Name: Normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-25T14:25:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Erfahren Sie die normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen zur Untersuchung molekularer Mechanismen und neuer Perfusatzusätze. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse in der Organforschung.

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Während des Schreibens dieses Artikels habe ich viel Unterstützung und Hilfe erhalten. Besonders bedanken möchte ich mich bei meinem Teamkollegen XinPei Chen für die wunderbare Zusammenarbeit und die geduldige Unterstützung während meiner Operation.

Die Tierversuche wurden nach den aktuellen deutschen Vorschriften und Richtlinien für den Tierschutz und den ARRIVE-Richtlinien für die Berichterstattung über Tierversuche durchgeführt. Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Deutschland genehmigt (Zulassungsnummer: UKJ - 17 - 106).
HINWEIS: Als Leberspender wurden männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 34 ± 4 g (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts [REM]) verwendet. Sie wurden unter kontrollierten Umgebungsbedingungen (50 % Luftfeuchtigkeit und 18 - 23 °C) mit freiem Zugang zu Standard-Mäusefutter und Wasser gehalten. Während des gesamten chirurgischen Eingriffs wurde eine Atemfrequenz von mehr als 60 Atemzügen/min aufrechterhalten und die Körpertemperatur über 34 °C gehalten.
1. Vorbereitung
<ol><li>Einrichten des Operationstisches
	<ol><li>Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien zu Sterilisationszwecken.</li>
		<li>Schalten Sie alle Geräte ein, einschließlich des Wärmebretts und der Elektrokoagulation.</li>
		<li>Eine 50-ml-Spritze mit 25 ml heparinisierter Kochsalzlösung (2.500 U/L) in einen warmen Inkubator (37 °C) geben.</li>
		<li>Legen Sie die chirurgischen Instrumente, das 6 - 0 Seidennahtmaterial, den sterilen kleinen Baumwollapplikator, die Veterinärkochsalzlösung (500 ml) und die Vliesmullschwämme (10 cm x 10 cm) entsprechend auf den Operationstisch.</li>
		<li>Legen Sie eine 26-g-Nadel auf den Operationstisch, um ein kleines Loch in den Deckel des 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens zu bohren, um das Gallenröhrchen zur Gallenentnahme aufzunehmen.</li>
		<li>Legen Sie die Kanüle (1 Fr Polyurethankanüle oder UT - 03 Polyethylenkanüle) und ein sterilisiertes 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zur Gallenentnahme auf den Operationstisch.</li>
	</ol></li>
	<li>Selbstgebaute Pfortaderkanüle
	<ol><li>Halten Sie die 2-Fr-Kanüle mit einer Pinzette fest und stechen Sie die Wand mit einer 30-G-Nadel in einem Abstand von 1 cm vom Ende der Kanüle ein. Schieben Sie die Nadel durch die Kanüle, bis die Nadelspitze sichtbar wird.</li>
		<li>Schneiden Sie die Spitze der Kanüle ab, sodass ein scharfes Dreieck entsteht.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von heparinisierter Kochsalzlösung
	<ol><li>Bereiten Sie 25 ml heparinisierte Kochsalzlösung mit einer Endkonzentration von 2.500 IU/ml vor.</li>
		<li>Entfernen Sie alle Luftblasen und legen Sie die Spritze in den 40 °C-Inkubator.</li>
	</ol></li>
	<li>Demonstration des Perfusionssystems
	<ol><li>In Abbildung 1 sind die Hauptkomponenten des maschinellen Perfusionssystems aufgeführt.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbau des Orgelraums
	<ol><li>Siehe Abbildung 2 für den Grundriss des Orgelraums.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbau des Perfusionssystems
	<ol><li>Schalten Sie das Lab-Chart-Programm für die Drucküberwachung ein.</li>
		<li>Verbinden Sie den Druckkalibrator und den Drucksensor auf der Ebene des Orgelraums.</li>
		<li>Stellen Sie den Druckkalibrator so ein, dass er 0 mmHg anzeigt, und überprüfen Sie den entsprechenden Wert in der Druckregelungssoftware.</li>
		<li>Stellen Sie den Druckkalibrator auf 20 mmHg ein und überprüfen Sie den entsprechenden Wert erneut in der Druckregelungssoftware.</li>
		<li>Schalten Sie das Wasserbad ein und wärmen Sie den Orgelraum auf 40 °C vor.</li>
		<li>Spülen Sie das gesamte Sanitärsystem zweimal 30 Minuten lang mit destilliertem deionisiertem Wasser, um sicherzustellen, dass die Desinfektionslösung vollständig entfernt wird.</li>
		<li>Initiieren Sie die Zirkulation der Desinfektionslösung im gesamten System für eine Dauer von 20 Minuten, um eine gründliche Desinfektion zu gewährleisten.</li>
		<li>Schalten Sie das Gasgemisch (95 % Sauerstoff (O2) und 5 % Kohlendioxid (CO2) ein.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusat-Füllung
