Name: Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Erfahren Sie eine nicht-invasive ACL-Verletzungsmethode bei Mäusen zur Untersuchung posttraumatischer Arthrose. Diese Technik ermöglicht die In-vivo-Quantifizierung von Proteaseaktivität im Gelenk direkt nach Verletzung.

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Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, Teil der National Institutes of Health, unter der Award-Nummer R01 AR075013 unterstützt.

Alle beschriebenen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California Davis genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden 3 Monate alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet.
1. Nicht-invasive ACL-Verletzung
HINWEIS: ACL-Verletzungen, die durch eine extern angelegte Druckbelastung verursacht werden, sind eine einfache und reproduzierbare Methode, die ACL-Verletzungszustände beim Menschen genau rekapituliert. Dieses Protokoll wurde für ein kommerziell erhältliches Lastrahmengerät geschrieben (siehe Materialtabelle), könnte aber für ähnliche Systeme angepasst werden.
<ol><li>Öffnen Sie die mit dem Lastrahmeninstrument kompatible Software (siehe Materialtabelle) und wählen Sie eine vorhandene Steuerdatei aus oder erstellen Sie eine neue Datei.</li>
	<li>Schalten Sie den Aktuator ein.</li>
	<li>Tarieren Sie im Kalibrierungsmenü den Kraftmesswert der Wägezelle und setzen Sie die Verschiebung des Aktuators auf 0.</li>
	<li>Verwenden Sie 1%-4% inhaliertes Isofluran in Sauerstoff, um die Mäuse zu betäuben und sicherzustellen, dass die Tiere durch Zehenkneifen und/oder Schwanzkneifen vollständig betäubt werden.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in Bauchlage auf die Plattform. Positionieren Sie den Unterschenkel senkrecht zwischen zwei Ladevorrichtungen (Abbildung 1) (siehe Materialtabelle). Stecken Sie den Fuß in den Ausschnitt der oberen Halterung und das Knie in die Schale der unteren Halterung.</li>
	<li>Stellen Sie die Höhe der unteren Halterung manuell ein, um eine Vorspannung von 1-2 N aufzubringen (in Echtzeit auf dem Computerbildschirm überwacht), und ziehen Sie die Stellschraube fest, um die Position zu halten. Die Vorspannung ist notwendig, um das Bein in der richtigen Position zu halten, bevor die Verletzungslast aufgebracht wird.</li>
	<li>Bringen Sie eine einzelne Drucklast auf eine Zielkraft (~12-15 N) oder eine Zielverschiebung (~1,5-2,0 mm) auf. HINWEIS: Das Aufbringen der Last mit einer langsameren Belastungsrate (~1 mm/s) bietet ein höheres Maß an Echtzeitüberwachung und -steuerung, führt jedoch wahrscheinlich zu einem Ausrissausfall der ACL. Die Anwendung einer schnelleren Belastungsrate (~200 mm/s) führt eher zu einer ACL-Verletzung mittlerer Substanz22. Wenn festgestellt wird, dass eine Tibiafraktur oder eine andere übermäßige Verletzung aufgetreten ist, euthanasieren Sie das Tier mit einer von der IACUC zugelassenen Methode, bevor sich das Tier von der Narkose erholt.<ol><li>Stellen Sie die Belastungsrate in der Software-Steuerdatei ein und bestätigen Sie mit den Kraft-Weg-Daten. HINWEIS: Knochenbrüche während der tibialen Kompressionsbelastung sind in der Regel kein Problem, da die Frakturkraft (~20 N) erheblich höher ist als die ACL-Verletzungskraft. Dies sollte jedoch mit Palpation überwacht werden, und die Bildgebung (d. h. Röntgen) kann verwendet werden, um zu bestätigen, dass keine Tibiafrakturen aufgetreten sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Eine Verletzung wird typischerweise durch ein Geräusch ("Klick" oder "Knirschen") und eine Kraftfreisetzung angezeigt, die auf den Kraft-Weg-Diagrammen erkennbar ist (Abbildung 1C). Wenn eine langsamere Belastungsrate verwendet wird, stoppen Sie die Druckbelastung sofort nach der Verletzung, um eine weitere Belastung und mögliche Schäden an anderem Gelenkgewebe zu vermeiden. HINWEIS: ACL-Verletzungen treten typischerweise bei 8-15 N auf, abhängig von der Körpermasse34. Es ist wichtig, eine Zielkraft festzulegen, die größer ist als die erwartete ACL-Verletzungskraft.</li>
	<li>Bestätigung der VKB-Verletzung durch einen anterior-posterioren Schubladentest 35,36 oder eine vergleichbare Beurteilung der Gelenkinstabilität.</li>
