Name: Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Erfahren Sie, wie optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen die Epithelspannung beeinflusst. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Gewebe-Morphogenese.

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Die Autoren danken Ann Lavanway für die Unterstützung bei der Bildgebung. Die Autoren danken dem Wieschaus-Labor und dem De Renzis-Labor für die gemeinsame Nutzung der Reagenzien und dem Bloomington Drosophila Stock Center für die Fliegenbestände. Diese Studie wird durch den NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 und den American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 an BH unterstützt.

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität bei Drosophila

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Dieses Protokoll beschrieb den kombinierten Einsatz von Optogenetik und Laserablation, um Veränderungen der Gewebespannung unmittelbar nach der Inaktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität zu untersuchen. Das hier beschriebene optogenetische Werkzeug nutzt die dominante negative Form von Rho1 (Rho1DN), um die endogene Rho1- und Rho1-abhängige Actomyosin-Kontraktilität akut zu hemmen. Die vorherige Charakterisierung von Opto-Rho1DN im Zusammenhang mit der ventralen Furchenbildung von Drosophila zeigte, dass das We...

Die Actomyosin-Kontraktilität, die kontraktile Kraft, die von Nicht-Muskel-Myosin II (im Folgenden "Myosin") auf das F-Aktin-Netzwerk ausgeübt wird, ist eine der wichtigsten Kräfte bei der Veränderung der Zellform und der Steuerung der Morphogenese auf Gewebeebene 1,2. Zum Beispiel führt die Aktivierung der Actomyosin-Kontraktilität an der apikalen Domäne der Epithelzellen zu einer apikalen Verengung, die eine Vielzahl morphogenetischer Prozesse erleichtert, darunter Epithelfaltung, Zellextrusion, Delamination und Wundheilung 3,4,5,6,7 . Die Aktivierung von Myosin erfordert die Phosphorylierung seiner regulatorischen Leichtkette. Diese Modifikation mildert die hemmende Konformation der Myosinmoleküle, so dass sie bipolare Myosinfilamentbündel mit mehreren Kopfdomänen an beiden Enden bilden können. Die bipolaren Myosinfilamente treiben die antiparallele Bewegung der Aktinfilamente an und führen zur Erzeugung der Kontraktionskraft 1,8,9.
Die evolutionär konservierte kleine GTPase RhoA (Rho1 in Drosophila) spielt eine zentrale Rolle bei der Aktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität in verschiedenen zellulären Kontexten10,11. Rho1 fungiert als bimolekularer Schalter, indem es entweder GTP (aktive Form) oder GDP (inaktive Form) bindet12. Der Kreislauf zwischen GTP- oder GDP-gebundenem Rho1 wird durch seine GTPase-aktivierenden Proteine (GAPs) und Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) reguliert13. GEFs erleichtern den Austausch von BIP gegen GTP und aktivieren so die Rho1-Aktivität. GAPs hingegen verstärken die GTPase-Aktivität von Rho1 und deaktivieren so Rho1. Aktiviertes Rho1 fördert die Kontraktilität von Aktomyosin, indem es mit seinen nachgeschalteten Effektoren, der Rho-assoziierten Kinase (Rok) und Diaphanous14, interagiert und diese aktiviert. Rok induziert die Myosinaktivierung und die Aktomyosinkontraktilität durch Phosphorylierung der regulatorischen leichten Kette von Myosin15. Darüber hinaus hemmt Rok auch die Myosin-regulatorische Leichtkettenphosphatase und fördert somit die Myosin-Filament-Assemblierung16 weiter. Rok kann auch LIM-Kinasen phosphorylieren, die, wenn sie aktiviert werden, den Aktinabbau verhindern, indem sie den Aktin-Depolymerisationsfaktor Cofilin17,18 phosphorylieren und hemmen. Diaphanous ist ein Aktinnukleator der Forminfamilie, der die Aktinpolymerisation fördert und eine Basis für die Interaktion von Myosin mit 19,20,21 bietet.