	<ol><li>Ergänzen Sie 250 ml E-Medium von Williams mit 50 ml fötalem Kälberserum, 3 ml Penicillin/Streptomycin (1 mg/ml), 0,17 ml Insulin (100 IE/ml), 0,34 ml Heparin (5000 U/ml) und 0,07 ml Hydrocortison (100 mg/2 ml), um das vollständige E-Medium von Williams herzustellen.</li>
		<li>Geben Sie gleiche Volumina (150 ml) Perfusat in das Reservoir und die Orgelkammer, um das System vorzubereiten. HINWEIS: Besonderes Augenmerk muss auf die Aufrechterhaltung der Sterilität während des Füllvorgangs gelegt werden. Das Perfusat wird ständig durch diese beiden Schlüsselkomponenten der Perfusion der geschlossenen Umlaufmaschine gepumpt.</li>
		<li>Schalten Sie die Peristaltikpumpe bei mittlerer Geschwindigkeit (15 ml/min) ein, um das Perfusionssystem mit dem sauerstoffhaltigen Medium zu füllen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Explantation der Leber
<ol><li>Vorbereitung vor der Operation
	<ol><li>Wiegen Sie das Tier. Bereiten Sie das Analgetikum Buprenorphin (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg Körpergewicht) vor.</li>
		<li>Verbinden Sie die Induktionskammer mit der Steckdose. Drehen Sie den Sauerstoff auf 0,5 l/min. Verwandeln Sie Isofluran auf 3%.</li>
		<li>Legen Sie das Tier in die Kammer, bis eine tiefe Betäubung (Aufrichtungsreflex positiv) erreicht ist.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mikrospritze, um die an das Körpergewicht angepasste Dosis der Analgesie subkutan aufzutragen.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Elektrorasierer, um das Fell auf der Bauchhaut zu trimmen.</li>
		<li>Legen Sie die Maus auf den Operationstisch und schalten Sie den Isofluran-Verdampfer auf 2,5 % ein, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie den Zehenreflex zwischen den Zehen testen.</li>
	</ol></li>
	<li>Präparation des Mausabdomens
	<ol><li>Bringen Sie die Maus in Rückenlage.</li>
		<li>Testen Sie den Interdigitalreflex, um die entsprechende Narkosetiefe zu bestätigen. Fixiere alle vier Gliedmaßen mit Klebeband.</li>
		<li>Desinfizieren Sie beide Seiten des Bauches bis zur mittleren Achsellinie mit drei aufeinanderfolgenden Runden Jodalkohol. Verwenden Sie sterilisierte Vliesgaze, um den Bereich um das Operationsfeld herum abzudecken.</li>
		<li>Einen 3 cm langen Querschnitt 1 cm unterhalb des Xiphoid im Bauchbereich der Maus mit Metzenbaum Babyschere und OP-Zange machen.</li>
		<li>Verlängern Sie den Hautschnitt beidseitig beidseitig bis zur Mittelachsellinie.</li>
		<li>Machen Sie vorsichtig einen 2 cm langen Längsschnitt entlang der Linea alba mit einer Federschere.</li>
		<li>Durchtrennen Sie die Bauchmuskelschicht mit Elektrokoagulation und Vannas Federschere.</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig ein Stück nasse Gaze auf, um die Leber vor Elektrokoagulation zu schützen.</li>
		<li>Verwenden Sie eine 6 - 0 Seidennaht mit der Rundnadel, um den Xiphoideusfortsatz zurückzuziehen, um das Koronarband besser freizulegen.</li>
		<li>Verwenden Sie zwei Rippenhalter, um die Bauchhöhle der Maus vollständig freizulegen.</li>
		<li>Bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig mit einem feuchten Wattestäbchen aus der Bauchhöhle, um den Hilus vollständig freizulegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Präparation der gemeinsamen Gallengänge
	<ol><li>Durchtrennen Sie die falziformen, phrenen und gastrohepatischen Bänder mit einer scharfen Schere.</li>
		<li>Befreien Sie den gemeinsamen Gallengang vorsichtig mit einer fein gebogenen Pinzette ohne Zähne. HINWEIS: Der gemeinsame Gallengang wird sehr leicht beschädigt und bricht. Sobald es bricht, kann es nicht mehr kanüliert werden. Aufgrund der Richtung der anatomischen Position sind gebogene Pinzetten besser zu verwenden.</li>
		<li>Legen Sie zwei 6 - 0 Seidennahtschlaufen über den gemeinsamen Gallengang, um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten.</li>
	</ol></li>
	<li>Kanülierung des Gallengangs
	<ol><li>Stechen Sie den Gallengang vorsichtig mit einer 30-G-Nadel ein. Verwenden Sie eine spitze, gebogene Pinzette, um das kleine Loch so zu vergrößern, dass es in die Gallengangskanülierung passt.</li>
		<li>Fassen Sie die Gallengangskanüle mit einer Kanülenzange und schieben Sie sie in den Gallengang.</li>
		<li>Befestigen Sie die Kanüle doppelt mit den voreingestellten 6 - 0 Nahtschlaufen. HINWEIS: Während der Kanülierung ist ein Widerstand der Galle zu spüren. Wenn die Kraft nicht gut kontrolliert wird, wird die Kanüle durch den Druck des Gallenabflusses aus den Gallenwegen gedrückt. Stellen Sie die Tiefe der Kanüle vorsichtig ein. Wenn es zu tief ist, kann es den Gallengang beschädigen, und wenn es nicht tief genug ist, kann es herausrutschen.</li>
