Name: Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Erfahren Sie ein schnelles Blutperfusionsprotokoll für Transkriptomik und Proteomik mit Xenopus laevis und Xenopus tropicalis. Diese Methode verbessert die Probenqualität und ermöglicht reproduzierbare Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch den OD R24 Grant OD031956 und den NICHD R01 Grant HD073104 unterstützt. Wir danken Darcy Kelly für hilfreiche Diskussionen und erste Anregungen zu diesem Protokoll. Wir möchten uns auch bei Samantha Jalbert, Jill Ralston und Wil Ratzan für ihre Hilfe und Unterstützung sowie bei unseren drei anonymen Peer-Reviewern für ihr Feedback bedanken.

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3) durchgeführt.
ANMERKUNG: Obwohl die beschriebene primäre Methode der Euthanasie von der American Veterinary Medical Association12 als akzeptable Technik für die Euthanasie angesehen wird, wurde nicht festgestellt, dass sie zum Stillstand eines Herzschlags führt13. Auch die häufig angewandte sekundäre Methode des doppelten Sagenmachens verhindert dies nicht, ebenso wenig wie die Entnahme des Herzens aus dem Tier. Die Ausblutung von betäubten Tieren gilt als humane und effektive Methode für eine erfolgreiche Euthanasie12. Da die Erhaltung von frischem Gewebe durch Euthanasie das Ziel dieses Protokolls ist, ist es von Vorteil, dass das Herz während der primären Euthanasie mit MS-222 weiter schlägt und dass die Perfusion selbst eine sekundäre Euthanasiemethode durch Ausblutung ist.
1. Vorbereitung
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Forschungseinrichtung die in diesem Protokoll beschriebene Euthanasie- und Perfusionstechnik genehmigt hat.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung aus 5 g/l MS-222 (Tricainmethansulfonat) und 5 g/l Natriumbicarbonat vor. Das Volumen sollte größer sein als das Volumen, das erforderlich ist, um die einzuschläfernden Tiere vollständig zu bedecken. Überprüfen Sie den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er ≥7 beträgt.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 μl 180 U/ml Heparin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro X. laevis oder 200 μl pro X. tropicalis vor.</li>
	<li>Führen Sie eine primäre Euthanasie durch, indem Sie den Xenopus in diese Lösung geben (aus Schritt 1.2). Das Tier bleibt insgesamt 1 Stunde unter Wasser.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass der Xenopus seine Schmerzreaktion verloren hat, indem Sie den Fuß 15 Minuten nach der Euthanasie einklemmen. Wenn das Tier reaktiv ist, geben Sie es der Euthanasielösung zurück, bis diese Reaktion verloren geht.</li>
	<li>Wiegen Sie den Xenopus und nehmen Sie alle zusätzlichen Messungen vor, die vor der Probenahme erforderlich sind.</li>
	<li>Injizieren Sie X. laevis mit einer 31-G-Nadel mit 250 μl und X. tropicalis mit 100 μl 180 U/ml Heparin in PBS (aus Schritt 1.3) in die Muskulatur jeder Vordergliedmaße.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung von 1 ml/g des Tiergewichts von 54 U/ml Heparin in PBS-Perfusat vor. Personen, die mehr Erfahrung mit diesem Protokoll haben, können feststellen, dass weniger Medien erforderlich sind, um die Perfusion abzuschließen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 22 g Injektionsnadel für die Perfusion von X. laevis und eine 25 g Injektionsnadel für X. tropicali s. Stumpfen Sie die Perfusionsnadel, indem Sie die Spitze mit einem Drahtschneider abschneiden (Abbildung 1)14. Anmerkungen: Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die Nadel durch die Herzkammer perforiert, wenn sie verschoben wird. Zusätzlich zur Abstumpfung kann die Nadel mit einem Schleifstein oder einer Feile leicht abgeschliffen werden, bleibt aber immer noch scharf genug, um die Herzkammer zu durchbohren.</li>
	<li>Bereiten Sie die Pumpe vor, indem Sie die gekürzte Nadel anbringen und 54 U/ml heparinisiertes PBS-Perfusat zirkulieren lassen (aus Schritt 1.8). Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus dem Schlauch entfernt werden, um die Möglichkeit einer Luftembolie auszuschließen, die zu einer verminderten Perfusionseffizienz oder einem Versagen führt (siehe Tabelle 1). Bewahren Sie das Perfusionsmedium für die Dauer des Eingriffs auf Eis auf.</li>
	<li>Wenn die Pumpe nicht programmierbar ist, messen Sie bei eingesetzter Nadel das Fördervolumen des Mediums unter den verschiedenen Einstellungen, um zu bestimmen, welche Einstellungen 5 ml/min und 10 ml/min am nächsten kommen. Diese Durchflussraten werden unabhängig von der Art verwendet. Wenn die Perfusionspumpe programmierbar ist, kalibrieren Sie sie mit eingesetzter Nadel gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Platzieren Sie die Dissektionsfläche (Schale oder Schaumstoffplatte) schräg in einem sekundären Behälter oder ordnen Sie sie so an, dass sie den Blutabfluss erleichtert.</li>
