Name: Analyse der mitochondrialen Dichte und Längsverteilung in lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten mittels konfokaler Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Analyse mitochondrialer Dichte und Verteilung in lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten mittels konfokaler Mikroskopie. Diese quantitative Methode erfasst Netzwerkveränderungen bei physiologischem und pathologischem Stress.

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Diese Arbeit wurde von der Medizinischen Fakultät und dem Institut für Adipositasforschung von Tecnologico de Monterrey unterstützt. Abbildung 3A wurde mit der Software Scientific Image and Illustration erstellt.

Konfokale mikroskopische Analyse von Mitochondrien der Rattenmuskulatur

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<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Mitochondrien sind Organellen mit einer hohen Umbaukapazität. Ihr Inhalt, ihre Dichte und ihre Verteilung können durch die Aktivierung der mitochondrialen Fusions- und Spaltungsmechanismen, bekannt als mitochondriale Dynamik1, und das Gleichgewicht zwischen den mitochondrialen Umsatzmechanismen, der mitochondrialen Biogenese und dem spezialisierten Mitochondrienabbauweg, der Mitophagie, schnell verändert werden21,22. Der Gehalt und die Morphologie der Mitochondrien können je nach Zelltyp und Entwicklungsstadium variieren und können unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Stimuli umgebaut werden 17,22,23,24. Daher ist die Untersuchung der mitochondrialen Morphologie seit über einem halben Jahrhundert relevant25. Insbesondere die Analyse von Mitochondrien durch Elektronenmikroskopie war die Standardtechnik, die in mehreren Studien angewendet wurde26.
Fluoreszenzstudien mittels konfokaler Mikroskopie haben in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, da sie die Bildgebung von Mitochondrien in verschiedenen Fasertiefen in lebenden Zellen ermöglichen, was dazu beitragen könnte, die Rolle der Mitochondrien in der Skelettmuskulatur unter verschiedenen adaptiven und maladaptiven Bedingungen besser zu verstehen27. In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Analyse der Mitochondriendichte und -verteilung in lebenden Skelettmuskelfasern mittels konfokaler Mikroskopie beschrieben. Eine der größten Herausforderungen bei der Arbeit mit lebenden Skelettmuskelfasern besteht darin, eine Kontraktion von den Isolationsprozessen bis hin zur mitochondrialen konfokalen Ableitung zu vermeiden. Um dieses Ziel zu erreichen, wird eine hohe Mg- und ATP-Relax-Lösung17 verwendet, um die Fasern für mindestens 2 h entspannt zu halten, was genügend Zeit gibt, um den Faserisolationsprozess, die Fluorophorbelastung und die Erfassung des mitochondrialen Signals durch konfokale Mikroskopie durchzuführen. Ein kritischer Punkt des Protokolls ist die mechanische Gewinnung der Fasern, da dies eine hohe Präzision und frisches Gewebe erfordert. Es ist jedoch möglich, lebensfähige Faserbündel aus Rattenmuskeln mit dieser zuvor verwendeten und berichteten Technik28 zu erhalten. Die Gewinnung intakter Fasern ermöglicht es, das Sarkolemma und die intrazelluläre Umgebung zu erhalten und die metabolische und funktionelle Wechselwirkung zwischen Zellstrukturen aufrechtzuerhalten28,29.
Im Gegensatz zur Arbeit mit Geweben oder fixierten Zellen ermöglicht die Aufnahme von Fluoreszenzbildern mit konfokaler Mikroskopie die Echtzeitüberwachung der Auswirkungen verschiedener experimenteller Bedingungen. Das vorliegende Protokoll kann verwendet werden, um Veränderungen der mitochondrialen Dichte und Verteilung in Echtzeit zu untersuchen und Unterschiede zwischen experimentellen Gruppen zu untersuchen, wie z. B. die hier vorgestellten Beispiele zwischen Lean- und Ob-abgeleiteten Fasern (Abbildung 3 und Abbildung 4). Es sollte immer bedacht werden, dass die Bildgebung lebender Zellen die Standardisierung optimaler Arbeitsbedingungen mit geringfügigen Zellschäden impliziert. Die Arbeitszeit, die Qualität der verwendeten Lösungen, die Erfassungsparameter und die Belichtung der Laser müssen genau kontrolliert werden. Daher werden im Folgenden wesentliche Überlegungen angestellt.