		<li>Beobachten Sie den Gallenfluss in der Kanüle nach erfolgreicher Kanülierung.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Pfortader
	<ol><li>Klemmen Sie die Pfortader mit einer flachen Pinzette ab und befreien Sie vorsichtig das Bindegewebe mit einer gebogenen Pinzette. Ziehen Sie nicht zu stark, um einen Riss der Pfortader zu vermeiden. Sobald die Pfortader beschädigt ist, ist es schwierig, die Pfortader wieder zu kanulieren.</li>
		<li>Präparieren Sie die PV direkt über der Bifurkation und platzieren Sie die erste Nahtschlaufe mit 6 - 0 Seidennaht auf PV in der Nähe der Konfluenz für die spätere Verwendung.</li>
		<li>Platzieren Sie die zweite Nahtschlaufe zur späteren Fixierung des PV so nah wie möglich am Leberhilus.</li>
	</ol></li>
	<li>Pfortader-Kanülierung
	<ol><li>Verwenden Sie eine arterielle Klammer, um die distale Pfortader zu verschließen.</li>
		<li>Punktieren Sie die Pfortader sehr vorsichtig mit einer der oben genannten Pfortaderkanülen. Der Blutfluss innerhalb der Kanüle ist nach einer erfolgreichen Punktion deutlich zu beobachten.</li>
		<li>Befestigen Sie die PV-Kanüle mit der vorplatzierten 6 - 0 Nahtschlaufe.</li>
	</ol></li>
	<li>Leberspülung
	<ol><li>Erhöhen Sie den Isoflurangehalt auf 5 % und euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran-Inhalation.</li>
		<li>Nehmen Sie vorgewärmte Heparin-Kochsalzlösung aus dem Inkubator. Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich in der heparinisierten Kochsalzlösung gebildet haben.</li>
		<li>Fixieren Sie die Spritze mit der vorgewärmten heparinisierten Kochsalzlösung in der Spritzenpumpe.</li>
		<li>Schließen Sie den Verlängerungsschlauch der Spritzenpumpe an die Kanüle der Pfortader an, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 2 ml/min ein und starten Sie die Leberspülung.</li>
		<li>Beobachten Sie die Farbe der Leber am Ende des Spülvorgangs. Schneiden Sie die Leber heraus, sobald die Farbe ein homogenes Gelb annimmt.</li>
		<li>Durchtrennen Sie das Zwerchfell, die suprahepatische untere Hohlvene, die infrahepatische Hohlvene, die Leberarterie, die distale Pfortader und das verbleibende Bindegewebe.</li>
		<li>Legen Sie die Leber in die Petrischale.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Leber- und Kammerverbindung
<ol><li>Leberübertragung
	<ol><li>Übertragen Sie die Leber vorsichtig mit einer Petrischale in die Organkammer.</li>
		<li>Bewahren Sie eine kleine Menge Kochsalzlösung in der Petrischale auf, um ein Austrocknen der Leber zu verhindern. HINWEIS: Pfortader und Gallengang können während dieses Eingriffs leicht verdreht werden, was die Leberdurchblutung und die Gallensammlung beeinträchtigen kann.</li>
	</ol></li>
	<li>Pfortaderkanülenverbindung
	<ol><li>Infundieren Sie mit einer Spritze langsam normale Kochsalzlösung in die Pfortaderkanüle, um die Luftblasen in der Kanüle zu entfernen.</li>
		<li>Verbinden Sie die Pfortaderkanüle mit dem Perfusat-Abflussschlauch in der Orgelkammer.</li>
	</ol></li>
	<li>Gallengang-Kanülenanschluss
	<ol><li>Führen Sie die Gallengangskanüle der Maus durch das Ventil einer Gummikappe, die mit der Organkammer verbunden ist.</li>
		<li>Führen Sie die Gallengangskanüle in ein vorbereitetes 0,5-ml-Mikroröhrchen mit einem kleinen Loch im Deckel ein.</li>
		<li>Legen Sie das Mikroröhrchen außerhalb des Orgelraums auf Ton.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Passen Sie die Durchflussmenge entsprechend dem PV-Druck an
<ol><li>Schalten Sie die Peristaltikpumpe ab 1 ml/min ein.</li>
	<li>Überprüfen Sie den Pfortaderdruck, um die Durchflussrate anzupassen.</li>
	<li>Halten Sie den Pfortaderdruck im physiologischen Bereich zwischen 7 - 10 mmHg, indem Sie die Flussrate anpassen. Anmerkungen: Der Nenndurchfluss kann je nach Verwendung und Positionierung der Rohre leicht variieren.</li>
</ol>5. Probenentnahme
<ol><li>Entnahme von Einlass-Perfusat-Proben aus dem Pfortader-Einströmrohr und Auslass-Perfusat-Proben aus der Orgelkammer in 3-Stunden-Intervallen.</li>
	<li>Entnahme von Proben aus allen Leberlappen zur histologischen Analyse am Ende der Perfusionszeit von 12 h.</li>
</ol>

Es bestehen keine finanziellen Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Kritische Schritte im Protokoll Die beiden entscheidenden Schritte bei der Leberexplantation sind die Kanülierung der Pfortader (PV) und die anschließende Kanülierung des Gallengangs (BD). Diese Schritte sind von größter Bedeutung, um eine erfolgreiche Organentnahme und anschließende Perfusions- oder Transplantationsverfahren zu gewährleisten.