	<li>Verabreichen Sie Mäusen nach der Verletzung eine gewichtsabhängige Dosis (z. B. 0,05-0,1 mg/kg SC oder IP von Buprenorphin, siehe Materialtabelle) mit Dauer und Dosis, die von der Heimateinrichtung IACUC empfohlen und genehmigt wurde. HINWEIS: NSAIDs können das Fortschreiten der PTOA nach einer Verletzung verändern, daher wird nicht empfohlen, NSAIDs zur Schmerzbehandlung in diesem Verletzungsmodell zu verwenden, es sei denn, dies ist ein spezifisches Ziel der Studie.</li>
</ol>2. Tiervorbereitung für die FRI-Bildgebung
HINWEIS: Für die optische Bildgebung ist Tierfell (insbesondere dunkles Fell) sehr effektiv beim Blockieren, Absorbieren und Streuen von Licht, daher muss das Fell vor der Bildgebung so weit wie möglich aus dem Bereich um die Kniegelenke entfernt werden. Eine Enthaarungscreme ist in der Regel wirksamer für die Fellentfernung als eine Haarschneidemaschine. Nackte oder haarlose Mäuse müssen nicht entfernt werden. Für die am häufigsten verwendeten Mausstämme (z. B. C57BL/6) ist jedoch eine Fellentfernung erforderlich. Füttern Sie Mäuse nach Möglichkeit vor der Bildgebung mit fluoreszenzarmem gereinigtem Futter. Standard-Mausfutter enthält Chlorophyll, das mit einer Wellenlänge von etwa 700 nm automatisch fluoresziert und die Datenerfassung aus dem Nahinfrarot-FRI-System beeinträchtigen kann.
<ol><li>Betäuben Sie Mäuse mit 1%-4% inhaliertem Isofluran in Sauerstoff. Halten Sie Mäuse so oft wie möglich auf einem Heizkissen und tragen Sie Augensalbe auf, um Augenreizungen zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um Enthaarungscreme (siehe Materialtabelle) auf die vordere (kraniale) Seite der Beine der Mäuse um das Kniegelenk aufzutragen.</li>
	<li>Lassen Sie die Creme ~1 Minute einwirken und entfernen Sie dann mit Tüchern die Creme und das Fell vom Bein. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.</li>
	<li>Sobald die Kniegelenke vollständig freigelegt sind, ohne dass der Bereich von Fell bedeckt ist, reinigen Sie die Beine mit Alkoholtüchern, um restliche Enthaarungscreme zu entfernen. HINWEIS: Enthaarungscreme kann während einer Studie mehrmals an denselben Mäusen angewendet werden, aber diese Anwendungen sollten mindestens eine Woche auseinander liegen, um unnötige Hautreizungen zu vermeiden.</li>
</ol>3. Herstellung der Sondenlösung
<ol><li>Verdünnen Sie die fluoreszenzaktivierbare Sonde ggf. nach Herstellerangaben in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Ein Fläschchen der kommerziell erhältlichen Sonde (siehe Materialtabelle) enthält typischerweise 20 nmol in 0,15 ml 1x PBS. Um die Lösung in der Durchstechflasche zu verdünnen, fügen Sie 1,35 ml 1x PBS hinzu, um 20 nmol in 1,5 ml 1x PBS zu erhalten. HINWEIS: Nach der Verdünnung kann eine Durchstechflasche verwendet werden, um zehn Mäuse abzubilden, wenn 0,15 ml pro Maus injiziert werden.</li>
	<li>Wirbeln Sie die Lösung mit einer Mindestgeschwindigkeit (~2000 U/min) für 30 s vor, um sicherzustellen, dass die Sonde in Lösung gelöst ist, und zentrifugieren Sie dann kurz, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit aus dem Deckel herauskommt. HINWEIS: Die Lösung kann bei 2-8 °C an einem lichtgeschützten Ort bis zu 12 Monate gelagert werden.</li>
</ol>4. Retroorbitale Injektion
HINWEIS: Beziehen Sie sich auf Yardeni et al. bezüglich der Details dieses Verfahrens37.
<ol><li>Verwenden Sie 1%-4% inhaliertes Isofluran in Sauerstoff, um Mäuse zu betäuben, und legen Sie die Maus mit der Schnauze in einem Nasenkegel auf die Seite.</li>
	<li>Verwenden Sie ~29 g Insulinspritzen zur Injektion der Sondenlösung (hergestellt in Schritt 3).</li>
	<li>Halten Sie die Spritze vor Gebrauch abgedeckt, um Lichteinwirkung zu vermeiden.</li>
	<li>Bei der Verabreichung der Injektion:<ol><li>Injizieren Sie auf die Innenseite des Auges (Tränenkarunkel) und achten Sie darauf, dass die Abschrägung der Spritze zum Auge hin abgewinkelt ist. Für Rechtshänder wird empfohlen, mit dem Tier nach rechts in das rechte Auge der Maus zu injizieren.</li>
		<li>Ziehen Sie mit der nicht injizierenden Hand die Haut um das Auge herum vorsichtig zurück, um den Kopf zu stabilisieren und das Auge hervortreten zu lassen.</li>
		<li>Winkeln Sie die Spritze parallel zum Mauskörper an.</li>
		<li>Führen Sie die Spritze vorsichtig am Auge vorbei, bis sie auf einen starren Widerstand stößt. Versuchen Sie nicht, über diesen Punkt hinauszugehen.</li>
		<li>Injizieren Sie die Sondenlösung langsam in den retroorbitalen Sinus und ziehen Sie dann die Nadel langsam aus der Augenhöhle. Wenn mit der Nadel keine Lösung herauskommt, ist die Injektion erfolgreich.</li>