Mitochondrien von Muskelfasern können aufgrund der Größe der Faser und der Schädigung der Faser, die durch eine lange Laserbelichtung verursacht werden kann, nicht vollständig longitudinal durch konfokale Mikroskopie erfasst werden. Dennoch wird bei dieser Technik eine repräsentative Probe der Faser aufgenommen. Obwohl es möglich ist, die gesamte Dicke der Skelettmuskelfaser einer Ratte durch konfokale Mikroskopie zu erfassen, bedeutet dies eine längere Aufnahmezeit und Exposition gegenüber dem Laserstrahl. Bei Kontrollratten traten keine Probleme mit diesen Aufzeichnungen auf. Fasern aus pathologischen Zuständen können jedoch anfälliger für Schäden sein, wie bei den Fasern von Ob-Ratten beobachtet wurde. Folglich wird die Aufnahme eines Stapels repräsentativer konfokaler Bilder, die bei unterschiedlichen Z-Entfernungen aufgenommen wurden, bevorzugt. Wenn nur ein Abschnitt der Faserdicke aufgezeichnet wird, wird empfohlen, den Stapel auf allen getesteten Fasern in der gleichen Tiefe zu nehmen, da die mitochondriale Verteilung und Dichte je nach Position innerhalb der Faser variieren kann. Es wird empfohlen, das Signal in einer Tiefe von über 15 μm zu erfassen, um repräsentative konfokale Bilder von IMF zu erhalten und SSM-Populationen zu vermeiden, die sich in der Nähe der Peripherie befinden.
Bei der konfokalen Aufnahme müssen einige wichtige Überlegungen berücksichtigt werden. Zunächst die Auswahl des Immersionsobjektivs unter Berücksichtigung der Vergrößerung, der hohen NA und des Immersionsmediums. Da die Zellen in einem hydrophilen Inkubationsmedium gehalten werden, muss der Brechungsindex des Inkubations- und Immersionsmediums ähnlich sein, um ein gutes Signal zu erhalten und tief in das Gewebe einzudringen. Dies wird in der Regel mit einem Wasserimmersionsobjektiv erreicht. Die konfokalen Bilder von Abbildung 3 und Abbildung 4 wurden mit einem 20-fachen, 0,7 NA Wasserimmersionsobjektiv aufgenommen. Dieses Objektiv ermöglicht die Aufnahme der Faser in ihrer gesamten Tiefe, aber es wurde für das Scannen bei 15, 18 und 21 μm entschieden, da repräsentative konfokale Bilder von IMF mit hohem Fluoreszenzintensitätssignal und geringer Faserbeschädigung erhalten werden können. Andere Vergrößerungen, wie z. B. 40x und Öl als Immersionsmedium, können in Betracht gezogen werden, müssen aber bewertet werden.
Zweitens wird die Pixelgröße für die Bildaufnahme nach dem Nyquist-Theorem berechnet, das die Auswahl einer geeigneten Pixelgröße ermöglicht, die Überabtastung (höhere Laserbelichtung) und Unterabtastung (führt zu geringerer Auflösung) vermeidet30. Die Berechnung hängt von den Eigenschaften des gewählten Objektivs und der Wellenlänge (~90 nm) ab. Es kann mit dem Zoom angepasst werden; Daher bietet nur eine Zoomeinstellung eine optimale Pixelgrößevon 30. Dennoch hängt der Zoom in der Praxis auch von der zu analysierenden Fläche der Probe ab. Das Finden der Balance ermöglicht es also, mit einer Pixelgröße zu arbeiten, die dem Nyquist-Kriterium am nächsten kommt und auch zu dem zu analysierenden Bereich passt. Abbildung 3 und Abbildung 4 wurden mit einer Pixelgröße von 150 und 190 nm aufgenommen, was eine Analyse der gesamten Breite der Faser von ~50-80 μm ermöglichte.
Drittens sollte ein geeigneter Lochblendendurchmesser verwendet werden, der verhindert, dass unscharfes Licht den Detektor erreicht. Typischerweise wird 1 Airy als die optimale Lochblendengröße angesehen, da sie die Detektion von ~80% der Photonen ermöglicht, die aus der Fokusebene30 stammen. Einige gefärbte biologische Proben, die niedrige Fluoreszenzwerte aufweisen, erfordern jedoch eine Lochblende30. Konfokale Bilder von Abbildung 3 und Abbildung 4 wurden mit einer Lochblendengröße von 3 Airy aufgenommen, da ein niedriges Signal mit einem niedrigeren Airy aufgenommen wurde. Es ist wichtig zu bedenken, dass der Anstieg der Signalintensität, der sich aus der Vergrößerung der Lochblenden ergibt, zu einer Verringerung der Auflösung aufgrund des erhöhten unscharfen eingefangenen Lichts führt. Aus diesem Grund empfehlen wir, eine Lochlochgröße zu verwenden, die so nah wie möglich an 1 airy liegt.
Bei entsprechender Aufnahme können konfokale Bilder verarbeitet werden, um quantitative Informationen über die Dichte und Verteilung der Mitochondrien zu erhalten. Unabhängig davon muss der kritische Verarbeitungsschritt des Bildes der Schwellwertbildung vor der Analyse durchgeführt werden, um die Quantifizierung des Signals zu verbessern. In diesem entscheidenden Schritt wird der Fluoreszenzintensitätswert definiert, der die positiven Pixel für Mitochondrien von denen des Hintergrunds trennt. Der Schwellenwert kann durch eine Gaußsche Anpassung des Peaks, der die Mitochondrien repräsentiert, definiert werden, wenn das Histogramm des Bildes zwei Peaks anzeigt, von denen einer dem Hintergrund und der andere den Mitochondrien entspricht. Allerdings wird nicht immer in jedem der Bilder eine bimodale Verteilung erreicht, so dass andere Schwellwertmethoden angewendet werden müssen.