	<li>Sobald der Frosch 1 h in der Lösung war, ist die primäre Euthanasie abgeschlossen. Entfernen Sie den Frosch und überprüfen Sie den Verlust der Schmerzreaktion erneut, indem Sie einen Fuß kneifen lassen.</li>
	<li>Legen Sie den Frosch auf den Rücken und stecken Sie jedes Glied fest (Abbildung 2). Wenn das Gewebe der Gliedmaßen erhalten werden muss, können dünne Stifte durch die Finger oder U-förmige Klammern um die Gliedmaßen gelegt werden.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Sezierschere durch die Haut, die Mittellinie hinauf und dann seitlich, so dass zwei Klappen entstehen. (Abbildung 2)</li>
	<li>Fassen Sie die Linea alba mit einer Pinzette und ziehen Sie sie von der Zölomhöhle weg (Abbildung 3). Schneiden Sie vorsichtig mit einer Schere durch die Muskulatur. Machen Sie zwei Klappen aus der Hohlraumwand und schneiden oder stecken Sie alle Klappen aus dem Weg.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Dissektionsschere, um die Coracoideusknochen zu durchtrennen und überschüssiges Gewebe wegzuschneiden, um einen besseren Zugang zum Herzen zu erhalten (Abbildung 3).</li>
	<li>Das Herz sollte noch schlagen. Wenn das Herz vor der Perfusion aufgehört hat zu schlagen, beachten Sie, dass die Frische der Probe beeinträchtigt wurde.</li>
</ol>2. Perfusion
<ol><li>Identifizieren Sie den Magen und verschieben Sie ihn sanft so, dass er sich auf dem linken Leberlappen (auf der rechten Seite des Betrachters) befindet und sein Gefäßsystem für die Dauer des Eingriffs sichtbar ist. Identifizieren Sie eine Lunge und fassen Sie sie mit einer Gewebezange an der Spitze. Ziehen Sie die Lunge aus der Zölomhöhle heraus und stecken Sie sie durch die Spitze (Abbildung 4). Tun Sie dies vorsichtig, da geplatzte Blutgefäße nicht gut durchbluten. Achten Sie darauf, ob Blut im Lappen sichtbar ist, da dies die Fähigkeit beeinträchtigt, den Abschluss des Verfahrens zu bestimmen.</li>
	<li>Machen Sie ein Bild der Zölomhöhle, um die Perfusionseffizienz besser beurteilen und möglicherweise abnormales Gewebe zu einem späteren Zeitpunkt zu identifizieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie das dünne Perikard und ziehen Sie es mit einer Gewebezange (Abbildung 5). Perforieren Sie den Herzbeutel vorsichtig mit der Spitze der Iridektomieschere und achten Sie darauf, das darunter liegende Gewebe nicht zu schneiden. Schäle den Herzbeutel von den drei Herzkammern weg.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um den Ventrikel sanft an seiner Spitze zu fassen. Üben Sie einen begrenzten Druck aus, damit zwischen den Zugflächen der Pinzette genügend Platz für den Durchgang der Perfusionsnadel vorhanden ist (Abbildung 6).</li>
	<li>Führen Sie die Nadel durch den Verschluss der Pinzette in die Kammer der Herzkammer ein und achten Sie darauf, dass sie nicht durch die Herzkammer perforiert wird (Abbildung 7). Klemmen Sie die Gewebepinzette mit einem Nadelhalter mit einem Hämostaten fest. HINWEIS: Diese Technik stabilisiert die Position der Nadel, die immer noch scharf ist. Das Einklemmen der Nadel direkt in die Herzkammer führt ebenfalls zu unnötigen Schäden, was das Umspannen erschwert, falls dies erforderlich ist (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Starten Sie den Durchfluss der Pumpe bei ca. 5 ml/min. Die drei Kammern des Herzens und des Truncus arterielle werden anschwellen (Abbildung 8; siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Lanzen Sie mit einer Schere vorsichtig die rechte Ohrmuschel (links vom Betrachter); Blut wird herausfließen. Stellen Sie die Flussrate auf 5 ml/min ein oder erhöhen Sie sie auf 10 ml/min.</li>
	<li>Fahren Sie fort, bis die Magengefäße blass sind (siehe Tabelle 1), dann lanzen Sie die linke Ohrmuschel des Herzens (rechts vom Betrachter). Wenn die Flussrate immer noch 5 ml/min beträgt, erhöhen Sie sie auf ca. 10 ml/min.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Zölomhöhle in Perfusionsmedien zu spülen, um die Sichtbarkeit zu erhalten und die Farbe des Perfusats, das aus den Ohrmuscheln fließt, besser beurteilen zu können.</li>
	<li>Lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle, bis das aus den Ohrmuscheln fließende Perfusat klar ist (siehe Tabelle 1) und die Lunge ihren roten Farbton verloren hat (siehe Tabelle 1; Abbildung 9).</li>
</ol>