		<li>Tragen Sie Kochsalzlösung oder Augensalbe auf das injizierte Auge auf. HINWEIS: Basierend auf der mit den bildgebenden Sonden gelieferten Dokumentation liegt die optimale Bildgebungszeit in der Regel zwischen 1 und 2 Tagen nach der Injektion der Sondenlösung. Wenn möglich, wird empfohlen, ein erstes Zeitscreening durchzuführen, um die optimale Bildgebungszeit für jede spezifische Anwendung zu bestimmen. Mäuse metabolisieren die injizierte Sonde innerhalb von etwa 7 Tagen, danach muss eine neue Dosis Sondenlösung injiziert werden, wenn zusätzliche Zeitpunkte gewünscht werden.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Fluoreszenz-Reflexions-Bildgebung
HINWEIS: Die Verfahren in diesem Abschnitt sind spezifisch für ein kommerziell erhältliches optisches Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle). Eine ähnliche Bildgebung kann mit vergleichbaren Systemen durchgeführt werden.
<ol><li>Betäuben Sie Mäuse mit 1%-4% inhaliertem Isofluran in Sauerstoff und legen Sie das Tier in Rückenlage mit der Schnauze in einem Nasenkegel in das Bildgebungssystem.</li>
	<li>Positionieren Sie die Maus mit gestreckten Unterschenkeln so, dass die Knie leicht in die Luft zeigen (ggf. müssen die Füße abgeklebt werden). Es ist wichtig, dass für alle Tiere eine einheitliche Positionierung verwendet wird.</li>
	<li>Öffnen Sie die kompatible Software (siehe Materialtabelle) auf dem Computer des Bildverarbeitungssystems. Das "Acquisition Control Panel" wird angezeigt.</li>
	<li>Um das System aufzuwärmen, klicken Sie auf Initialisieren und warten Sie, bis die Temperaturanzeige grün leuchtet.</li>
	<li>Klicken Sie auf Imaging-Assistent und stellen Sie sicher, dass das Fenster "Imaging-Assistent" angezeigt wird.</li>
	<li>Klicken Sie auf Filterpaar, stellen Sie sicher, dass die Einstellung auf "Epi-Illumination" steht, und drücken Sie dann auf Weiter.</li>
	<li>Um die richtigen Anregungs-/Emissionseinstellungen auszuwählen, suchen Sie die gewünschte Sonde aus der Pulldown-Liste. Wenn man die richtige Sonde nicht finden kann, suchen Sie den Namen "Eingang Ex/Em" und geben Sie den Wert von Anregungsspitze und Emissionsspitze basierend auf der Eigenschaft der zu verwendenden Sonde manuell ein (z. B. für Anregungsspitze geben Sie 675 und für Emissionsspitze 720 ein). Klicken Sie auf Weiter.</li>
	<li>Wählen Sie Maus für "Motiv abbilden". Stellen Sie unter "Belichtungsparameter" sicher, dass die automatischen Einstellungen aktiviert und die Optionen Fluoreszenz und Foto ausgewählt sind. Wählen Sie D-22,6 cm in der Checkliste "Sichtfeld" aus. Drücken Sie Weiter.</li>
	<li>Die Bildgebungseinstellung kann im rechten Bereich des "Acquisition Control Panel" angezeigt und geändert werden. Stellen Sie sicher, dass alle Einstellungen korrekt sind, und drücken Sie die Taste "Sequenz erfassen ". Nachdem das Bild angezeigt wurde, vergewissern Sie sich, dass das Bild ausreichend belichtet war. Wenn nicht, ändern Sie die Einstellung der Belichtungszeit und klicken Sie erneut auf Sequenz erfassen .</li>
	<li>Um das Bild zu analysieren, positionieren Sie einen ROI-Kreis (Region of Interest) mit einheitlicher Größe über jedem Kniegelenk auf dem Schwarzweißbild (dies verhindert eine verzerrte Positionierung basierend auf Bereichen des Fluoreszenzsignals).</li>
	<li>Berechnen Sie die Gesamtstrahlungseffizienz und/oder die durchschnittliche Strahlungseffizienz für jedes Kniegelenk. Wenn die Strahlungseffizienz auch an den kontralateralen Beinen berechnet wird, normalisieren Sie die Daten, indem Sie die Strahlungseffizienzmessung für das verletzte Bein durch die Strahlungseffizienzmessung des kontralateralen Beins dividieren. HINWEIS: Wenn für alle Knie ein Bereich von Interesse mit gleichbleibender Fläche verwendet wird, führen sowohl die Gesamtstrahlungseffizienz als auch die durchschnittliche Strahlungseffizienz zu ähnlichen Ergebnissen. Die Verwendung eines durchschnittlichen Strahlungswirkungsgrads wird empfohlen, wenn Bereiche von Interesse mit unterschiedlichen Größen verwendet werden. Die Normalisierung der Strahlungseffizienzdaten des verletzten Gelenks mit den Daten des unverletzten kontralateralen Knies bietet eine interne Kontrolle, um Unterschiede in der Menge der injizierten Sonde und der Verabreichungseffizienz zwischen verschiedenen Tieren zu berücksichtigen.</li>
</ol>