Während die zellulären Mechanismen, die die Kontraktilität von Actomyosin aktivieren, gut aufgeklärt sind, ist unser Verständnis seiner Funktion bei der Regulierung des dynamischen Gewebeumbaus noch unvollständig. Um diese Wissenslücke zu schließen, sind Ansätze erforderlich, die Actomyosin an bestimmten Geweberegionen in vivo schnell inaktivieren und die unmittelbaren Auswirkungen auf das Verhalten und die Eigenschaften des Gewebes aufzeichnen können. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur akuten Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität während der Einstülpung des Drosophila-Mesoderms, gefolgt von der Messung der Epithelspannung mittels Laserablation. Während der Gastrulation von Drosophila erleiden die ventral lokalisierten Mesoderm-Vorläuferzellen eine apikale Verengung und invaginatieren von der Oberfläche des Embryos, indem sie eine anterior-posterior orientierte Furche bilden22,23. Die Bildung ventraler Furchen dient seit langem als Modell für die Untersuchung des Mechanismus der Epithelfaltung. Die Bildung der ventralen Furchen wird durch das dorsal-ventrale Mustersystem in Drosophila 24,25,26,27 gesteuert. Die Expression von zwei Transkriptionsfaktoren, Twist und Snail, die sich auf der ventralen Seite des Embryos befinden, steuert die ventrale Furchenbildung und spezifiziert das Schicksal der mesodermalen Zellen28. Twist und Snail aktivieren die Rekrutierung des Rho1 GEF RhoGEF2 an die Spitze der Mesoderm-Vorläuferzellen über einen G-Protein-gekoppelten Rezeptorweg und ein RhoGEF2-Adapterprotein, T48 29,30,31,32,33. Als nächstes aktiviert RhoGEF2 Myosin auf der gesamten apikalen Oberfläche des potenziellen Mesoderms über den Rho-Rho-Kinase-Signalweg 34,35,36,37,38,39. Aktiviertes Myosin bildet ein suprazelluläres Actomyosin-Netzwerk auf der gesamten apikalen Oberfläche des Mesoderm-Primordiums, dessen Kontraktionen die apikale Verengung vorantreiben und zu einem schnellen Anstieg der apikalen Gewebespannung führen 14,37,40.
Das in diesem Protokoll beschriebene optogenetische Werkzeug, Opto-Rho1DN, hemmt die Kontraktilität von Actomyosin durch Blaulicht-abhängige Plasmamembranrekrutierung einer dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN)41. Eine T19N-Mutation in Rho1DN eliminiert die Fähigkeit des mutierten Proteins, GDP gegen GTP auszutauschen, und macht das Protein somit dauerhaft inaktiv34. Eine nachfolgende Mutation in Rho1DN, C189Y, eliminiert dessen naives Membran-Targeting-Signal42,43. Wenn Rho1DN in die Plasmamembran infundiert wird, bindet es an Rho1-GEFs und staut sie, wodurch die Aktivierung von Rho1 sowie die Rho1-vermittelte Aktivierung von Myosin und Aktin blockiertwerden 34,44. Die Rekrutierung von Rho1DN in der Plasmamembran erfolgt durch ein lichtabhängiges Dimerisierungsmodul, das von Cryptochrom 2 und seinem Bindungspartner CIB1 abgeleitet ist. Cryptochrom 2 ist ein durch blaues Licht aktivierter Cryptochrom-Photorezeptor in Arabidopsis thaliana45. Cryptochrom 2 bindet nur im photoangeregten Zustand an CIB1, ein basisches Helix-Schleifen-Helix-Protein45. Später wurde festgestellt, dass die konservierte N-terminale Photolyase-Homologie-Region (PHR) von Cryptochrom 2 (CRY2PHR, im Folgenden als CRY2 bezeichnet) und die N-terminale Domäne (aa 1-170) von CIB1 (im Folgenden CIBN) für die lichtinduzierte Dimerisierung wichtig sind46. Opto-Rho1DN besteht aus zwei Komponenten. Die erste Komponente ist das CIBN-Protein, das mit einem CAAX-Anker fusioniert ist, der das Protein an der Plasmamembran47 lokalisiert. Die zweite Komponente ist mCherry-markiertes CRY2, das mit Rho1DN41 fusioniert ist. In Abwesenheit von blauem Licht verbleibt CRY2-Rho1DN im Zytoplasma. Nach Stimulation durch blaues Licht wird CRY2-Rho1DN durch die Wechselwirkung zwischen membranverankertem CIBN und angeregtem CRY2 auf die Plasmamembran gerichtet. Opto-Rho1DN kann durch ultraviolettes A-Licht (UVA) und blaues Licht (400-500 nm, maximale Aktivierung bei 450-488 nm) oder durch einen gepulsten Laser mit 830-980 nm aktiviert werden, wenn eine Zwei-Photonen-Stimulation durchgeführtwird 41,46,47,48. Daher wird Opto-Rho1DN durch Wellenlängen stimuliert, die normalerweise für die Anregung von GFP verwendet werden (488 nm für die Einzelphotonen-Bildgebung und 920 nm für die Zwei-Photonen-Bildgebung). Im Gegensatz dazu stimulieren Wellenlängen, die üblicherweise für die Anregung von mCherry verwendet werden (561 nm für die Einzelphotonen-Bildgebung und 1.040 nm für die Zwei-Photonen-Bildgebung), das optogenetische Modul nicht und können daher für die Bildgebung vor der Stimulation verwendet werden. Das Protokoll beschreibt die Ansätze, die verwendet werden, um das Risiko einer unerwünschten Stimulation während der Probenmanipulation zu minimieren.
