.</td><td></td><td>Beschleunigen Sie die Fixierung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Lösung</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>Augapfelfixierung</td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4)</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>Spülen Sie den Augapfel&nbsp;</td></tr><tr><td>Primärer Antikörper: Meerschweinchen-Anti-RNA-bindendes Protein mit Mehrfachspleißen (RBPMS)</td><td>PhosphoSolutions</td><td>Cat. #1832-RBPMS</td><td>Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:400</td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper: Cy3 affiniReiner Esel Anti-Meerschweinchen IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-165-148</td><td>Für Immunfluoreszenz. Verwendet bei 1:400</td></tr><tr><td>Gerade Schere</td><td>Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.</td><td></td><td>Werkzeuge zum Präparieren</td></tr></tbody></table>

methanol-basiertes whole-mount-präparat zur untersuchung retinaler ganglienzellen

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinale Ganglienzellen (RGCs), die Projektionsneuronen der Netzhaut, leiten externe visuelle Informationen an das Gehirn weiter. Pathologische Veränderungen der RGCs stehen in engem Zusammenhang mit zahlreichen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Die Whole-Mount-Immunfärbung der Netzhaut wird häufig in experimentellen Studien an RGCs eingesetzt, um die Entwicklungs- und pathologischen Bedingungen der Netzhaut zu bewerten. Unter bestimmten Umständen müssen einige wertvolle Netzhautproben, z. B. von transgenen Mäusen, über einen langen Zeitraum aufbewahrt werden, ohne die Morphologie oder Anzahl der RGCs zu beeinträchtigen. Für glaubwürdige und reproduzierbare experimentelle Ergebnisse ist die Verwendung eines effektiven Konservierungsmediums unerlässlich. Hier beschreiben wir die Wirkung von Methanol als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung. Kurz gesagt, während des Isolationsprozesses wird kaltes Methanol (−20 °C) auf die Oberfläche der Netzhaut pipettiert, um das Gewebe zu fixieren und seine Durchlässigkeit zu erleichtern, und dann kann die Netzhaut in kaltem Methanol (−20 °C) gelagert werden, bevor sie immungefärbt wird. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und die Lagerung von Gewebeproben, die für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch sind.

Nach der Präparation sollte die Netzhaut wie ein flaches vierblättriges Kleeblatt aussehen. In dieser Studie wurde die Netzhaut nach der Zugabe von Methanol nach Anwendung des oben beschriebenen Protokolls weiß (Abbildung 1). Währenddessen veränderte sich die Netzhaut von weich zu biegsam und flach. Als nächstes wurden die RGCs mit Anti-RBPMS8 gekennzeichnet. Vier Bildfelder wurden in der Whole-Mount-Netzhaut (n = 3) mit einem konfokalen Mikroskop (Okular: 10x; Objekt...

Methanol kann als fixes Hilfsmedium für retinale Whole-Mount-Präparate und die Langzeitlagerung verwendet werden, was für die Untersuchung von retinalen Ganglienzellen nützlich ist.

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...

Die Forschung zielt darauf ab, einen modifizierten Arbeitsablauf für die Netzhautisolierung und ein Protokoll zur Lagerung von Gewebeproben bereitzustellen, das für die Untersuchung von RGCs nützlich und praktisch ist. Netzhäute sind zerbrechlich und faltbar, was die experimentelle Forschung bei der Herstellung eines gesamten Netzhautpflasters einschränkt. Darüber hinaus benötigen alle Netzhäute keine sofortige Immunfärbung.Manchmal müssen zusätzliche Netzhautproben für die weitere Verwendung aufbewahrt werden. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung einer zuverlässigen und technisch unkomplizierten Methode zur Whole-Mount-Netzhautfärbung, die die richtige Vorbereitung und die Notwendigkeit der Langzeitlagerung von Netzhaut für die RGC-Untersuchung hervorhebt. Wir werden weiter an der Grundlagenforschung zu degenerativen Optikusneuropathien arbeiten.Darüber hinaus werden die molekularen Mechanismen der Sehnervenverletzung und der Unfallregeneration sowie mögliche klinische Angriffspunkte für die Diagnose und Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen erforscht.

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Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Source: Laboissonniere, et. al. Einzelzell-RNA-Seq definierter Untergruppen von retinalen Ganglienzellen. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video zeigt eine Fluoreszenzverfolgungstechnik zur Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen (RGC) in einer transgenen Mausnetzhaut. Der Prozess umfasst die Sicherung der isolierten Netzhaut in einer Aufnahmekammer, die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit durch sauerstoffhaltige Perfusion und das Targeting fluoreszenzmarkierter RGCs mit...

Identifizierung von Subtypen von retinalen Ganglienzellen der Maus durch Fluoreszenzverfolgung

Dieses Video zeigt die Artikel-Set-up, die Verfahren zum Zellkörper patchen und wie man dynamische Clamp Messungen von Ganglienzellen in whole-mount Maus retinae umzusetzen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der genauen Anteil von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge und ihre relative Größe und den Zeitpunkt zu neuronalen Spiking.

Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Isolierung der Netzhaut der gesamten Maus und zur Durchführung einer Immunfärbung zur Markierung aller retinalen Ganglienzellen (RGCs). Dem Prozess folgt die Bildgebung und automatische Zählung von RGCs mit KI-basierter Software, die eine einfache, schnelle und genaue Methode zur Quantifizierung von RGCs in der gesamten Netzhaut der Maus bietet.

Immunfärbung und automatische Zählung von retinalen Ganglienzellen der Maus

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

In dieser Arbeit beschreiben wir die Verwendung einer genetisch gerichteten Markierungsmethode für alkalische Phosphatase (AP), um die anatomischen Merkmale und Phänotypen der Mausnetzhaut unter NMDA-induzierter Exzitotoxizität zu untersuchen. In Verbindung mit mehreren Subtyp-spezifischen Reporterlinien von retinalen Ganglienzellen (RGC) decken wir neue Phänotypen in sterbenden RGCs während des gesamten degenerativen Prozesses auf.

Untersuchung der anatomischen Merkmale retinaler Ganglienzellen unter N-Methyl-D-Asparaginsäure (NMDA)-induzierter Exzitotoxizität

Lernen Sie eine methanolbasierte Whole-Mount-Methode zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen. Dieses Protokoll ermöglicht die langfristige Lagerung empfindlicher Netzhautproben für zukünftige Analysen.

Methanol-basiertes Whole-Mount-Präparat zur Untersuchung retinaler Ganglienzellen

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