Herausforderungen und Lösungen Die PV-Kanülierung stellt drei Herausforderungen dar: Verletzung der Gefäßwand, V...

Die Lebertransplantation stellt den Goldstandard für die Behandlung von Personen mit Lebererkrankungen im Endstadium dar. Bedauerlicherweise übersteigt die Nachfrage nach Spenderorganen das verfügbare Angebot, was zu einer erheblichen Verknappung führt. Im Jahr 2021 standen etwa 24.936 Patienten auf der Warteliste für ein Lebertransplantat, während nur 9.234 Transplantationen erfolgreich durchgeführt wurden1. Die erhebliche Diskrepanz zwischen Angebot und Nachfrage nach Lebertransplantaten unterstreicht die dringende Notwendigkeit, alternative Strategien zur Erweiterung des Spenderpools und zur Verbesserung der Zugänglichkeit von Lebertransplantaten zu untersuchen. Eine Möglichkeit, den Spenderpool zu erweitern, ist der Einsatz von marginalen Spendern2. Zu den marginalen Spendern gehören Personen mit fortgeschrittenem, mittelschwerer oder schwerer Steatose. Obwohl die Transplantation von marginalen Organen zu günstigen Ergebnissen führen kann, bleiben die Gesamtergebnisse suboptimal. Daher ist derzeit die Entwicklung therapeutischer Strategien im Gange, die darauf abzielen, die Funktion marginaler Spender zu verbessern 3,4.
Eine der Strategien besteht darin, die maschinelle Perfusion, insbesondere die normotherme sauerstoffhaltige maschinelle Perfusion, zu nutzen, um die Funktion dieser marginalen Organe zu verbessern5. Es gibt jedoch noch ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die den positiven Effekten der normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) zugrunde liegen. Mäuse mit ihrer reichlichen Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen dienen als wertvolle Modelle für die Untersuchung molekularer Signalwege. So wurde beispielsweise die Bedeutung von Autophagie-Signalwegen bei der Linderung von Leberischämie-Reperfusionsschäden zunehmend anerkannt 6,7. Ein wichtiger molekularer Signalweg bei der hepatischen Ischämie-Reperfusions-Schädigung ist der miR-20b-5p/ATG7-Signalweg8. Derzeit gibt es eine Reihe von ATG-Knockout- und bedingten Knockout-Mausstämmen, aber keine entsprechenden Rattenstämme9.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel, eine miniaturisierte NEVLP-Plattform für Lebertransplantate von Mäusen zu generieren. Diese Plattform würde die Erforschung und Bewertung potenzieller genetisch veränderter Strategien zur Verbesserung der Funktionalität der Leber des Spenders erleichtern. Darüber hinaus war es wichtig, dass das System für eine langfristige Perfusion geeignet ist, um die Ex-vivo-Behandlung der Leber zu ermöglichen, die gemeinhin als "Organreparatur" bezeichnet wird.
In Anbetracht der begrenzten Verfügbarkeit relevanter In-vitro-Daten zur Leberperfusion von Mäusen konzentrierte sich die Literaturrecherche auf Studien, die an Ratten durchgeführt wurden. Eine systematische Literaturrecherche aus den Jahren 2010 bis 2022 wurde anhand von Schlagworten wie "normotherme Leberperfusion", "ex vivo oder in vitro" und "Ratten" durchgeführt. Diese Suche zielte darauf ab, optimale Bedingungen für Nagetiere zu identifizieren, so dass wir den am besten geeigneten Ansatz bestimmen konnten.
Das Perfusionssystem besteht aus einem abgedichteten, wasserummantelten Glaspufferreservoir, einer peristaltischen Rollenpumpe, einem Oxygenator, einer Blasenfalle, einem Wärmetauscher, einer Orgelkammer und einem geschlossenen Schlauchsystem (Abbildung 1). Das System gewährleistet die präzise Aufrechterhaltung einer konstanten Perfusionstemperatur von 37 °C mit einer speziellen thermostatischen Maschine. Die peristaltische Rollenpumpe treibt den Durchfluss des Perfusats durch den gesamten Kreislauf. Der Perfusionskreislauf beginnt am isolierten, wasserummantelten Reservoir. Anschließend wird das Perfusat durch den Oxygenator geleitet, der aus einer speziellen Gasflasche ein Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid erhält. Nach der Sauerstoffanreicherung durchläuft das Perfusat die Blasenfalle, in der alle eingeschlossenen Blasen von der Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet werden. Das verbleibende Perfusat fließt durch den Wärmetauscher und gelangt in den Orgelraum, von wo aus es in den Vorratsbehälter zurückkehrt.