In diesem Protokoll wird die Implementierung des Otsu-Schwellwerts beschrieben, bei dem es sich um ein nicht-parametrisches und unüberwachtes Verfahren handelt, das dazu bestimmt ist, den Schwellenwert zu finden, wenn die beiden Peaks nicht getrennt sind oder andere Peaks vorhanden sind31. Otsu kann einfach über eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder angewendet werden. Es können jedoch auch andere Schwellwertmethoden getestet werden. Die gleiche Schwellwertmethode muss auf alle konfokalen Bilder angewendet werden und muss für jedes konfokale Bild unabhängig berechnet werden. Das Anwenden des Schwellenwerts auf einen ganzen Stapel führt zu falschen Ergebnissen. Sobald die binären Bilder nach dem Schwellwertprozess erhalten sind, kann die Analyse der mitochondrialen Dichte und FFT einfach durchgeführt werden, indem die in diesem Protokoll beschriebenen Anweisungen befolgt werden. Bei der Durchführung beider Analysen sollte jedoch darauf geachtet werden, dass Kerne und Kapillaren nicht einbezogen werden, da dies zu Quantifizierungsfehlern führen würde. In Bezug auf die Dichte reicht es aus, die Pixel oder die Fläche, die von den Kernen oder Kapillaren eingenommen wird, von den zu analysierenden Pixeln oder der Gesamtfläche abzuziehen. Darüber hinaus muss bei der Durchführung der FFT-Analyse überprüft werden, ob das Mitochondriensignal gerade ist. Umgekehrt kann das Mitochondriensignal, wenn es gekippt ist, Profile erzeugen, die die mitochondriale Längsverteilung nicht repräsentieren, was zu falschen FFT-Spektrumdaten führt. Darüber hinaus kann ein Vorverarbeitungsschritt angewendet werden, um das Rauschen in den Bildern zu reduzieren. Dieses Protokoll beschreibt zwei optionale Vorverarbeitungsschritte mit einem Medianfilter und einer 2D-Dekonvolution. Die Auswirkungen dieser Vorverarbeitungsmethoden auf den Bild- und Mitochondriendichtegehalt sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Es ist wichtig zu bedenken, dass diese Vorprozesse zwar die Bildqualität verbessern können, aber auch zum Verlust bestimmter Bilddetails führen können. Daher sollten sie mit Vorsicht verwendet und konsequent auf alle analysierten Bilder angewendet werden.
Trotz ihrer Vorteile ist die konfokale Mikroskopie durch eine laterale Auflösung (XY) von 180-250 nm begrenzt, wenn die optimalen Bedingungen für die Erfassung erfüllt sind32. Der mitochondriale Durchmesser beträgt ~200-700 nm, nahe der Beugungsgrenze der konfokalen Mikroskopie; Daher können sub-mitochondriale Strukturen nicht adäquat detektiert werden33 und können nicht durch Dichte- und FFT-Analysen bewertet werden, die in diesem Protokoll gezeigt werden. Andere hochauflösende Techniken der Mikroskopie, wie z. B. die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), die Sted-Nanoskopie (Stimulated Emission Depletion) oder die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM), können erforscht werden, um submitochondriale Strukturen aufzulösen32. In diesem Protokoll werden die konfokalen Bilder der Mitochondrien mit dem Fluorophor TMRE aufgenommen, der vom mitochondrialen Membranpotential abhängt. Daher kann die mitochondriale Fluoreszenzintensität je nach ihrem Membranpotenzial variieren. Vor der Datenanalyse wird ein Schwellenwertprozess durchgeführt, um dieses Problem zu beheben. Alle Pixel, die über einem definierten Schwellenwert liegen, werden unabhängig von ihrem Fluoreszenzwert als positiv für das mitochondriale Signal angesehen. Dennoch muss beachtet werden, dass Mitochondrien mit einem sehr geringen Membranpotential mit dieser Technik nicht aufgelöst werden können. Daher werden ergänzende Studien zur Quantifizierung des mitochondrialen Proteingehalts empfohlen. Ein Vorteil der TMRE besteht darin, dass konfokale Bilder auch für die Analyse des mitochondrialen Membranpotentials verwendet werden können, jedoch müssen geeignete Kontrollen mit Entkopplungsmitteln wie Carbonylcyanid-p-Trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) durchgeführt werden. Darüber hinaus können die Anweisungen für die Analyse der mitochondrialen Dichte und Verteilung mit grün fluoreszierenden Indikatoren für Mitochondrien erreicht werden, die Mitochondrien unabhängig von ihrem Membranpotenzial belasten, aber die Inkubationsstrategie und die konfokalen Aufnahmeeinstellungen müssen standardisiert werden.