Blutperfusion bei afrikanischen Krallenfröschen für die Transkriptomik und Proteomik

<ol><li>Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+perfusion+as+a+method+for+vascular+visualization+in+Ambystoma+mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+brain+of+the+adult+pipid+frog%2C+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts.</a> Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+urinary+bladder+in+the+adult+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts.</a> Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).</li>
<li>Lametschwandtner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+gallbladder+of+the+adult+South+African+clawed+toad%2C+Xenopus+laevis+Daudin%3A+A+scanning+electron+microscope+study+of+vascular+corrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts.</a> Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).</li>
<li>Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anatomy+of+the+non-lobulated+liver+of+adult+Xenopus+laevis%3A+A+scanning+electron+microscopic+study+of+vascular+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts.</a> Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).</li>
<li>Miodoński, A. J., Bär, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+supply+of+the+choriocapillaris+of+anuran+amphibians+%28Rana+temporaria%2C+Rana+esculenta%29.+Scanning+electron-microscopic+%28SEM%29+study+of+microcorrosion+casts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts.</a> Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).</li>
<li>Nenni, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%3A+Facilitating+the+use+of+Xenopus+to+model+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease.</a> Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).</li>
<li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus%3A+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).</li>
<li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+repertoire+in+early+vertebrate+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Briggs, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+gene+expression+in+vertebrate+embryogenesis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution.</a> Science. 360 (6392), (2018).</li>
<li>Liao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+landscape+of+larval+and+adult+Xenopus+laevis+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).</li>
<li>AVMA (American Veterinary Medical Association). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AVMA+guidelines+for+the+euthanasia+of+animals%2C+2020+edition%5BTitle%5D)+AND+%22AVMA%22%5BJournal%5D)">AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition.</a> AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).</li>
<li>Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bupivacaine+as+a+euthanasia+agent+for+African+Clawed+Frogs+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis).</a> PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Heinz-Taheny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+physiology+and+diseases+of+amphibians.+Veterinary+clinics+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Clinics+of+North+America.+Exotic+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America.</a> The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).</li>
<li>Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vertebrate+heart%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The vertebrate heart: an evolutionary perspective.</a> Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).</li>
<li>Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+protocol+for+lizards%2C+including+a+method+for+brain+removal%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal.</a> MethodsX. 2, 165-173 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt traditionelle Dissektionstechniken für den Zugang zur Zölomhöhle. Andere Techniken sind ebenfalls akzeptabel, vorausgesetzt, sie verursachen nur minimale Schäden am Gewebe, das Herz ist zugänglich und die Lunge und der Magen sind sichtbar. Ebenso können die meisten aufgeführten Sezierwerkzeuge leicht durch vergleichbare Gegenstände ersetzt werden.
Obwohl versucht wurde, die Wirksamkeit dieses Verfahrens zu optimieren, können die Ergebnisse je nach Erfahrung und Vari...