Hier berichten wir über unsere Erfahrungen bei der Etablierung eines NEVLP für Mauslebern und teilen die vielversprechenden Ergebnisse eines Pilotversuchs, das mit dem sauerstoffhaltigen Medium ohne Sauerstoffträger durchgeführt wurde.

<table><tbody><tr><td>0,5 ml Micro Tube PP</td><td>Sarstedt</td><td>72699</td><td></td></tr><tr><td>1 Fr Gummikanüle</td><td>Vygon</td><td>Probenkanüle</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro; L Mikrospritze</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>2 Fr Gummikanüle</td><td>Vygon</td><td>Probenkanüle</td><td></td></tr><tr><td>24 g Schmetterlingskanüle</td><td>Terumo</td><td>SR+OF2419</td><td></td></tr><tr><td>26 g Schmetterlingskanüle</td><td>Terumo</td><td>SR+DU2619WX</td><td></td></tr><tr><td>30 g Injektionskanüle</td><td>Sterican</td><td>100246</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Spritzenpumpe</td><td>Braun</td><td>110356</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Seide</td><td></td><td>Ethicon 639H</td><td></td></tr><tr><td>Arterial Clip</td><td>Braun</td><td>BH014R</td><td></td></tr><tr><td>Autoklavierbare Feuchtkammer</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4733</td><td></td></tr><tr><td>Big Cotton Applikator&nbsp;</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974018</td><td></td></tr><tr><td>Bubble Trap</td><td>Hugo-Sachs-Elektronik</td><td>V83163</td><td></td></tr><tr><td>Buprenovet (0,3 mg / ml)</td><td>Elanco</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>CIDEX OPA Lösung (2 L)</td><td>Cilag GmbH</td><td>20391</td><td></td></tr><tr><td>Elektrochirurgisches Gerät für monopolares Schneiden VIO&reg; 50 C</td><td>ERBE</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (500 ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gasgemisch (95 % Sauerstoff & 5 % Kohlendioxid)</td><td>Hausversorgung</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Heizung Umlaufbäder</td><td>Harvard-Apparatur</td><td>75-0310</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 5000 (I.E. /5 ml)</td><td>Braun</td><td>1708.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison (100 mg / 2 ml)</td><td>Pfizer</td><td>15427276</td><td></td></tr><tr><td>Insulin (100 IE / ml)</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iris-Schere&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (250 ml)</td><td>Cp-Pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>Membranoxygenator</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>T18728</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgie-Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Retraktor-Set&nbsp;</td><td>Carfil Qualität</td><td>180000056</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT</td><td>Hamamatsu</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Vliesschwämme&nbsp;</td><td>Kompressen</td><td>866110</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)</td><td>C.C.Pro</td><td>Z-13-M</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionsverlängerungsschlauch (30 cm)</td><td>Braun</td><td>4256000</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Harvard-Apparatus</td><td>P-70</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dishc 100x15 mm</td><td>VWR&reg;</td><td>391-0578</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)</td><td>Livisto</td><td>799-416</td><td></td></tr><tr><td>Druckmessumformer Simulator</td><td>UTAH Medical Products</td><td>650-950</td><td></td></tr><tr><td>Wiederverwendbare Blutdruckmessumformer</td><td>AD Instruments</td><td>MLT-0380/D</td><td></td></tr><tr><td>S & T Gefäß Kanülenzange</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner Baumwollapplikator</td><td>NOBA Verbandmittel Danz GmbH</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Gerade Pinzette 10 cm&nbsp;</td><td>Fine Science Instruments</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Nahtbindezange</td><td>Fine Science Instruments</td><td>11063-07</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 50ml Original Perfusor</td><td>Braun</td><td>8728810F-06</td><td></td></tr><tr><td>UT - 03 Kanüle</td><td>Unique Medical, Japan</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Instruments</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Veterinärmedizinische Kochsalzlösung (500 ml)</td><td>WDT</td><td>18X1807</td><td></td></tr><tr><td>Wasserummanteltes Reservoir&nbsp; 2 L</td><td>Harvard-Gerät</td><td>73-3441</td><td></td></tr><tr><td>William's E Medium (500 ML)</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

