Name: Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Kultur von Maus-Skelettmuskelgewebe zur Untersuchung von Satellitenzellen und deren Nische. Diese Methode ermöglicht die Analyse quieszenter Zellen und unterstützt die Muskelforschung.

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Für Abbildung 2 wurden Vorlagen von Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) verwendet. Das FR-Labor wird von der Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE (Stipendien 19507 und 22946), der Fondation pour la Recherche Médicale - FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), der Agence Nationale pour la Recherche - ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) und der La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130) unterstützt. Die oben genannten Geldgeber spielten keine Rolle bei der Konzeption, Sammlung, Analyse, Interpretation oder Berichterstattung dieser Studie oder dem Schreiben dieses Manuskripts.

Alle Versuche entsprachen den französischen und EU-Tierschutzvorschriften des Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955), insbesondere der Richtlinie 2010/63/EU. Die Tiere wurden in einer kontrollierten und angereicherten Umgebung in den Tiereinrichtungen mit den Zertifizierungsnummern A94 028 379 und D94-028-028 gehalten. Sie wurden nur von autorisierten Forschern und Tierpflegern angefasst und vom Personal der Tierhaltung visuell auf Anzeichen von Unbehagen während ihres Lebens untersucht. Sie wurden vor der Sektion durch Gebärmutterhalsluxation euthanasiert. Zu Lebzeiten der Tiere wurden keine interventionellen Eingriffe durchgeführt; Daher war es nicht erforderlich, die Zustimmung einer Ethikkommission und des französischen Ministeriums für Hochschulbildung, Forschung und Innovation für das Verfahren einzuholen. In der Tat ist für die Euthanasie und die postmortale Sektion gemäß der Richtlinie 2010/63/EU keine Ethik-Unbedenklichkeitsbescheinigung erforderlich. Die in diesem Manuskript vorgestellten Ergebnisse stammen aus der Wildtyp-Linie C57BL/6NRj (siehe Materialtabelle) und der transgenen Tg:Pax7-nGFP-Linie 12 (gezüchtet von unserem Team). Das Protokoll wurde auf männliche und weibliche Mäuse im Alter von 8-12 Wochen angewendet.
1. Vorbereitung des Reagenzes und der Ausrüstung vor dem Verdau
<ol><li>Besprühen Sie die Sezierwerkzeuge (gerade und gebogene Schere, Pinzette, siehe Materialtabelle) mit 70%igem Ethanol und trocknen Sie sie mit Papier. Beschichten Sie eine Korkplatte mit Alufolie und halten Sie 10 cm Petrischalen (eine pro Tier) in der Nähe. Halten Sie Papier und 70% Ethanol in Reichweite. HINWEIS: Spülen Sie die Sezierwerkzeuge am Ende der Sektion mit Wasser ab, besprühen Sie sie dann mit 70%igem Ethanol und trocknen Sie sie mit Papier.</li>
	<li>Stellen Sie ein rotierendes Wasserbad auf 37 °C ein und bereiten Sie die Aufschlussmischung (20 ml/Tier) zu, indem Sie DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 0,5 U/ml-Kollagenase, 3 U/ml-Dispase (siehe Materialtabelle) und 0,2 % BSA in 50-ml-Röhrchen kombinieren.</li>
	<li>Die Aufschlussmischung wird durch einen 0,22-μm-Filter in einer Zellkulturhaube geleitet. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Verdauungsmischung jedes Mal frisch zuzubereiten.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Reagenzes und der Ausrüstung nach dem Aufschluss
<ol><li>Nach der Verdauung kann die Mischung eingefroren oder kultiviert werden. Zum Einfrieren bereiten Sie 10 % DMSO: 90 % fötales Kälberserum (FBS) sowie einen Satz Kryoröhrchen (1 ml Zellsuspension pro 2 ml Kryoröhrchen) vor. Für die Kultur bereiten Sie das Nährmedium (DMEM ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 4 ng/ml bFGF und 20 % FBS) und einen Satz 8-Well-Platten vor. Die Platten müssen vor dem Beschichten der Zellen beschichtet werden (Details finden Sie in Schritt 7.1).</li>
	<li>Für die Färbung werden 4 % Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (0,15 ml/Well der 8-Well-Platte) und Blockierungslösung (5 % IgG-freies Rinderserumalbumin [BSA] in PBS; 0,15 ml/Well der 8-Well-Platte) vorbereitet. VORSICHT: Atmen Sie das PFA-Pulver nicht ein; Bereiten Sie es vor und handhaben Sie es unter einer chemischen Haube.</li>
</ol>3. Sezieren
<ol><li>Besprühen Sie das eingeschläferte Tier mit 70%igem Ethanol. Machen Sie einen horizontalen Schnitt (linke Körperseite zur rechten Seite) mit einer großen Schere auf Höhe des Bauches und schneiden Sie um die Taille herum. Ziehen Sie die Haut von den Hintergliedmaßen ab, um die Muskeln freizulegen (Abbildung 1A).</li>