Die Ganzkörperperfusion von Amphibien wird routinemäßig zum Zwecke der Konservierung und Fixierung durchgeführt 1,2,3,4,5,6. Diese Verfahren erfolgen jedoch in einem Tempo, das die Anzahl der frischen Proben, die pro Tier entnommen werden können, begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein effektives Blutperfusionsprotokoll in Xenopus zu entwickeln, wobei die Geschwindigkeit der Technik im Vordergrund steht. Das Protokoll dauert weniger als 10 Minuten pro Tier für X. tropicalis und weniger als 15 Minuten pro X. laevis-Tier. Die sekundären Prioritäten sind die einfache Replikation und die Verwendung von leicht zu beschaffenden Geräten, so dass qualitativ hochwertige Proben zwischen den Xenopus-Laboren ausgetauscht werden können.
Xenopus-Frösche werden in der biomedizinischen Forschung häufig eingesetzt, um grundlegende biologische und pathologische Prozesse zu untersuchen, die über Arten hinweg konserviert sind. Dieser Tetrapode hat eine engere evolutionäre Beziehung zu Säugetieren als andere aquatische Modelle, da er Lungen, ein Dreikammerherz und Gliedmaßen mit Fingern hat. Die internationale Gemeinschaft nutzt Xenopus effektiv, um durch eingehende Krankheitsmodellierung und molekulare Analyse der krankheitsbedingten Genfunktion ein tieferes Verständnis menschlicher Krankheiten zu erlangen. Die zahlreichen Vorteile von Xenopus als Tiermodell machen sie zu unschätzbaren Werkzeugen, um die molekularen Grundlagen der menschlichen Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Zu diesen Vorteilen gehören: große Eizell- und Embryogröße, hohe Fruchtbarkeit, einfache Unterbringung, schnelle äußere Entwicklung und einfache genomische Manipulation. Es wird geschätzt, dass Xenopus ~80% der identifizierten menschlichen Krankheitsgene teilen7.
Im Vergleich zu populären Säugetiermodellen ist Xenopus ein schnelles, kostengünstiges Modell, das sich leicht mit dem Morpholino-Knockdown und der Verfügbarkeit effizienter Transgene und gezielter Genmutationen unter Verwendung von CRISPR8 auszeichnet. Quantitative Massenspektrometrie und Einzelzell-Transkriptomik wurden erfolgreich auf Xenopus-Embryonen angewendet9,10, aber ein aktueller Zellatlas von Xenopus laevis zeigt, dass die Zusammensetzung der meisten Gewebe von Blutzelltypen dominiert wird 11. Durch die Entwicklung einer Technik, die Gewebe schnell ausblutet, und unter Verwendung von gekühlten Medien wird die Probenfrische durch die Perfusion nur minimal beeinträchtigt. Dies ist besonders wichtig für Anwendungen, bei denen es darum geht, eine physiologisch ungestörte mRNA- oder Proteinexpression zu profilieren.

<table><tbody><tr><td>5x Lupe mit LED-Licht und Stativ</td><td>amazon.com</td><td></td><td>B08QJ6J8P1 Licht darf keine Hitze erzeugen</td></tr><tr><td>Einweg-Transferpipetten</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange mit feiner</td><td>Spitze Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere scharfer Piont, gerade 6,5"</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschale</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>Styroporplatten sind eine akzeptable Alternative</td></tr><tr><td>Euthanasiebehälter</td><td>US Plastic</td><td>Artikel&nbsp; 2860</td><td>alternative undurchsichtige Behälter akzeptabel</td></tr><tr><td>Euthanasie-Behälterdeckel</td><td>US-Kunststoffartikel</td><td>&nbsp; 3047</td><td></td></tr><tr><td>Feindissektionsnadeln</td> Living <td>Systems Instrumentation</td><td>PIN-#3</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadeln für den allgemeinen Gebrauch, 22 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5A</td><td>für X. laevis</td></tr><tr><td>Injektionsnadeln für den allgemeinen Gebrauch, 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>für X. tropicalis</td></tr><tr><td>Heparin, Darmschleimhaut von Schweinen</td><td>MilliporeSigma</td><td>37-505-410MG</td><td></td></tr><tr><td>Iridektomieschere 6"</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>Irisschere ist eine akzeptable Alternative</td></tr><tr><td>Luer-zu-Widerhaken-Adapter männlicher Luer mit Sicherungsring</td><td>amazon.com</td><td>B09PTX6M2Z</td><td>Größe hängt von der Spritzung der Pumpe ab verwendeter</td></tr><tr><td>Mayo-Hegar-Nadelhalter</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-966</td><td>Mückenzange sind eine akzeptable Alternative</td></tr><tr><td>MS-222: Syncain (ehemals Tricain)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische Flüssigkeitspumpe Dosierpumpe 5&ndash; 100 mL/min</td><td>amazon.com</td><td>B07PWY4SM6</td><td>jede Peristaltikpumpe, die 5-10 mL/min pumpen kann, ist akzeptabel</td></tr><tr><td>Schleifstein</td><td>VWR</td><td>470150-112</td><td>optional; zum Stumpfen von Nadeln</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat, Pulver, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Probenzange, gezahnt</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins zum Präparieren</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeine kurze Insulinspritzen, 31 g</td><td>VWR</td><td>BD328438</td><td></td></tr><tr><td>Drahtspülschneider, ultrascharfe und leistungsstarke 6-Zoll-Seitenschneider</td><td>amazon.com</td><td>B087P191LP</td><td></td></tr></tbody></table>