Angesichts der Tatsache, dass die Struktur der Mitochondrien mit wesentlichen mitochondrialen und zellulären Funktionen zusammenhängt, kann das hier beschriebene Protokoll wertvolle Informationen über ihren Umbau während einer Krankheit oder durch eine bestimmte Stressbelästigung liefern. Es könnte zu einem besseren Verständnis von Schlüsselfunktionen der Skelettmuskulatur beitragen, die von Mitochondrien gesteuert werden, wie z. B. die Energieproduktion, oder bei denen Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit anderen Organellen spielen, wie z. B. der Kontraktions-Stoffwechsel-Kopplung. Die Befolgung der Protokollanweisungen ermöglicht die Schätzung der mitochondrialen Dichte und Verteilung in der lebenden Skelettmuskulatur. Die Protokollschritte sind in drei Hauptphasen unterteilt, die sich auf die Dissektion von Skelettmuskelbündeln, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse konzentrieren, in denen detaillierte Anweisungen und wichtige Überlegungen enthalten sind. Insbesondere kann das Protokoll weiter optimiert werden, um zusätzliche Z-Schritte für die vollständige mitochondriale Rekonstruktion innerhalb der Faser entsprechend den Bedürfnissen des Benutzers zu erforschen. Zum Beispiel können die konfokalen Bild- und Analyseschritte getestet werden, um zelluläre Strukturen mit ähnlicher Verteilung zu untersuchen, wie z. B. TT in lebenden und fixierten Proben.

Mitochondrien bilden hochdynamische Netzwerke, die hauptsächlich durch das Gleichgewicht zwischen ihrer Dehnung (Fusion) und Fragmentierung (Spaltung)1,2 reguliert werden, die durch die Expression und Aktivität von Proteinen wie Mitofusin 1 und 2 (Mfn1 und Mfn2) und der optischen Proteinatrophie 1 (Opa1) moduliert werden, die die Verschmelzung der äußeren Mitochondrienmembran und der inneren Membran regulieren. bzw. 1,2. Das Dynamin-verwandte Protein (Drp1) reguliert hauptsächlich die mitochondriale Spaltung, wenn es im Ser6163 phosphoryliert wird.
In der Skelettmuskulatur ist bekannt, dass das mitochondriale Netzwerk aufgrund ihrer Nähe zu verschiedenen Zellregionen (Myofibrillen, Sarkolemma und Zellkerne) in strukturell gut definierten Subpopulationen angeordnet ist4,5. Die Mitochondrien, die sich direkt unter dem Sarkolemma befinden, werden als subsarkolemmale Mitochondrien (SSM) bezeichnet, diejenigen, die sich zwischen den kontraktilen Filamenten befinden, als intermyofibrilläre Mitochondrien (IMF) und die mitochondriale Subpopulation um die Kerne herum als perinukleäres Mitochondriennetzwerk (PMN). Darüber hinaus wurde vermutet, dass diese mitochondrialen Subpopulationen regionenspezifische Funktionen haben und metabolisch spezialisiert sind 4,5.
Die Aufrechterhaltung der zellulären Energiehomöostase, die eine metabolische und kontraktile Funktion ermöglicht, hängt in hohem Maße von der Interaktion und Kommunikation an bestimmten Stellen über das mitochondriale Netzwerk ab (z. B. IMF- und SSM-Interaktion)4,6. Zusätzlich zu den Netzwerkinteraktionen der Mitochondrien können die Mitochondrien auch mit anderen Organellen interagieren und strukturelle und funktionelle Komplexe bilden. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass IMF neben dem sarkoplasmatischen Retikulum (SR) und in der Nähe der Ca2+ Freisetzungseinheiten (CRU) lokalisiert werden kann, die von den transversalen Tubuli (TT) gebildet werden7. Diese Tatsache ist aufgrund der Rolle der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme bei der Regulierung der ATP-Synthese und Apoptose relevant. Kürzlich wurde auch eine mögliche Rolle bei der Regulierung zytosolischerCa2+-Transienten vorgeschlagen8.
TT sind Einstülpungen des Sarkolemmas mit einer periodischen Verteilung entlang der Längsachse von Kardiomyozyten und Skelettmuskelfasern 9,10, ähnlich der IMF-Verteilung 5. Veränderungen in der Verteilung von TT haben wichtige physiologische Implikationen, da sie eine Rolle bei der kontraktilen Funktion spielen. Diese Veränderungen wurden jedoch hauptsächlich in Kardiomyozyten untersucht. Die Verwendung der Fast-Fourier-Transformation (FFT) ermöglicht die Umwandlung periodischer Signale aus dem Entfernungsbereich in den Frequenzbereich, was zu einem FFT-Spektrum führt, das die Frequenz und die Regelmäßigkeit des Signalsangibt 11,12,13. Obwohl es Hinweise darauf gibt, dass die Organisation des mitochondrialen Netzwerks in Skelettmuskelfasern für die Anpassung an verschiedene Stoffwechselbedingungen, wie z.B. bei der Regeneration nach Muskelverletzungen, essentiell ist14,15, werden die meisten Analysen qualitativ durchgeführt.