Die Laserablation wurde in großem Umfang eingesetzt, um Spannungen in Zellen und Geweben zu erkennen und zu messen49. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Zwei-Photonen-Laserablation unter Verwendung eines Femtosekunden-Nahinfrarotlasers bei entsprechender Kontrolle der Laserintensität einige subzelluläre Strukturen (z. B. kortikale Actomyosin-Netzwerke) physikalisch beeinträchtigen kann, ohne eine Plasmamembran-Raptur zu verursachen50,51. Wenn das Gewebe unter Spannung steht, führt die Laserablation einer interessierenden Region innerhalb des Gewebes zu einem sofortigen Rückstoß der an die abgetragene Region angrenzenden Zellen nach außen. Die Rückstoßgeschwindigkeit ist eine Funktion der Größe der Spannung und der Viskosität des Mediums (Zytoplasma), das die Strukturen umgibt, die dem Rückstoß ausgesetzt sind49. Aufgrund der überlegenen Eindringtiefe der Nahinfrarotlaser und der Möglichkeit, eine gut begrenzte fokale Ablation zu erreichen, ist die Zwei-Photonen-Laserablation besonders nützlich für die Erkennung von Gewebespannungen in vivo. Wie in diesem Protokoll gezeigt, kann diese Methode leicht mit der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung der Actomyosin-Kontraktilität kombiniert werden, um den direkten Einfluss der Rho1-abhängigen zellulären Kontraktilität auf die Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>35 mm Glasbodenschale</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Wird für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet 60 mm & mal 15 mm Petrischale mit Deckel</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>Wird für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet Schwarzes Tuch zum Abdecken des Mikroskops</td><td>Online</td><td>NA</td><td>Wird verwendet, um unerwünschte Lichtstimulation zu vermeiden</td></tr><tr><td>Clorox Ultra Germicadal Bleach (8,25% Natriumhypochlorit)</td><td>VWR</td><td>10028-048</td><td>Wird für die Dechorination von Embryonen</td></tr><tr><td>verwendet CO2</td><td>Pad Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>Wird für das Cross-Setup</td></tr><tr><td>verwendet ddH2O</td><td>NA</td><td>NA Wird</td><td>für die Probenvorbereitung verwendet</td></tr><tr><td>Dumont Style 5 Pinzette</td><td>VWR</td><td>102091-654</td><td>Wird für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet Wimpernwerkzeug (hergestellt aus reiner roter Zobel-Rundbürste #2)</td><td>VWR</td><td>22940-834</td><td>Wird für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet FluoView (Software)</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>Wird für die Bildaufnahme und optogenetische Stimulation</td></tr> verwendet <tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl 27</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td>Wird für die Visualisierung des Embryostadiums</td></tr><tr><td>verwendet ImageJ/FIJI</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Wird für die Bildanalyse verwendet</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>Wird für die Bildanalyse verwendet</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-745 Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Wird für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet Olympus FVMPE-RS Multiphotonenmikroskop mit InSight DS Dual-Line Ultrakurzpulslasern für simultane Dual-Wellenlängen-Multiphotonen-Bildgebung, einem 25x/NA1.05 Wasserimmersionsobjektiv (XLPLN25XWMP2) und einer IR/VIS-Stimulationseinheit für die Photoaktivierung/-stimulation. Dieses System ist zusätzlich mit einem TRITC-Filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M) und eine Fluoreszenzbeleuchtungseinheit, die weißes Licht emittiert.</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>Zur Bildaufnahme und optogenetischen Stimulation</td></tr><tr><td>SP Bel-Art Gefrierschrank aus Polypropylen mit 100 Plätzen (Schwarze, lichtdichte Box für den Probentransfer)</td><td>VWR</td><td>30621-392</td><td>Zur Vermeidung unerwünschter Lichtstimulation</td></tr><tr><td>UV-Filterabschirmung für FM1403 Fluore (orange-rote Kunststoffabschirmung)</td><td>Bolioptics</td><td>FM14036151</td><td>Zur Vermeidung unerwünschter Lichtstimulation</td></tr><tr><td>VITCHELO V800 Stirnlampe mit weißer und roter LED-Beleuchtung</td><td>Amazon</td><td>NA</td><td>Wird verwendet, um unerwünschte Lichtstimulation zu vermeiden</td></tr></tbody></table>