effektive schnelle blutdurchblutung bei xenopus

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

Xenopus sind seit über 100 Jahren leistungsfähige Modellorganismen für das Verständnis der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren. Hier wird ein schnelles Blutdurchblutungsprotokoll bei Xenopus definiert, das auf eine konsistente und drastische Reduzierung des Blutes in allen Geweben abzielt. Die Perfusion erfolgt durch das Einführen einer Nadel direkt in die Herzkammer und das Pumpen von heparinisierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch das Gefäßsystem. Die Prozedur kann in ca. 10 Minuten pro Tier durchgeführt werden. Das Blut wird von einigen wenigen Proteinen und Zelltypen dominiert, die sehr häufig vorkommen, was zu zahlreichen Problemen führt, da diese Proteine die meisten anderen Moleküle und Zelltypen von Interesse maskieren. Die reproduzierbare Charakterisierung von adulten Xenopus-Geweben mit quantitativer Proteomik und Einzelzell-Transkriptomik wird von der Anwendung dieses Protokolls vor der Organentnahme profitieren. Die Protokolle für die Gewebeentnahme sind in Begleitpapieren definiert. Diese Verfahren zielen auf die Standardisierung von Praktiken bei Xenopus unterschiedlichen Geschlechts, Alters und Gesundheitszustands ab, insbesondere bei X. laevis und X. tropicalis.

Nach erfolgreicher Durchblutung sind alle Gewebe (mit Ausnahme der Leber bei pigmentiertem Xenopus) deutlich heller und weniger durchblutet. Die großen Blutgefäße werden weniger auffällig (Abbildung 10), und das Gewebe (mit Ausnahme der Leber) wird nach der Entnahme sauber im Puffer gespült. Während die erfolgreiche Durchführung des Protokolls letztlich nur durch die Qualität der Daten aus exbluteten Gewebeproben bestätigt werden kann, werden in der Tabelle zur Fehlerbehebung einige...

Hier wird ein effektives Protokoll zur schnellen Blutperfusion vorgestellt, um Gewebeproben von afrikanischen Krallenfröschen für Transkriptomik- und Proteomik-Studien vorzubereiten.

Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

Im Mittelpunkt dieses Verfahrens steht die humane Nutzung von Amphibienmodellen in einer Weise, die die Effizienz maximiert. Standardisierungspraktiken können auf Proben angewendet werden, die in der Ursprungskolonie entnommen und aufbewahrt werden, wodurch Biosicherheitsrisiken gemindert und Tiertransportstress vermieden werden. Die Fülle kann schnell abgeschlossen werden, wodurch die Zeit maximiert wird, die für die Entnahme von Gewebeproben zur Verfügung steht, solange sie noch frisch sind.Diese Frische ist besonders wichtig für das proteomische und transkriptomische Profiling. Dieses Protokoll ist detailliert und explizit, so dass es für Personen mit den unterschiedlichsten Hintergründen verwendet werden kann. Dies erleichtert den Austausch von qualitativ hochwertigen Proben zwischen Xenopus-Laboren.Neben dieser Schmelztechnik wird an einem ähnlich umfassenden Protokoll für die standardisierte Probenahme aller wichtigen Organe gearbeitet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll zeigt eine fluoreszenzbasierte Methode zur Visualisierung der Vaskulatur und zur Quantifizierung ihrer Komplexität in Xenopus tropicalis . Blutgefäße können nach der Injektion eines fluoreszierenden Farbstoffs in das schlagende Herz eines Embryos nach genetischen und / oder pharmakologischen Manipulationen abgebildet werden, um die kardiovaskuläre Entwicklung in vivo zu untersuchen.