normotherme ex vivo lebermaschinenperfusion bei mäusen

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

Dieses Protokoll stellt ein optimiertes erythrozytenfreies NEVLP-System unter Verwendung von Mauslebern dar. Die Ex-vivo-Konservierung von Mäuselebern wurde durch den Einsatz modifizierter Kanülen und Techniken erreicht, die von konventionellen kommerziellen Ex-vivo-Perfusionsgeräten übernommen wurden. Das System wurde verwendet, um die Konservierungsergebnisse nach 12 h Perfusion zu bewerten. C57BL/6J-Mäuse dienten als Leberspender, und die Lebern wurden explantiert, indem die Pfortader (PV) und der Gallengang (BD) kanüliert und das Organ anschließend mit warmer (37 °C) heparinisierter Kochsalzlösung gespült wurde. Anschließend wurden die explantierten Lebern in die Perfusionskammer überführt und einer normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) unterzogen. Die Einlass- und Auslassproben des Perfusats wurden in Abständen von 3 Stunden zur Perfusatanalyse entnommen. Nach Abschluss der Perfusion wurden Leberproben zur histologischen Analyse entnommen, wobei die morphologische Integrität mittels modifiziertem Suzuki-Score durch Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung beurteilt wurde. Die Optimierungsexperimente ergaben folgende Ergebnisse: (1) Mäuse mit einem Gewicht von über 30 g wurden aufgrund der größeren Größe ihres Gallengangs (BD) als besser geeignet für das Experiment erachtet. (2) Eine 2 Fr (Außendurchmesser = 0,66 mm) Polyurethankanüle war im Vergleich zu einer Polypropylenkanüle besser für die Kanülierung der Pfortader (PV) geeignet. Dies wurde auf die verbesserte Griffigkeit des Polyurethanmaterials zurückgeführt, die zu einem geringeren Katheterschlupf während des Transfers vom Körper in die Organkammer führte. (3) Für die Kanülierung des Gallengangs (BD) erwies sich eine 1 Fr (Außendurchmesser = 0,33 mm) Polyurethankanüle als wirksamer als die Polypropylenkanüle UT - 03 (Außendurchmesser = 0,30 mm). Mit diesem optimierten Protokoll konnten Mauslebern erfolgreich für eine Dauer von 12 Stunden konserviert werden, ohne dass die histologische Struktur signifikant beeinflusst wurde. Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung ergab eine gut erhaltene morphologische Architektur der Leber, die durch überwiegend lebensfähige Hepatozyten mit deutlich sichtbaren Zellkernen und eine leichte Dilatation der hepatischen Sinusoide gekennzeichnet ist.

Etablierung des chirurgischen Verfahrens Insgesamt wurden 17 Tiere für dieses Experiment verwendet: 14 Mäuse wurden zur Optimierung des Organbeschaffungsprozesses einschließlich der Kanülierung der Pfortader (PV) und des Gallengangs (BD) eingesetzt, während 3 Mäuse zur Validierung des Verfahrens verwendet wurden (Tabelle 1). Die histologischen Ergebnisse (Abbildung 3) wurden verglichen, um die Identifizierung der optimalen Perfusionsbedingungen zu erleich...

Für die Leber von Mäusen wurde ein normothermisches ex vivo Leberperfusionssystem (NEVLP) entwickelt. Dieses System erfordert Erfahrung in der Mikrochirurgie, ermöglicht aber reproduzierbare Perfusionsergebnisse. Die Möglichkeit, Mäuselebern zu verwenden, erleichtert die Untersuchung molekularer Signalwege zur Identifizierung neuartiger Perfusat-Additive und ermöglicht die Durchführung von Experimenten, die sich auf die Reparatur von Organen konzentrieren.

Normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Normotherme Ex-vivo-Lebermaschinenperfusion bei Mäusen. Die normotherme oxygenierte Leberperfusion ist eine vielversprechende Strategie zur Rettung marginaler Organe und wurde kürzlich in die klinische Praxis eingeführt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch nicht gut verstanden.Ein Mausmodell wird benötigt, um die molekularen Signalwege weiter zu untersuchen, wobei genetisch veränderte Tiere, wie z.B. transgene Mäuse, genutzt werden, um auf die Etablierung eines normothermen sauerstoffhaltigen maschinellen Perfusionssystems für Mäuseleber zu warten. Hier ist ein Schema unseres gesamten Systems. Zunächst wird das gesamte System bei 37 Grad Celsius von einem thermostatischen Regler durch Wasserzirkulation gesteuert.Das Perfusat wird aus dem Reservoir durch eine Peristaltikpumpe in einen Oxygenator gepumpt. Im Oxygenator befindet sich ein ununterbrochener Gasfluss von 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Das Perfusat durchläuft dann eine Blasenfalle.Das Perfusat mit Luftblasen wird unter Druck zurück in den Vorratsbehälter gepumpt. Das verbleibende Perfusat fließt in