Einfluss von nicht-invasiven ACL-Verletzungen und -Operationen auf die Proteaseaktivität bei Mäusen

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<li>Jaffer, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+visualization+of+cathepsin+K+activity+in+atherosclerosis+with+a+novel%2C+protease-activatable+fluorescence+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical visualization of cathepsin K activity in atherosclerosis with a novel, protease-activatable fluorescence sensor.</a> Circulation. 115 (17), 2292-2298 (2007).</li>
<li>Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+multimodality+molecular+imaging%3A+insights+into+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1017-1024 (2009).</li>
<li>Razansky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+optoacoustic+tomography+of+matrix+metalloproteinase+activity+in+vulnerable+human+carotid+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Multispectral optoacoustic tomography of matrix metalloproteinase activity in vulnerable human carotid plaques.</a> Molecular Imaging and Biology. 14 (3), 277-285 (2012).</li>
<li>Hsia, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteophytes+and+fracture+calluses+share+developmental+milestones+and+are+diminished+by+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Osteophytes and fracture calluses share developmental milestones and are diminished by unloading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 699-710 (2018).</li>
<li>Blaker, C. L., Little, C. B., Clarke, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+loads+resulting+in+ACL+rupture%3A+Effects+of+age%2C+sex%2C+and+body+mass+on+injury+load+and+mode+of+failure+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Joint loads resulting in ACL rupture: Effects of age, sex, and body mass on injury load and mode of failure in a mouse model.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (8), 1754-1763 (2017).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+joint+instability+delays+the+degeneration+of+articular+cartilage+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Controlling joint instability delays the degeneration of articular cartilage in a rat model.</a> Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 297-308 (2017).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Abnormal+joint+movement+inhibits+response+of+osteophyte+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Controlling Abnormal joint movement inhibits response of osteophyte formation.</a> Cartilage. 9 (4), 391-401 (2018).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Laboratory Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Kokubun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changing+the+joint+kinematics+of+knees+with+a+ruptured+anterior+cruciate+ligament+on+the+molecular+biological+responses+and+spontaneous+healing+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of changing the joint kinematics of knees with a ruptured anterior cruciate ligament on the molecular biological responses and spontaneous healing in a rat model.</a> The American Journal of Sports Medicine. 44 (11), 2900-2910 (2016).</li>
<li>Bhatti, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+non-invasively+induced+post-traumatic+osteoarthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Characterization of non-invasively induced post-traumatic osteoarthritis in mice.</a> Antioxidants (Basel). 11 (9), 1783(2022).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Laboratory Animals (NY). 37 (1), 26-32 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll hat eine reproduzierbare, nicht-invasive Methode zur Induktion von ACL-Verletzungen bei Mäusen etabliert und rigoros beschrieben 20,21,24,33. Diese einfache und effiziente Verletzungsmethode kann in nur wenigen Minuten durchgeführt werden, was Hochdurchsatzstudien von PTOA erleichtert. Diese Verletzungsmethode rekapituliert auch die Verletzungsbedingungen, die für menschliche V...