Angesichts der Tatsache, dass die mitochondriale Dysfunktion mit mehreren skelettmuskelbezogenen (z. B. Nichtgebrauchsatrophie)2 und nicht-muskulären Erkrankungen, insbesondere Stoffwechselerkrankungen, und dem damit verbundenen Verlust von Muskelmasse (d. h. Atrophie)16 in Verbindung gebracht wurde, ist die quantitative Bewertung des mitochondrialen Netzwerks und der Verteilung in der Skelettmuskulatur von Bedeutung. In jüngster Zeit wurde ein signifikanter Unterschied in der longitudinalen Verteilung der Mitochondrien der Gastrocnemius-Muskelfasern zwischen einer adipösen Gruppe (Ob; Zucker fa/fa Ratten) und eine schlanke Gruppe (Lean; Zucker +/+ Ratten) wurde durch FFT17 identifiziert. Diese Studie zeigte die Nützlichkeit der FFT bei der Analyse der mitochondrialen Verteilung. Daher stellt dieses Protokoll eine Methodik zur Untersuchung von Mitochondrien in lebenden Skelettmuskelfasern anhand von Bildern dar, die durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden. Die mitochondriale Dichte wird durch Hintergrundschwellen quantifiziert, und die Analyse der longitudinalen mitochondrialen Verteilung mittels FFT-Analyse wird ebenfalls beschrieben. Ein Workflow-Schema ist in Abbildung 1 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Adenosin-5'-triphosphat-Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas aus Borosilikatglas</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop Software Leica Application Suite</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinphosphokinase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DekonvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr> <tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Asparaginsäure Kalium sat Hemihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&akut; N&akute;-Tetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x/ 0,7 IMM Objektiv&nbsp;</td><td>Leica</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-Apfelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure Mononatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td><td>UC Davis Gesundheit</td><td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>Open-Source-Plattform für die biologische Bildanalyse Fidschi</td><td>Öffentlich, gepflegt von der Eliceiri/LOCI-Gruppe, der Jug-Gruppe und dem Tomancak-Labor. Fidschi</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr> <tr><td>Phosphokreatin Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>PSF Generator (PSF_Generator.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aufnahmekammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Tabellenkalkulation Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin, Ethylester</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der mitochondrialen dichte und längsverteilung in lebenden skelettmuskelfasern von ratten mittels konfokaler mikroskopie

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

Das Mitochondrium ist ein Organell, das je nach den Stoffwechselanforderungen der Zellen verlängert, fragmentiert und erneuert werden kann. Der Umbau des mitochondrialen Netzwerks ermöglicht es gesunden Mitochondrien, den zellulären Bedarf zu decken. Der Verlust dieser Fähigkeit wurde jedoch mit der Entwicklung oder dem Fortschreiten verschiedener Pathologien in Verbindung gebracht. In der Skelettmuskulatur werden Veränderungen der mitochondrialen Dichte und -Verteilung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen wie Bewegung, Alterung und Fettleibigkeit beobachtet. Daher kann die Untersuchung des mitochondrialen Netzwerks zu einem besseren Verständnis der Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Erkrankungen beitragen.
Hier wird ein Protokoll für die Mitochondrien-Bildgebung von lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten beschrieben. Die Fasern werden manuell in einer entspannenden Lösung präpariert und mit einem fluoreszierenden Live-Cell-Imaging-Indikator für Mitochondrien (Tetramethylrhodaminethylester, TMRE) inkubiert. Das Mitochondriensignal wird durch konfokale Mikroskopie im XYZ-Scan-Modus aufgezeichnet, um konfokale Bilder des intermyofibrillären mitochondrialen Netzwerks (IMF) zu erhalten. Danach werden die konfokalen Bilder durch Schwellwertbildung und Binarisierung verarbeitet. Das binarisierte konfokale Bild berücksichtigt die positiven Pixel für die Mitochondrien, die dann gezählt werden, um die mitochondriale Dichte zu erhalten. Das mitochondriale Netzwerk im Skelettmuskel zeichnet sich durch eine hohe Dichte an IMF-Population aus, die eine periodische Längsverteilung ähnlich der von T-Tubuli (TT) aufweist. Die Fast-Fourier-Transformation (FFT) ist eine Standardanalysetechnik, die durchgeführt wird, um die Verteilung von TT zu bewerten, die es ermöglicht, die Verteilungshäufigkeit und das Niveau ihrer Organisation zu bestimmen. In diesem Protokoll wird die Implementierung des FFT-Algorithmus zur Analyse der longitudinalen mitochondrialen Verteilung in der Skelettmuskulatur beschrieben.