optogenetische hemmung der rho1-vermittelten actomyosin-kontraktilität gekoppelt mit messung der epithelspannung in drosophila-embryonen

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Kontraktile Kräfte, die durch Aktin und Nicht-Muskelmyosin II erzeugt werden ("Actomyosin-Kontraktilität"), sind entscheidend für morphologische Veränderungen von Zellen und Geweben auf mehreren Längenskalen, wie z. B. Zellteilung, Zellmigration, Epithelfaltung und verzweigte Morphogenese. Ein tiefgreifendes Verständnis der Rolle der Aktomyosin-Kontraktilität in der Morphogenese erfordert Ansätze, die eine schnelle Inaktivierung von Actomyosin ermöglichen, die mit herkömmlichen genetischen oder pharmakologischen Ansätzen nur schwer zu erreichen ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Verwendung eines CRY2-CIBN-basierten optogenetischen Dimerisierungssystems, Opto-Rho1DN, zur Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit präzisen zeitlichen und räumlichen Kontrollen. In diesem System ist CRY2 mit der dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN) fusioniert, während CIBN an der Plasmamembran verankert ist. Die Blaulicht-vermittelte Dimerisierung von CRY2 und CIBN führt zu einer schnellen Translokation von Rho1DN aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran, wo es Actomyosin durch Hemmung von endogenem Rho1 inaktiviert. Darüber hinaus wird in diesem Artikel ein detailliertes Protokoll für die Kopplung der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung von Aktomyosin mit der Laserablation vorgestellt, um die Rolle von Actomyosin bei der Erzeugung von Epithelspannung während der ventralen Furchenbildung von Drosophila zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auf viele andere morphologische Prozesse angewendet werden, die die Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit minimalen Modifikationen beinhalten. Insgesamt ist dieses optogenetische Werkzeug ein leistungsfähiger Ansatz, um die Funktion der Actomyosin-Kontraktilität bei der Kontrolle der Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

In den nicht stimulierten Embryonen, die einer apikalen Konstriktion unterzogen wurden, wurde Sqh-mCherry in der medioapikalen Region der ventralen mesodermalen Zellen angereichert, während CRY2-Rho1DN-mCherry zytosolisch war (Abbildung 1A). Die Laserablation innerhalb der Verengungsdomäne führte zu einem raschen Geweberückstoß entlang der A-P-Achse (Abbildung 1B,C). In den stimulierten Embryonen wurde das CRY2-Rho1DN-mCherry-Signal in der Plasm...