Arthrose ist ein weit verbreitetes Gesundheitsproblem, von dem Millionen von Menschen in den Vereinigten Staaten betroffensind 1. Posttraumatische Arthrose (PTOA) ist eine Untergruppe der OA, die durch eine Gelenkverletzung wie einen Riss des vorderen Kreuzbandes (ACL), eine Meniskusverletzung oder eine intraartikuläre Frakturausgelöst wird 2. Der Anteil der symptomatischen OA-Patienten, die als PTOA klassifiziert werden können, beträgt mindestens 12 %3, und diese Ätiologie betrifft typischerweise eine jüngere Population als idiopathische OA4. Mausmodelle von OA sind entscheidende Werkzeuge für die Untersuchung der Krankheitsätiologie und potenzieller OA-Behandlungen in einem viel kürzeren Zeitraum (4-12 Wochen in Mausmodellen im Vergleich zu 10-20 Jahren beim Menschen). Die Methoden zur Initiierung von OA bei Mäusen umfassen jedoch häufig invasive chirurgische Techniken wie die VKB-Durchtrennung 5,6, die Entfernung oder Destabilisierung des Innenmeniskus 5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 oder eine Kombination aus beidem 17,18,19, die klinisch relevante Verletzungszustände nicht reproduzieren. Chirurgische Modelle verschlimmern auch die Entzündung im Gelenk aufgrund einer Störung der Gelenkkapsel, was das Fortschreiten der Arthrose beschleunigen könnte.
Nicht-invasive Mausmodelle mit Knieverletzungen bieten die Möglichkeit, biologische und biomechanische Veränderungen zu frühen Zeitpunkten nach der Verletzung zu untersuchen und können klinisch relevantere Ergebnisse liefern20. Unser Labor hat ein nicht-invasives Verletzungsmodell etabliert, das eine einzelne extern angelegte Tibiakompressionsüberlastung verwendet, um bei Mäusen einen Riss des vorderen Kreuzbandes (ACL) zu induzieren 21,22,23,24. Diese nicht-invasive Verletzungsmethode ist in der Lage, eine aseptische Gelenkverletzung hervorzurufen, ohne die Haut oder die Gelenkkapsel zu stören.
Die Fluoreszenzreflexionsbildgebung (FRI) ist ein optisches Bildgebungsverfahren, bei dem ein Ziel mit Infrarotlicht einer bestimmten Wellenlänge angeregt und das reflektierte Licht bei einer anderen Wellenlänge quantifiziert wird. Im Handel erhältliche Protease-spezifische Sonden können in Tiermodelle injiziert werden, und FRI kann dann verwendet werden, um die Proteaseaktivität an bestimmten Stellen wie dem Kniegelenk zu quantifizieren. Diese Methode ist weit verbreitet für den In-vivo-Nachweis biologischer Aktivitäten wie Entzündungen. Die für diese Anwendung verwendeten Sonden werden fluoreszenzabgeschreckt, bis sie auf relevante Proteasen treffen. Diese Proteasen brechen dann eine Enzymspaltstelle auf den Sonden auf, woraufhin sie ein Nahinfrarot-Fluoreszenzsignal erzeugen. Diese Sonden und diese bildgebende Methode wurden umfassend validiert und in Studien zu Krebs 25,26,27,28 und Atherosklerose 29,30,31,32 verwendet, und unsere Gruppe hat sie für Studien des Bewegungsapparates verwendet, um Marker für Entzündungen und Matrixabbau zu messen 23,24,33.
Zusammen bieten nicht-invasive Gelenkverletzungen in Kombination mit in vivo FRI und proteaseaktivierbaren Sonden eine einzigartige Fähigkeit, Entzündungen und Proteaseaktivitäten nach einer traumatischen Gelenkverletzung zu verfolgen. Diese Analyse kann bereits Stunden oder sogar Minuten nach der Verletzung durchgeführt werden, und dasselbe Tier kann mehrmals untersucht werden, um den zeitlichen Verlauf der Proteaseaktivität im Gelenk zu untersuchen. Wichtig ist, dass diese bildgebende Methode in Kombination mit chirurgischen Modellen von OA möglicherweise nicht durchführbar ist, da eine Unterbrechung der Haut und der Gelenkkapsel zu einem Fluoreszenzsignal führt, das das Signal aus dem Gelenk verfälschen würde.