Nach dem vorliegenden Protokoll kann die Analyse der Dichte und Verteilung der Mitochondrien in der lebenden Skelettmuskulatur durchgeführt werden. Das Protokoll ist in drei Hauptphasen unterteilt: Skelettmuskelbündeldissektion, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse. Die Übersicht über den Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2A zeigt einen ganzen Ratten-Gastrocnemius-Muskel in einer Petrischale, der den seitlichen Kopf markiert, aus dem die Fasern gewonnen werden, während Abbildung 2B die Faserbündel in der Relax-Lösung zeigt. Mittels konfokaler Mikroskopie können die Mitochondrien mit dem fluoreszierenden Indikator TMRE entlang der Tiefe lebender Skelettmuskelfasern aufgezeichnet werden. TMRE ist ein lipophiler kationischer Fluorophor, der in den Mitochondrien gemäß dem mitochondrialen Membranpotential selektiv akkumuliertwird 20.
Ein optimales konfokales Bild von IMF kann durch die Wahl eines Z-Abstands von mehr als 15 μm Tiefe innerhalb der Faser erhalten werden (Abbildung 3A). Abbildung 3B zeigt repräsentative konfokale XY-Bilder von mit TMRE beladenen Mitochondrien, die entlang des Z-Abstands der Gastrocnemius-Muskelfasern (15 bis 21 μm) aufgenommen wurden. Die konfokalen Bilder wurden durch Thresholding verarbeitet, um sie in binäre Bilder umzuwandeln, um eine mitochondriale Analyse zu ermöglichen. Abbildung 3B (linkes Bild) zeigt eine Faser einer trainierten Lean-Ratte. Es stellt eine erwartete konfokale Aufzeichnung der Skelettmuskelfaser-Mitochondrien dar, da es ein konsistentes Muster entlang der Faser aufweist. Im Gegensatz dazu wählten wir eine Faser von einer Ob-Ratte aus (Abbildung 3B, rechtes Bild), die erhebliche Veränderungen im mitochondrialen Gehalt und in der Verteilung zeigt. Abbildung 3C zeigt die Quantifizierung der Faserfläche, die von den Mitochondrien eingenommen wird, ausgedrückt als mitochondriale Dichte, die aus jedem binarisierten Bild gewonnen wird (siehe Abbildung B). Wie erwartet, wies die Ob-Faser eine geringere mitochondriale Dichte auf. Sie wurde entlang der analysierten Z-Distanz konsistent quantifiziert, was auch in Abbildung 3D zu sehen ist, wenn die mitochondriale Dichte pro Stapel berechnet wird, der mit den drei konfokalen Bildern übereinstimmt, die bei 15, 18 und 21 μm aufgenommen wurden.
Ähnlich wie bei der mitochondrialen Dichteanalyse ermöglicht das konfokale Scannen eines Fluoreszenzindikators für die Bildgebung lebender Zellen, wie z. B. TMRE, die Untersuchung der longitudinalen Organisation von Mitochondrien in lebenden Skelettmuskeln. IMF zeigt eine periodische Organisation im I-Band nahe TT7, die mittels FFT analysiert werden kann, um die Frequenz des mitochondrialen Signals und den Organisationsgrad17 zu quantifizieren. Abbildung 4 zeigt die Unterschiede in der Organisation von IMF bei Gastrocnemius von Lean- und Ob-Ratten und wie FFT es ermöglicht, die Veränderungen in der Verteilung des mitochondrialen Signals zu finden. Abbildung 4A, B zeigen longitudinale ROIs, die in einer zentralen und lateralen Position in der Faser für die FFT-Analyse ausgewählt wurden. Vor der Durchführung der FFT wird der Schwellenwert für die Hintergrundsubtraktion berechnet. Anschließend wird das Bild binarisiert. Diese Verfahren eliminieren die Schwankungen der Fluoreszenzintensität des mitochondrialen Signals. Das binäre Bild liefert das Plotprofil der Fluoreszenzverteilung, das für die Durchführung der FFT erforderlich ist.
Abbildung 4C,D zeigt die ausgewählten ROIs in den Panels A und B mit ihren Plotprofilen (obere Panels). Aus den Plotprofilen lassen sich Unterschiede in der Fluoreszenzverteilung zwischen den Fasern von Lean- und Ob-Ratten sowie die Variationen zwischen ROIs innerhalb derselben Faser beobachten. Für jedes Plotprofil wird das jeweilige FFT-Spektrum dargestellt (untere Tafeln). Der Peak des maximalen FFT-Spektrums gibt die FFT-Frequenz (X-Achse) der mitochondrialen Signalverteilung entlang der Längsachse an. Er kann in einen Abstandswert von nahe 2 μm in den lateralen und zentralen ROIs der Lean-Ratte umgewandelt werden. Bemerkenswert ist, dass die FFT-Größe des Peaks ein Index für die Regelmäßigkeit des mitochondrialen Signals ist, und Änderungen in dieser Amplitude zeigen Veränderungen in der mitochondrialen Verteilung.