Die Kontraktilität von Actomyosin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell- und Gewebemorphogenese. Es ist jedoch schwierig, die Actomyosin-Kontraktilität in vivo akut zu manipulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein optogenetisches System, das die Rho1-vermittelte Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen schnell hemmt und den sofortigen Verlust der Epithelspannung nach der Inaktivierung von Actomyosin in vivo aufdeckt.

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Unsere Forschung befasst sich mit der Gewebemorphogenese, der Bildung komplexer dreidimensionaler Gewebestrukturen in der Entwicklung. Wir interessieren uns für die Gene und die Moleküle, die die Morphogenese regulieren, und versuchen, die physikalischen Prinzipien zu verstehen, die der Morphogenese zugrunde liegen. Zum Beispiel, wie mechanische Kräfte entstehen und wie sie die Geweberehabilitation vorantreiben.Kontraktile Kräfte, die durch filamentöses Aktin und Nicht-Muskel-Myosin II erzeugt werden, auch bekannt als Actomyosin-Kontraktilität, sind eine der wichtigsten Kräfte, die die Gewebemorphogenese vorantreiben. Unsere aktuelle Forschung befasst sich mit der Frage, wie die Kontraktilität von Actomyosin die Faltung von Blutepithelzellblättern vermittelt, ein grundlegender Mechanismus des Gewebeaufbaus in der Entwicklung. Ein tiefgreifendes Verständnis der Rolle der Aktomyosin-Kontraktilität bei der Epithelfaltung und anderen morphogenetischen Prozessen erfordert Ansätze, die Actomyosin zu einem bestimmten Zeitpunkt und an einem bestimmten Ort schnell inaktivieren können und die unmittelbaren Auswirkungen des Gewebeverhaltens und der Gewebeeigenschaften aufzeichnen.Dies ist jedoch mit herkömmlichen genetischen Ansätzen nur schwer zu erreichen. Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz wurde entwickelt, um zu untersuchen, wie Zellen und Gewebe auf plötzliche Änderungen der mechanischen Kräfte reagieren, die normalerweise den Gewebeumbau vorantreiben. Dies ist eine wichtige Frage, die jedoch aufgrund begrenzter Ansätze, die mechanische Kräfte in intaktem Gewebe schnell verändern können, nur schwer zu beantworten ist.In dieser Studie haben wir ein optogenetisches Werkzeug entwickelt, um Actomyosin an bestimmten Geweberegionen in Drosophila-Embryonen schnell zu inaktivieren. Wir fanden heraus, dass die Kombination dieser beiden mit der Laserablation den direkten Einfluss der Actomyosin-Kontraktilität auf die Gewebemechanik in der Epithelfaltung untersucht. Unsere Ergebnisse liefern neue Einblicke in den mechanischen Mechanismus der apikalen Verengung von Medien zur Epithelfaltung.Mit manuellen Modifikationen kann das Protokoll leicht angepasst werden, um die Funktion der Aktomyosin-Kontraktilität in einer Vielzahl von morphogenetischen Prozessen zu untersuchen.

optogenetic-inhibition-rho1-mediated-actomyosin-contractility-coupled

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für optogenetische Manipulation motoneuralen Aktivität, während die Überwachung der Motorleistung (Muskelkontraktion) in...

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

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Dieses Protokoll bietet eine Fidschi-basierte, benutzerfreundliche Methodik zusammen mit einfachen Anweisungen, die erklären, wie das Verhalten von Actomyosin in einzelnen Zellen und gekrümmten Epithelgeweben zuverlässig analysiert werden kann. Es sind keine Programmierkenntnisse erforderlich, um dem Tutorial zu folgen; Alle Schritte werden halbinteraktiv über die grafische Benutzeroberfläche von Fidschi und die zugehörigen Plugins durchgeführt.

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Erfahren Sie, wie optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen die Epithelspannung beeinflusst. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen zur Gewebe-Morphogenese.

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen (Video) | JoVE Journal

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