<table><tbody><tr><td>10x Phosphatgepuffertes Kochsalzlösung</td><td>Protech</td><td>PBS01-32R</td><td>oder gleichwertiger</td></tr><tr>Isofluran-Verdampfer mit Luftanästhesiesystem<td></td><td></td><td></td><td>mit Induktionskammer und Nasenkonus</td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td></td><td></td><td>Analgetikum nach Verletzung&nbsp;</td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Veet</td><td>B001KYPZ4G</td><td>oder</td></tr><tr><td>gleichwertige Halterungen</td><td></td><td></td><td>Maßgeschneiderte Kniebefestigung, Knöchelbefestigung und Plattform</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Kann auch ein vergleichbares optisches Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>der Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>06-666</td><td>oder eine gleichwertige</td></tr><tr><td>Living Image-Software verwenden.</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Werkstoffprüfsysteme&nbsp;</td><td>TA Instruments</td><td></td><td>Electroforce 3200 oder gleichwertiger</td></tr><tr><td>ProSense680</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEV10003</td><td>Kann auch andere Sonden wie OsteoSense, MMPSense, Cat K, AngioSense usw. verwenden.</td></tr><tr><td>Sterile Spritze mit</td><td>Nadelspektrum Chemical Mfg. Corp.</td><td>550-82231-CS</td><td>Covidien 1 mL TB Spritze mit 28 G x 1/2 Zoll Nadel-, sterile oder gleichwertige</td></tr><tr><td>einachsige Wägezelle</td><td>TA Instruments</td><td></td><td>mit einer Kapazität von 20 N</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-0236</td><td>oder gleichwertige</td></tr><tr><td>WinTest-Software&nbsp;</td><td>TA Instruments</td><td></td><td>kompatibel mit Electroforce 3200</td></tr></tbody></table>

nicht-invasive kompressionsinduzierte verletzung des vorderen kreuzbandes (acl) und in-vivo-bildgebung der proteaseaktivität bei mäusen

Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice

Traumatische Gelenkverletzungen wie der Riss des vorderen Kreuzbandes (ACL) oder Meniskusrisse führen häufig innerhalb von 10 bis 20 Jahren nach der Verletzung zu einer posttraumatischen Arthrose (PTOA). Das Verständnis der frühen biologischen Prozesse, die durch Gelenkverletzungen ausgelöst werden (z. B. Entzündungen, Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), Cathepsin-Proteasen, Knochenresorption), ist entscheidend für das Verständnis der Ätiologie von PTOA. Es gibt jedoch nur wenige Möglichkeiten für die In-vivo-Messung dieser biologischen Prozesse, und die frühen biologischen Reaktionen können verfälscht werden, wenn invasive chirurgische Techniken oder Injektionen verwendet werden, um OA zu initiieren. In unseren Studien zu PTOA haben wir kommerziell erhältliche Nahinfrarot-Protease-aktivierbare Sonden in Kombination mit Fluoreszenz-Reflektanz-Bildgebung (FRI) verwendet, um die Proteaseaktivität in vivo nach nicht-invasiver kompressionsinduzierter ACL-Verletzung bei Mäusen zu quantifizieren. Diese nicht-invasive ACL-Verletzungsmethode rekapituliert klinisch relevante Verletzungszustände genau und ist vollständig aseptisch, da sie weder die Haut noch die Gelenkkapsel stört. Die Kombination dieser Verletzungs- und bildgebenden Verfahren ermöglicht es uns, den zeitlichen Verlauf der Proteaseaktivität zu mehreren Zeitpunkten nach einer traumatischen Gelenkverletzung zu untersuchen.

Nach Anwendung einer einzelnen Druckkraft (1 mm/s bis zur Verletzung) auf die Unterschenkel von 3 Monate alten männlichen C57BL/6J-Mäusen wurde bei allen Mäusen konsistent eine ACL-Verletzung induziert. Die durchschnittliche Druckkraft bei Knieverletzungen betrug etwa 10 N (Abbildung 1).
Die FRI-Analyse zeigte eine signifikant höhere Proteaseaktivität in den verletzten Gelenken von Mäusen, die 7 Tage nach der Verletzung einer nicht-invasiven ACL-Verletzung ausgese...

Die nicht-invasive ACL-Verletzung ist eine zuverlässige und klinisch relevante Methode zur Initiierung der posttraumatischen Osteoarthritis (PTOA) bei Mäusen. Diese Verletzungsmethode ermöglicht auch die In-vivo-Quantifizierung der Proteaseaktivität im Gelenk zu frühen Zeitpunkten nach der Verletzung unter Verwendung von Protease-aktivierbaren Nahinfrarotsonden und Fluoreszenzreflexionsbildgebung.

Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within ...

Unser Labor verwendet Mausmodelle der posttraumatischen Arthrose, um frühe Prozesse nach Gelenkverletzungen wie vorderen Kreuzband- oder ACL-Rupturen zu untersuchen und zu untersuchen, wie diese frühen Ereignisse zu Gewebedegeneration und Arthroseprogression führen können. Insbesondere sind wir daran interessiert zu erfahren, wie sich Bewegung oder Ruhe nach einer Verletzung auf die langfristige Gesundheit der Gelenke auswirken können. Es gibt viele Tiermodelle für Arthrose, die alle für die Untersuchung bestimmter Forschungsfragen nützlich sind.Einige der experimentellen Herausforderungen in diesem Bereich sind die Auswahl der geeigneten Modelle Ihrer Studie, die Bestimmung, welche Techniken zur Bewertung der OA-Progression verwendet werden sollen und zu welchem Zeitpunkt Sie diese Analyse durchführen werden. Diese Knieverletzungsmethode ist sehr schnell und einfach durchzuführen. Die Verwendung nichtinvasiver kompressionsinduzierter Verletzungen ermöglicht es uns auch, die Gelenkreaktion zu frühen Zeitpunkten zu untersuchen, und da es keinen chirurgischen Eingriff gibt, können wir die optische In-vivo-Bildgebung verwenden, um die Proteus-Aktivität in ihrem Gelenk zu verfolgen.In Zukunft planen wir, verschiedene genetische Stämme von Mäusen zu verwenden, von denen einige anfällig für Arthrose und andere gegen Arthrose resistent sind, um festzustellen, wie bestimmte Aspekte der Entzündungsreaktion entweder zur Gelenkheilung oder zur Gelenkdegeneration nach Verletzungen beitragen.

non-invasive-compression-induced-anterior-cruciate-ligament-acl

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Für zukünftige Anwendungen als Patch zu Teil Tränen des vorderen Kreuzbandes (ACL) zu reparieren, wurden menschliche ACL abgeleitet von Zellen während rekonstruktive Verfahren, in vitro erweitert und Tissue Engineering Scaffolds gewachsen erhalten Gewebe isoliert. Zelladhäsion und Morphologie wurde dann durchgeführt, um die Biokompatibilität auf Gerüstoberfläche bestätigen.