Abbildung 4E,F zeigt die Unterschiede im FFT-Spektrum zwischen Lean- und Ob-abgeleiteten Fasern, wobei laterale bzw. zentrale ROIs analysiert wurden. Bei lateralen ROIs (Abbildung 4E) war die Häufigkeit der mitochondrialen Längsverteilung in den mageren und Ob-abgeleiteten Fasern ähnlich; Nichtsdestotrotz war die Amplitude des maximalen FFT-Peaks in den Ob-abgeleiteten Fasern höher, was mit der höheren Regelmäßigkeit des im Bild in Abbildung 4B beobachteten Signals übereinstimmt. Nichtsdestotrotz wird der zentrale ROI (Abbildung 4F) des Ob als Beispiel für eine kritische Reduktion des FFT-Peaks im Vergleich zu Lean beobachtet, wenn eine signifikante Veränderung der mitochondrialen Verteilung vorliegt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schema für die mitochondriale Analyse im Skelettmuskel mittels konfokaler Mikroskopie. Dieses Schema fasst die Hauptschritte des Protokolls in drei separaten Phasen zusammen. Die erste Phase, die Dissektion der Gastrocnemius-Muskelfaserbündel, ist in drei aufeinanderfolgende Schritte unterteilt, die Isolierung des Gastrocnemius-Muskels, gefolgt von der mechanischen Dissektion der Muskeln in Bündel, um schließlich eine visuelle Auswahl der lebensfähigen Bündel zu treffen. Die zweite Phase besteht aus der Aufnahme von Lebendzellbildern durch konfokale Mikroskopie, die aus einer Inkubation mit dem Fluorophor (TMRE) für 20 Minuten bei Raumtemperatur besteht, um die Fasern in die Kammer zu bringen. Anschließend werden im Mikroskop die entsprechenden Einstellungen vorgenommen, um die Aufnahme der konfokalen Bilder durchzuführen. In der dritten Phase werden konfokale Bildverarbeitung und Datenanalyse durchgeführt. Beginnend mit der Bildverarbeitung, bei der ein Schwellenwert erforderlich ist, um binäre Bilder zu erzeugen, aus denen Mitochondriendichteberechnungen und Mitochondrienverteilung durch FFT durchgeführt werden. Abkürzungen: TMRE = Tetramethylrhodaminethylester; FFT = Schnelle Fourier-Transformation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> Abbildung 2: Dissektion des Skelettmuskelbündels. (A ) Präparierter lateraler Gastrocnemius-Kopf der Ratte (schwarzer Pfeil) in einer Petrischale mit Relax-Lösung. (B) Repräsentatives Bild der Gastrocnemius-Muskelfaserbündel in der Relax-Lösung vor der TMRE-Belastung. Abkürzung: TMRE = Tetramethylrhodaminethylester. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> Abbildung 3: Analyse der mitochondrialen Dichte. (A) Abbildung, die den Z-Abstand darstellt, der für das konfokale Scannen von IMF-Mitochondrien in Skelettmuskelfasern empfohlen wird. (B) Serie von konfokalen Bildern von mit TMRE beladenen Mitochondrien in Skelettmuskelfasern, aufgenommen von einer trainierten Zucker +/+ Ratte (Lean) und von einer adipösen Zucker fa/fa Ratte (Ob), aufgenommen in der Z-Distanz (von 15 bis 21 μm Tiefe). Die Bilder wurden mittels Schwellwertbildung verarbeitet und in binäre Bilder transformiert. (C) Berechnete Mitodichte der konfokalen Schichten, die bei verschiedenen Z-Abständen in Panel B erhalten wurden. (D) Die Mitodichte, die aus dem Stapel gewonnen wird, der aus den in Tafel B beobachteten Bildern besteht. Die Bilder in Panel B sind 65 x 50 μm groß. Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: Mito-Dichte = Mitochondriale Dichte; IMF = intermyofibrilläre Mitochondrien; Ob = fettleibig; SSM = subsarkolemmale Mitochondrien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> Abbildung 4: Analyse der mitochondrialen Verteilung mittels FFT. Repräsentative konfokale Bilder von Mitochondrien, die mit dem Fluoreszenzindikator TMRE beladen sind, aufgenommen in 21 μm Tiefe der Skelettmuskelfasern, aufgenommen von einer trainierten Zucker +/+ Ratte (Lean, Panel A) und von einer adipösen Zucker fa/fa Ratte (Ob, Panel B). Die Bilder wurden mittels Schwellwertbildung verarbeitet und in binäre Bilder transformiert. Laterale und zentrale ROIs aus Panel A (Panel C) und Panel B (Panel D) mit ihren jeweiligen Plotprofilen der Fluoreszenzintensität (oberes Diagramm) und des FFT-Spektrums (unteres Diagramm). FFT wurde aus ROIs mit 256 Pixeln Breite berechnet, was einer ROI-Größe von 39 x 5 μm in Panel A und einer ROI-Größe von 50 x 5 μm in Panel B entspricht. Panel E zeigt die Unterschiede des FFT-Spektrums zwischen Mitochondrien von Lean- und Ob-Ratten im lateralen ROI, während Panel F die Unterschiede des FFT-Spektrums des zentralen ROI zeigt. Maßstabsleiste = 10 μm. Abkürzungen: A.U. = Arbitrary Units; FFT = Schnelle Fourier-Transformation; ROIs = Regionen von Interesse; Ob = fettleibig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td>Endkonzentration in 100 ml</td>