die Orgelkammer, wo der Schlauch mit der Pfortader verbunden ist. Das Perfusat wird aus der Leber durch den suprahepatischen Cava in die Organkammer abgeleitet.Der Perfusatabfluss aus dem Orgelraum wird durch die Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet. Ein Gallendrainageschlauch ist mit der Orgelkammer verbunden, um die Galle aufzufangen. Das ist unser OP-Tisch.Alle Operationen werden unter dem Mikroskop durchgeführt. Wir sorgen für halbsterile Betriebsbedingungen während des gesamten chirurgischen Eingriffs. Halten Sie die französische Schlauchkanüle mit einer Pinzette fest.Durchdringen Sie die Kanülenwand mit einer 30G-Nadel in einem Abstand von einem Zentimeter vom Ende der Kanüle. Schieben Sie die Nadel durch die Kanüle, bis die Nadelspitze sichtbar wird. Hier ist ein Vergleichsbild von 26G-Katheter und selbstgebauter Kanüle; Beide sind für die Mausportalkanülierung geeignet.Bereiten Sie 25 Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung mit einer Endkonzentration von 2.500 internationalen Einheiten pro Milliliter vor und legen Sie die Spritze in einen Inkubator, der auf 40 Grad Celsius eingestellt ist. Hier sind die Hauptkomponenten des normothermen maschinellen Perfusionssystems ex vivo. Zu den Komponenten gehören hauptsächlich der Orgelraum, die Thermostatmaschine, die Rollenpumpe, der Oxygenator und das Reservoir.Hier sehen Sie einen detaillierten Aufbau unseres Orgelraums. Grundsätzlich besteht es aus einem Orgelkammerkörper, einem Drucksensor, einem Wärmetauscher und einer Blasenfalle. Wir richten einen Perfusat-Einlass, einen Perfusat-Auslass und eine Gallenabflussöffnung ein.Dies ist das ADI-Überwachungssystem, das wir zur Überwachung des Pfortaderdrucks verwenden. Das ADI-System besteht aus einem Drucksensor, einer zentralen Steuerung und Displays. Schalten Sie das LabChart-Programm für die Drucküberwachung ein.Kalibrierung und Nullstellung sind vor jeder Verwendung des Drucksensors erforderlich. Verwenden Sie Null-Millimeter-Quecksilber und 20-Millimeter-Quecksilber als Markierungen, um den Drucksensor für die zweistufige Kalibrierung zu kalibrieren. Aufgrund der ständigen Überwachung des Portaldrucks können wir das Portal fluran entsprechend den Druckänderungen anpassen.Bei gleichen Mengen an Perfusat für das Reservoir und die Orgelkammer zur Vorbereitung des Systems muss besonderes Augenmerk auf die Aufrechterhaltung der Sterilität während des Füllprozesses gelegt werden. Verbinden Sie die Induktionskammer mit einer Steckdose. Drehen Sie den Sauerstoff auf 0,5 Liter pro Minute.Verwandeln Sie Isofluran auf 3%Legen Sie das Tier in die Kammer, bis eine tiefe Betäubung erreicht ist. Verwenden Sie eine Mikrospritze, um eine an das Körpergewicht angepasste Dosis der Analgesie aufzutragen. Hier sieben Mikroliter Buprenorphin.Jetzt beginnen wir mit der Operation. Machen Sie einen Querschnitt im Bauchbereich der Maus. Der Hautschnitt erstreckt sich beidseitig bis zur beidseitigen Fleischachsellinie.Machen Sie vorsichtig einen Längsschnitt entlang der Linea alba. Durchtrennen Sie die Bauchmuskelschicht mit Elektrokoagulation und Schere. Legen Sie vorsichtig ein Stück nasse Gaze auf, um die Leber vor Elektrokoagulation zu schützen.Legen Sie die Bauchhöhle der Maus vollständig frei. Bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig mit einem feuchten Wattestäbchen aus der Bauchhöhle, um den Hilus vollständig freizulegen. Hier ist ein schematisches Diagramm der Pfortaderkanülierung und Gallengangskanülierung dargestellt.Grundsätzlich wählen wir die passende Kanüle entsprechend der Größe der Maus aus und verwenden für die Fixierung der Kanüle 6-0 Seidennaht. Befreien Sie den gemeinsamen Gallengang vorsichtig mit einer fein gebogenen Pinzette ohne Zähne. Der gemeinsame Gallengang wird sehr leicht beschädigt und bricht.Sobald es bricht, kann es nicht mehr kanüliert werden. Durch die Richtung der anatomischen Position sind gebogene Pinzetten leichter zu bedienen. Legen Sie zwei 6-0 Seidenfadenschlaufe über den gemeinsamen Gallengang, um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten.Durchstechen Sie den Gallengang vorsichtig mit einer 30G-Nadel. Verwenden Sie eine spitze, gebogene Pinzette, um die kleinen Löcher zu vergrößern, damit die Gallengangskanülierung gespeist werden kann. Verwenden Sie eine Gefäßkanülenzange über die Gallengangskanüle und schieben Sie sie in den Gallengang. Anmerkung.Im Moment der Kanülierung werden Sie den Widerstand spüren, den die Galle mit sich bringt. Wenn die Kraft nicht gut kontrolliert