Direkte Synthese von EM-sichtbaren Gold-Nanopartikeln in Zellen zur Proteinlokalisierungsanalyse mit gut erhaltener Ultrastruktur
28. April 2023
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine klonierbare elektronenmikroskopische Markierungstechnologie zum Nachweis von Metallothionein-markierten Proteinen in Zellen unter Verwendung einer neuartigen, auf dem Mechanismus der Autonukleationsunterdrückung basierenden Gold-Nanopartikel-Synthesetechnik.
Der Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen sind in der biologischen Forschung unerlässlich. Unser Protokoll beschreibt eine neuartige EM-Markierungstechnologie unter Verwendung genetisch kodierter Tags, die eine Einzelmolekül-Visualisierung in situ mit gut erhaltener Ultrastruktur ermöglicht. Es ist wichtig, eine Überfixierung zu vermeiden.
Die Markierungsmethode basiert auf der Aktivität von Cystein in den Tags, die sehr empfindlich auf Aldehydvernetzung reagieren. Unser Protokoll vermeidet die Verwendung von Aldehyd-Fixiermitteln und bewahrt die Tag-Aktivität und -Ultrastruktur. zur gleichen Zeit.
Die Markierung von Schwellenländern war schon immer eine Herausforderung, da sie unter einer schlechten Morphologie oder einer ineffizienten Markierung litt. Unsere Protokolle synthetisieren In-situ-Nanopartikel direkt auf einzelnen Proteinen, um eine klare und präzise Lokalisierung der Zielproteine mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis, hoher Effizienz und Spezifität zu ermöglichen. Bisher haben wir eine hervorragende Markierung in isolierten Proteinen, E.coli-Zellen, Hefezellen und HeLa-Zellen erreicht.
Wir werden die Methode für die Anwendung an Gewebeproben erforschen und optimieren. Durch die Kombination der vorherrschenden Kryo-FIB- und Kryo-EM-Technologien können wir wichtige biologische Fragestellungen beantworten.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine neuartige Elektronenmikroskopie-(EM-)Markierungstechnologie zur Detektion von Metallothionein-markierten Proteinen in Zellen vor. Mithilfe eines Mechanismus zur Unterdrückung der Autonukleation ermöglicht die Methode die präzise Visualisierung einzelner Moleküle, während die zelluläre Ultrastruktur erhalten bleibt.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Mikroskopie
- Proteinlokalisation und -nachweis
Hintergrund
- Die Detektion und Lokalisierung von Proteinen ist entscheidend für zahlreiche Anwendungen in der biologischen Forschung.
- Herkömmliche EM-Markierungsmethoden beeinträchtigen häufig die Morphologie sowie die Effizienz.
- Genetisch kodierte Tags können die Empfindlichkeit und Spezifität der Proteindetektion verbessern.
Verwendete Methoden
- Eine neuartige EM-Markierungstechnologie, die aldehydhaltige Fixiermittel vermeidet, um die Proteintätigkeit zu erhalten.
- Anwendung an isolierten Proteinen, E. coli, Easter-Zellen und HeLa-Zellen.
- Kombination von Cryo-FIB- und Cryo-EM-Technologien zur Verbesserung der Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Synthese von Goldnanopartikeln direkt auf einzelnen Proteinen.
- Erreichte klare und präzise Lokalisierung mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis.
- Bestätigte die Effizienz und Spezifität der Methode in verschiedenen biologischen Proben.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt einen bedeutenden Fortschritt in den Technologien zur Proteindetektion auf.
- Die Methode verspricht, kritische biologische Fragestellungen auf molekularer Ebene zu beantworten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die präzise Proteinlokalisation auf ultrastruktureller Ebene stellt einen entscheidenden Wendepunkt für die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominimierung in der frühen Entdeckungsforschung dar. Die direkte Synthese elektronenmikroskopisch sichtbarer Goldnanopartikel an genetisch kodierten Markierungen ermöglicht die Visualisierung einzelner Moleküle im nativen Kontext und stützt damit die Vorhersagegenauigkeit bezüglich Zielinteraktion und Signalwegzuordnung. Diese Fähigkeit stärkt die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Forschung, da die native zelluläre Architektur erhalten bleibt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die hochauflösende Kartierung der Proteinlokalisation zur Klärung der Zielbiologie.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von konstruierten Markierungen sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Systemen.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem die Ultrastruktur während der Detektion erhalten bleibt.
- Steigert das Vorhersagevertrauen hinsichtlich Zielinteraktion und Pfadzuweisung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht eine robuste, reproduzierbare Markierung für die quantitative Protein-Detektion in zellbasierten Assays.
- Standardisiert die Erzeugung von EM-Sonden mithilfe klonierbarer Tags für skalierbare Arbeitsabläufe.
- Liefert hohe Signal-Rausch-Verhältnisse und ermöglicht somit zuverlässige Wirkstoffevaluierungen in Screening-Kampagnen.
- Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete, EM-basierte Analysen vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Korreliert Daten zur Proteinallokation mit krankheitsrelevanten ultrastrukturellen Kontexten.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Einzelzell-Entdeckung zur präklinischen Validierung auf Gewebeebene.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem ultrastrukturelle Nachweise einer Zielstrukturnbindung bereitgestellt werden.
- Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern durch präzise subzelluläre Kartierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese EM-Markierungstechnologie integriert sich von der frühen Entdeckung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Forschung und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die mechanistische Validierung.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die hypothesengeleitete Untersuchung der Proteinfunktion und -lokalisation in nativen zellulären Umgebungen.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative EM-Auslesewerte für die Assay-Entwicklung und die Auswahl von Verbindungen.
- Analytik: Stellt eine hocheffiziente, hochspezifische Nanopartikelmarkierung für die vergleichende Analyse unter verschiedenen Bedingungen bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet die Einzelmolekül-Detektion mit ultrastrukturellen Krankheitsmodellen zur Validierung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine Plattform für die standardisierte Erzeugung von EM-Sonden über verschiedene Forschungs- und Entwicklungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Verbessert Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der proteinbasierten Nachweisverfahren mittels Elektronenmikroskopie.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem ultrasruckturelle Nachweise bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Entdeckungsobjekten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der EM-Probenpräparation und im Design genetisch kodierter Marker.
- Benötigt Zugang zu Hochdruckfixierung, Gefriertauschung und fortschrittlicher EM-Apparatur.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei Fixierungs- und Markierungsprotokollen, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Die Anpassung an Gewebeproben und unterschiedliche Modellsysteme kann weitere Optimierungen erfordern.
- Die Empfindlichkeit des Markers gegenüber Aldehyd-Fixierung erfordert eine sorgfältige Einhaltung des Protokolls, um die Aktivität zu erhalten.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:31
Preparing Sapphire Discs for Cell Culture
2:48
High‐Pressure Freezing (HPF),Freeze‐Substitution Fixation (FSF),and Rehydration of Sapphire Disc‐Carrier Assembly
6:02
Gold Nanoparticle Synthesis for Mammalian Cells Using Sapphire Discs
