Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung
12. Mai 2023
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.
Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, das Zusammenspiel von genetischen und umweltbedingten Faktoren im Zusammenhang mit der Herzentwicklung und deren Beitrag zu angeborenen Herzfehlern zu untersuchen. Einzelkern-Ansätze wie Einzelkern-RNA-seq und Einzelkern-Ataxie entwickeln sich zu Schlüsselmethoden zur Untersuchung der zellulären Heterogenität in Gesundheit und Krankheit während der Herzentwicklung. Ein limitierender Schritt dieser Experimente ist, dass alle Proben gleichzeitig durchlaufen werden müssen.
Bei der Arbeit mit allen Versuchsbedingungen kann es eine Herausforderung sein, frisches Material zu sammeln, das für alle Bedingungen gleichzeitig geeignet ist. Obwohl es in den letzten Jahren erhebliche Fortschritte auf dem Gebiet der Einzelzelle gegeben hat, besteht die Hauptschwierigkeit in der Verarbeitung freier Proben. Die Vermeidung dieser Schwierigkeit ist äußerst vorteilhaft, um den molekularen Mechanismus zu identifizieren, der angeborenen Herzfehlern zugrunde liegt.
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die zu befolgen sind, um erfolgreich hochwertige Zellkerne aus gefrorenen Herzzellsuspensionen zu isolieren, die aus Mausembryonen gewonnen wurden. Und unser Protokoll ist kompatibel mit nachgeschalteten Einzelkernen, RNA-seq und Einzelkernen, die ataktisch sind. Wir hoffen, dass dieses Verfahren interessierten Forscherinnen und Forschern hilft und sie ermutigt, diese leistungsfähige Methode für ihre Forschung zu nutzen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von Zellkernen aus Herzgewebe zur Untersuchung der Herzentwicklung und angeborener Herzfehler. Es unterstreicht die Bedeutung von Einzelzellkern-Ansätzen für das Verständnis der zellulären Heterogenität in Gesundheit und Krankheit.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiobiologie
- Zelluläre Heterogenität
- Angeborene Herzfehler
Hintergrund
- Die Einzelzellkern-RNA-Sequenzierung ist eine zentrale Methode zur Untersuchung der Herzentwicklung.
- Das Verständnis genetischer und umweltbedingter Wechselwirkungen ist entscheidend, um angeborene Herzfehler zu erforschen.
- Die Aufarbeitung frischer Proben stellt weiterhin eine erhebliche Herausforderung in diesen Studien dar.
- Die Identifizierung der molekularen Mechanismen, die angeborenen Herzerkrankungen zugrunde liegen, ist entscheidend für die Weiterentwicklung von Therapien.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wechselwirkung genetischer und umweltbedingter Faktoren bei der Herzentwicklung.
- Beitrag zum Verständnis angeborener Herzfehler.
- Anwendung von Einzelkern-Ansätzen zur Untersuchung zellulärer Heterogenität.
Verwendete Methoden
- Mikrodissektion von Herzmuskelgewebe.
- Enzymatische Dissoziation zur Gewinnung einzelner Zellen.
- Einfrieren und Isolierung lebensfähiger Vorläuferzellen.
- Einzelzellkern-RNA-Sequenzierung und Chromatinzugänglichkeitsanalysen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung reiner, lebensfähiger Zellkerne.
- Erkenntnisse zur zellulären Heterogenität während der Herzentwicklung.
- Identifizierung molekularer Mechanismen, die mit angeborenen Herzfehlern assoziiert sind.
- Nachweis der Durchführbarkeit von Einzelzellkern-Ansätzen in der kardialen Forschung.
Schlussfolgerungen
- Methoden zur Analyse einzelner Zellkerne eignen sich gut zur Untersuchung der Herzentwicklung.
- Das Verständnis der zellulären Heterogenität ist entscheidend, um angeborene Herzfehler besser bewältigen zu können.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um diese Methoden zu verfeinern und die Probenaufbereitung zu verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung einzelner Zellkerne aus gefrorenen murinen Herzmuskelvorläuferzellen ermöglicht eine hochauflösende epigenomische und transkriptomische Profilierung und überwindet dabei die Einschränkungen, die mit der Verwendung frischen Gewebes verbunden sind. Diese Fähigkeit unterstützt eine robuste Untersuchung der zellulären Heterogenität und der regulatorischen Mechanismen bei der Herzentwicklung und hat damit direkte Auswirkungen auf die frühe Entdeckung und Validierung von Zielstrukturen bei angeborenen Herzfehlern. Die flexible Probenaufbereitung und die Kompatibilität mit Dual-Omics-Plattformen verbessern das experimentelle Design und die Datenintegration über das gesamte Forschungsportfolio hinweg.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Genregulationsnetzwerken in Populationen kardialer Vorläuferzellen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung, indem der Chromatinzustand mit der Genexpression auf Einzelzellauflösung verknüpft wird.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung von Kandidatenwegen, die bei angeborenen Herzfehlern eine Rolle spielen.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit in frühen Modellen kardialer Erkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert hochwertige Zellkernpräparationen, die für standardisierte snRNA-seq- und snATAC-seq-Arbeitsabläufe geeignet sind.
- Reduziert die technische Variabilität, indem die Batch-Verarbeitung von gefrorenen Proben über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg ermöglicht wird.
- Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Ausgaben für nachgeschaltete Wirkstoff- oder genetische Störungsscreens.
- Ermöglicht eine skalierbare Integration mit mikrofluidischen und hochdurchsatzfähigen Sequenzierplattformen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt die molekulare Profilierung mit krankheitsrelevanten kardialen Vorläufersystemen.
- Gewährleistet translatorische Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Probendurchgängigkeit erhalten bleibt.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf Grundlage robuster Einzelzell-Daten.
- Unterstützt die Identifizierung translationaler Biomarker für die Forschung zu angeborenen Herzfehlern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur Isolierung von Zellkernen verortet sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckungsforschung und präklinischer Forschung und ermöglicht die duale Omics-Profilierung aus gefrorenen Herzproben sowie die iterative Überprüfung von Hypothesen entlang des gesamten Entdeckungsspektrums.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die hypothesengetriebene Analyse der Genexpression und Chromatinzugänglichkeit in kardialen Vorläuferzellen.
- Screening: Stellt reproduzierbare Zellkern-Inputmengen für Hochdurchsatz-Sequenzierassays bereit.
- Analysen: Bietet quantitative Einzelzellkern-Daten für den vergleichenden Bedingungsvergleich.
- Translationale Forschung: Erhält krankheitsrelevante zelluläre Zustände zur Identifizierung von Biomarkern und Untersuchung von Wirkmechanismen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen standardisierten, wiederverwendbaren Workflow für kardiale Einzelzellkern-Studien über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung kardialer Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Isolierung von Zellkernen aus gefrorenen Proben.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management.
- Portfolio-Implikation: Verbessert die risikoadjustierte Priorisierung und die Integration von Daten über mehrere Studien hinweg für kardiale Forschungsprogramme.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Gewebedissektion, Zellbehandlung und Methoden zur Isolierung von Zellkernen.
- Benötigt Zugang zu mikrofluidischen Plattformen und Infrastruktur für Hochdurchsatzsequenzierung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probenvorbereitung und der Beurteilung der Zellviabilität.
- Anpassbar an verschiedene Entwicklungsstadien des Herzens sowie an unterschiedliche experimentelle Modelle.
- Abhängig von einer strengen Qualitätskontrolle der Integrität und Vitalität der Kerne vor der Sequenzierung.