Chirurgische Retrieval, Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Erweiterung des menschlichen vorderen Kreuzbandes abgeleiteten Zellen für Tissue Engineering Anwendungen

Tiermodelle sind wichtige Werkzeuge für die Bewertung von Tissue-Engineering-Transplantaten. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Herstellung eines elektrogesponnenen, biologisch abbaubaren Polymertransplantats für die Verwendung im Tissue Engineering des vorderen Kreuzbandes sowie ein chirurgisches Protokoll für die Implantation in ein Rattenmodell vorgestellt.

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Hier präsentieren wir das zyklisch belastungsinduzierte intraartikuläre Knorpelläsionsmodell des Rattenknies, das durch 60 zyklische Kompressionen über 20 N erzeugt wird, was bei Ratten zu einer Schädigung des femoralen Kondylenknorpels führt.

Eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung des zyklischen Belastungsinduzierten intraartikulären Knorpelläsionsmodells des Rattenknies

Das vorliegende Protokoll beschreibt die kontrollierten Mikroklingenkratzer auf der Oberfläche des Gelenkknorpels nach Destabilisierung des Mausknies durch Schneiden des medialen Miniscotibialbandes. Dieses Tiermodell stellt eine beschleunigte Form der Osteoarthritis (OA) dar, die für die Untersuchung der Osteophytenbildung, Osteosklerose und Schmerzen im Frühstadium geeignet ist.

Destabilisierung des medialen Meniskus- und Knorpelkratzmurinmodells der beschleunigten Arthrose

Darin beschreiben wir eine chirurgische Methode zur Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes (ACL) als zuverlässiges Modell zur Induktion von Kniearthrose bei Nagetieren und Methoden zur Entnahme von Kniesynovialflüssigkeit, zur Messung von Knieödemen und zur Beurteilung des Schweregrads der Osteoarthritis.

Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes und Synovialflüssigkeitsspülung in einem Nagetiermodell zur Untersuchung von Gelenkentzündungen und posttraumatischer Osteoarthritis

Ein In vivo Nager-Modell der Kontraktion-induzierte Verletzung und nicht-invasive Überwachung von Recovery

Wir kombinierten Frequenz-Domain-Nahinfrarot-Spektroskopie Maßnahmen der zerebralen Oxygenierung des Hämoglobins mit diffuser Korrelations-Spektroskopie Maßnahmen des zerebralen Blutflusses Index einen Index der Sauerstoff-Stoffwechsel zu schätzen. Wir testeten den Nutzen dieser Maßnahme als Nachttisch Screening-Tool, um die Gesundheit und Entwicklung des Neugeborenen Gehirns zu beurteilen.

Non-invasive optische Messung des zerebralen Metabolismus und Hämodynamik bei Säuglingen

Eine neue Technik, um eine reproduzierbare...

Controlled Cervical Laceration Verletzungen in Mäuse

Ein neuer Ansatz, der intraokularen Transplantation und konfokale Mikroskopie ermöglicht Längs-, non-invasive Bildgebung in Echtzeit mit Single-Cell Auflösung innerhalb gepfropft...

Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit

Wir beschreiben Modelle der mittelschweren und schweren Ischämie-Reperfusion-induzierte Nierenschädigung, in denen die Mäuse unterziehen einseitige renale Stiel Klemm gefolgt durch gleichzeitige oder verzögerte kontralaterale Nephrektomie sind. Diese Modelle konsequent führen zu Nierenfunktionsstörungen und posttraumatische Fibrose, aber Verletzungsschwere und Überleben sind abhängig von Maus Hintergrund, Alter und chirurgischen Einrichtungen.

Ischämie-Reperfusion-Modell des akuten Nierenschädigung und nach der Verletzung Fibrose bei Mäusen

Erfahren Sie eine nicht-invasive ACL-Verletzungsmethode bei Mäusen zur Untersuchung posttraumatischer Arthrose. Diese Technik ermöglicht die In-vivo-Quantifizierung von Proteaseaktivität im Gelenk direkt nach Verletzung.

Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen (Video) | JoVE Journal

Nicht-invasive kompressionsinduzierte Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) und In-vivo-Bildgebung der Proteaseaktivität bei Mäusen

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