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Unter Verwendung einer lipophilen 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI) -Färbetechnik kann Ambystoma mexicanum eine vaskuläre Perfusion durchlaufen, um eine leichte Visualisierung des Gefäßsystems zu ermöglichen.

DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Normothermic Ex Situ Herz Perfusion (ESHP), bewahrt das Herz in einem schlagen, semi-physiologischen Zustand. Wenn in einem Arbeitsmodus durchgeführt, bietet ESHP die Möglichkeit, anspruchsvolle Assessments des Spenders durchzuführen Herz Funktion und Orgel Lebensfähigkeit. Hier beschreiben wir unsere Methode zur myokardialen Leistungsbewertung während ESHP.

Normothermic Ex-Situ Herz Perfusion im Arbeitsmodus: Beurteilung der Herzfunktion und Stoffwechsel

Hier wird ein Protokoll der ex vivo mütterlich-fetalen Gefäßperfusion vorgestellt, um die Verabreichung eines Testartikels in die mütterliche Vaskulatur zu ermöglichen und die plazentale Übertragung von xenobiotischen Partikeln oder pharmakologischen Wirkstoffen zu bewerten, zusätzlich zu den Veränderungen in Plazentale Physiologie.

Ex Vivo Perfusion der Rodent Placenta

Ein Protokoll wird für die In-situ-Perfusion des Unterkörpers der Maus beschrieben, einschließlich der Blase, der Prostata, der Geschlechtsorgane, des Knochens, des Muskels und der Fußhaut.

Etablierung von In Situ Closed Circuit Perfusion von unteren Bauchorganen und Hinterbeinen bei Mäusen

Dieser Artikel stellt einen Leitfaden für die Probenahme von sechs wichtigen und unterschiedlichen Organen bei erwachsenen Xenopus vor, auf die schnell und einfach zugegriffen werden kann: Herzventrikel, Leberlappen, Bauchspeicheldrüse, Fettkörper, paarige Nieren und Haut.

Techniken zur schnellen Probenahme von sechs wichtigen Organen bei erwachsenen Xenopus

Dieses Protokoll stellt eine schnelle Methode für die quantitative dreidimensionale Gefäßbildgebung mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie vor. Die Wirksamkeit der Methode wird anhand des pharyngealen Bogenarteriensystems des Hühnerembryomodells demonstriert, wobei die hämodynamischen Kräfte mittels Computational Fluid Dynamics quantifiziert werden.

Schnelle hochauflösende Bildgebung des Gefäßsystems von Kleintieren für quantitative Studien

Dies ist der erste Teil eines umfassenden Xenopus-Sampling-Protokolls. Bei den entnommenen Geweben handelt es sich um den Herzventrikel, den arteriellen Stamm, den linken Leberlappen, die Gallenblase, die Lunge, die Bauchspeicheldrüse, die Milz, den Kehlkopf, den Kehlkopf, die Speiseröhre, den Magen, den Darm, die Hoden, die Fettkörper, den Eileiter, die paarigen Nieren, den Ischiasplexus, die Haut, den Thymus und das ganze Auge.

Effiziente Techniken für eine umfassende Probenahme von zugänglichem Gewebe bei adulten Xenopus

Hier stellen wir ein Protokoll für ein quelloffenes, modifizierbares normothermisches ex vivo-Perfusionssystem vor, das entwickelt wurde, um die hohen Kosten und die begrenzte Flexibilität bestehender Plattformen zu überwinden und einen zugänglicheren, kosteneffizienteren und iterativen Einsatz in der präklinischen biomedizinischen Forschung zu ermöglichen.

Ein Open-Source-Normotherm-Perfusionssystem, das für Forschungswissenschaftler entwickelt wurde

Erfahren Sie ein schnelles Blutperfusionsprotokoll für Transkriptomik und Proteomik mit Xenopus laevis und Xenopus tropicalis. Diese Methode verbessert die Probenqualität und ermöglicht reproduzierbare Forschung.

Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus

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