			<td>Lager </td>
		</tr><tr><td>K-Aspartat</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-Glutaminsäure</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Äpfelsäure</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>1 mM frei Mg2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0,00002 mM freies Ca2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Phosphokreatin di-Na</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr><tr><td>Kreatin-Phosphokinase</td>
			<td>5 U/ml</td>
			<td>200 U/ml</td>
		</tr><tr><td>MgATP</td>
			<td>5 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7,3 (mit NaOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Entspannungslösungsreagenzien und Konzentration.
Ergänzende Abbildung S1: Auswirkung von Bildvorverarbeitungsverfahren. (A) Repräsentative konfokale Bilder von Mitochondrien, die mit dem Fluoreszenzindikator TMRE beladen sind, die in einer Tiefe von 18 μm in Skelettmuskelfasern aufgenommen wurden, die von einer trainierten Zucker +/+ Ratte (mager, oberes Bild) und von einer adipösen Zucker fa /fa-Ratte (unteres Bild) gewonnen wurden, zusammen mit ihren jeweiligen Bildern, die nach der Vorverarbeitung mit Otsu'schen Schwellwerten, Medianfiltern und Otsu'schen Schwellwerten aufgenommen wurden; und 2D-Dekonvolution und Otsu'sche Schwellenwerte. (B) Diagrammprofil der Mito-Dichte, das aus den konfokalen Bildern (Tafel A) nach der Vorverarbeitung mit verschiedenen Methoden erhalten wurde. Die Bilder in Panel A sind 65 x 50 μm groß. Maßstabsleiste = 10 μm. Abkürzungen: 2D-Decon = 2D-Dekonvolution; Mito-Dichte = Mitochondriale Dichte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Analyse von Veränderungen der mitochondrialen Dichte und der longitudinalen Verteilung mittels Live-Skelettmuskel-Bildgebung unter Verwendung konfokaler Mikroskopie für das mitochondriale Netzwerkscanning vor.

Analyse der mitochondrialen Dichte und Längsverteilung in lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten mittels konfokaler Mikroskopie

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

Der Umbau des mitochondrialen Netzwerks erfolgt unter physiologischem Stress und pathologischen Bedingungen. Die Auswirkungen des mitochondrialen Umbaus in einem Skelettmuskel sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von Veränderungen von Mitochondrien in lebender Skelettmuskulatur und verbessert unser Verständnis des Zusammenspiels zwischen mitochondrialen Veränderungen und zellulärer Funktion.Die Arbeit mit lebenden Skelettmuskeln stellt aufgrund der Faserkontraktion während der Isolierung und der Bildempfindlichkeit während des konfokalen Scannens eine Herausforderung dar. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolierungsprozess mit einer Entspannungslösung, der die Analyse lebensfähiger Muskelfasern für die mitochondriale Beurteilung mittels konfokaler Mikroskopie ermöglicht. Unser Protokoll adressiert den Mangel an Arbeitsabläufen zur quantitativen Analyse mitochondrialer Netzwerke in Skelettmuskelfasern.Die hier beschriebenen Schritte ermöglichen es Benutzern, die Vorteile von Bildern, die durch konfokale Mikroskopie gewonnen wurden, mithilfe von Bildverarbeitung durch Schwellwertbildung und schnelle Fourier-Analyse zu nutzen, um eine Quantifizierung der mitochondrialen Dichte und Verteilung zu erreichen. Wir interessieren uns für die Untersuchung von Veränderungen der Skelettmuskulatur, insbesondere der mitochondrialen Dynamik und des mitochondrialen strukturellen Umbaus während widriger Umstände und wie sie durch Interventionen wie Bewegung und Zwischenfasten moduliert werden können.

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Forschung

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Analyse der mitochondrialen Dichte und Längsverteilung in lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten mittels konfokaler Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Analyse der mitochondrialen Dichte und Längsverteilung in lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten mittels konfokaler Mikroskopie

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