wird, wird die Kanüle durch den Druck des Gallenabflusses aus den Gallenwegen gedrückt. Stellen Sie die Tiefe der Kanüle vorsichtig ein.Wenn es zu tief ist, kann es den Gallengang beschädigen, und wenn es nicht tief genug ist, kann es herausrutschen. Der Gallenfluss in der Kanüle kann nach erfolgreicher Kanülierung beobachtet werden. Klemmen Sie die Pfortader mit einer flachen Pinzette ab und befreien Sie vorsichtig das Bindegewebe mit einer gebogenen Pinzette.Ziehen Sie hier nicht zu stark, um ein Reißen der Pfortader zu vermeiden. Sobald die Pfortader beschädigt ist, ist es schwierig, die Pfortader zu kanulieren. Legen Sie zwei 6-0 Seidennahtschlaufe über die freie Pfortader.Verwenden Sie eine arterielle Klammer, um die distale Pfortader zu verschließen. Punktieren Sie die Pfortader sehr vorsichtig mit einer der oben genannten Pfortaderkanülen. Der Blutfluss innerhalb der Kanüle ist nach einer erfolgreichen Punktion deutlich zu beobachten.Nehmen Sie vorgewärmte Heparin-Kochsalzlösung aus dem Inkubator. Entfernen Sie alle Luftblasen. Befestigen Sie die Spritze mit der vorgewärmten heparinisierten Kochsalzlösung in der Spritzenpumpe.Verbinden Sie den Verlängerungsschlauch der Spritzenpumpe mit der Kanüle der Pfortader. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf zwei Milliliter pro Minute ein und starten Sie die Leberspülung. Erhöhen Sie den Isoflurangehalt auf 5 % und euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran-Inhalation.Beobachten Sie die Farbe der Leber am Ende des Spülvorgangs. Schneiden Sie die Leber heraus, sobald die Farbe ein homogenes Gelb angenommen hat. Übertragen Sie die Leber vorsichtig mit einer Petrischale in die Organkammer.Bewahren Sie eine kleine Menge Kochsalzlösung in der Petrischale auf, um zu verhindern, dass eine Leber zerdrückt wird. Anmerkung. Pfortader und Gallengang können bei diesem Eingriff leicht verdreht werden, was die Leberdurchblutung und die Gallensammlung beeinträchtigen kann. Infundieren Sie mit einer Spritze langsam normale Kochsalzlösung in die Pfortaderkanüle, um die Luftblasen in der Kanüle zu entfernen.Verbinden Sie die Pfortaderkanüle mit dem Perfusat-Abflussschlauch in der Orgelkammer. Die Gallengangskanüle der Maus wird durch ein Ventil der Organkammer geführt, das mit einer Gummikappe verschlossen wird. Dann wird der Gallenschlauch in ein vorbereitetes 0,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit einem kleinen Loch in der Elektrode eingeführt.Nachdem alles angeschlossen ist, schalten Sie die Peristaltikpumpe ein. Überprüfen Sie den Pfortaderdruck, um die Durchflussrate anzupassen. Halten Sie den Pfortaderdruck zwischen sieben und 10 Millimeter Quecksilbersäule, indem Sie die Durchflussrate anpassen. Anmerkung.Der Nenndurchfluss kann je nach Alter und Positionierung der Rohre leicht variieren. Dies ist die Auswahl des Perfusatmediums, des Perfusatvolumens und des Perfusionsdrucks auf der Grundlage einer Literaturaufarbeitung von normothermen sauerstoffhaltigen Rattenlebermaschinen-Perfusionsstudien. Dies ist ein Schritt-für-Schritt-Versuch zur Etablierung des Maus-Perfusionsmodells.Es waren etwa 14 Experimente erforderlich, um die am besten geeigneten Katheter auszuwählen. In unseren Händen ist die Verwendung von zwei französischen Gummikathetern für die Pfortader zusammen mit einem französischen Gummikatheter für den Gallengang die beste Kombination, um eine homogene Perfusion mit allen Kathetern zu erreichen. pH-Wert und Kaliumspiegel waren während der 12-stündigen Perfusion stabil.Der pH-Wert lag zwischen 7,26 und 7,71 und der Kaliumgehalt zwischen 5,9 und 6,8 Millimol pro Liter. Die HE-Färbung zeigt, dass nach 12 Stunden Perfusion die histologische Integrität der Mausleber relativ gut erhalten war. Zusammenfassend konnten wir hier die erfolgreiche Etablierung eines normothermen oxygenierten maschinellen Perfusionssystems für die Mausleber demonstrieren.Die Perfusion einer Mausleber über 12 Stunden führte zu einer guten Erhaltung der Lebermorphologie, wenn auch nicht im gesamten Organ. Weitere Anstrengungen sind erforderlich, um eine vollständig homogene Perfusion über einen längeren Zeitraum zu erreichen. Sobald dies erreicht ist, kann der Einsatz von gentechnisch veränderten Tieren in Betracht gezogen werden, wie z. B. der Einsatz von IL-2-Knockout-Mäusen, um die Rolle der Entzündung zu untersuchen.

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Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

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