	<li>Lege das Tier auf die mit Aluminiumfolie überzogene Korkplatte und stecke die gegenüberliegende Vorder- und Hintergliedmaße fest. Entfernen Sie schnell alle Muskeln der Hintergliedmaßen (vorne und hinten) in eine 10 cm lange Petrischale, die auf Eis gestellt wird (Abbildung 1B,C). Achten Sie besonders darauf, das Fettgewebe aus den Bereichen um den Quadrizeps und die hinteren Muskeln zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt können auch Faszien, Nerven und Sehnen entfernt werden, wenn dies die Gesamtzeit für die Präparation nicht beeinträchtigt. HINWEIS: Eine optimale Dissektionszeit für beide Hintergliedmaßen sollte etwa 15-20 Minuten betragen. Es wird empfohlen, dass die Präparierzeit 30 Minuten nicht überschreitet.</li>
	<li>Geben Sie gelegentlich DMEM-Tropfen in die Muskeln, um sie feucht zu halten, aber nicht zu viel, da dies das Hacken erschwert. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Hintergliedmaße. Sobald sich alle Muskeln eines Tieres in der Petrischale befinden (Abbildung 1D), schneiden Sie sie 7-10 Minuten lang mit einer Schere fein zusammen, um ein glattes Homogenat zu erhalten (Abbildung 1E). HINWEIS: In diesem Protokoll wird DMEM mit L-Glutamin, Pyruvat und 4,5 g/L D-Glucose ergänzt.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65433/65433fig01.jpg"> Abbildung 1: Vorbereitung der Muskeln vor der Kultur. (A) Die Haut wird entfernt, um die Muskeln der Hintergliedmaßen freizulegen, wie in Schritt 3.1 beschrieben. (B,C) Alle Muskeln der Hintergliedmaßen werden (B) um und (C) zwischen den Knochen entnommen, wie in Schritt 3.2 beschrieben. (D) Die entnommenen Muskeln werden in einer 10 cm großen Petrischale mit DMEM-Tropfen auf Eis gelegt, um sie feucht zu halten, wie in Schritt 3.3 beschrieben. (E) Die Muskeln werden mit einer Schere fein gehackt, bis eine glatte Paste mit der in diesem Bild dargestellten Konsistenz entsteht. (F) ein Bild des Pellets nach der abschließenden Zentrifugation; Der blaue Pfeil hebt das Pellet hervor, das sich gegen das Rohr befindet, unter der gestrichelten blauen Linie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65433/65433fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
4. Verdauung
HINWEIS: Am Ende des Aufschlusses werden eine Zentrifuge bei 4 °C, ein Eimer Eis, drei Zellsiebe (100 μm, 70 μm, 40 μm) und drei 50-ml-Röhrchen (pro Tier) für Abschnitt 5 benötigt.
<ol><li>Bereiten Sie die Aufschlussmischung vor und filtern Sie sie, wie in Schritt 1.2 beschrieben. Halte die Mischung auf Eis.</li>
	<li>Sobald alle Muskeln zerkleinert sind, geben Sie das Homogenat in ein 50-ml-Röhrchen mit 20 ml Aufschlussmischung. Umwickeln Sie die Ränder des Deckels mit flexibler Folie, um ein Auslaufen zu verhindern, und legen Sie das Röhrchen in ein 37 °C heißes Schüttelwasserbad mit niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit (50 U/min).</li>
	<li>Öffnen Sie nach 1 Stunde bei 37 °C den Deckel und mischen Sie, indem Sie mit einer 10-ml-Pipette siebenmal vorsichtig auf und ab pipettieren, um eine homogene Mischung zu erhalten. Legen Sie eine neue Folie um den Deckel und legen Sie ihn wieder in das Schüttelwasserbad. Entfernen Sie nach 1 Stunde den Schlauch und schalten Sie das Bad aus. HINWEIS: Verwenden Sie diese Inkubationszeit für die Kultur, um die Platten wie in Schritt 7.1 beschrieben zu beschichten, bevor Sie mit Abschnitt 5 fortfahren.</li>
</ol>5. Filtration
<ol><li>Füllen Sie das Aufschlussröhrchen mit kaltem DMEM (ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin) bis zu 50 ml. Mischen Sie, indem Sie die Tube dreimal umdrehen. Bewahren Sie das DMEM für die nächsten Schritte in einem Eiskübel auf.</li>
	<li>Legen Sie ein 100-μm-Zellsieb auf ein neues 50-ml-Röhrchen. Führen Sie die verdaute Mischung durch das Zellsieb in das neue Röhrchen. Bei 600 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand in einen flüssigen Abfallbehälter.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml kaltem DMEM (ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin). Füllen Sie das Röhrchen bis zu 50 ml mit demselben DMEM. HINWEIS: Wenn die Zentrifugation übersprungen wird, ist das nächste Pellet schwieriger zu identifizieren und zu warten.</li>
	<li>Legen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf ein neues 50-ml-Röhrchen. Führen Sie die zentrifugierte/resuspendierte Mischung durch das Zellsieb in das neue Röhrchen. Bei 80 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. HINWEIS: Dieser Schritt ist nicht obligatorisch, wird aber empfohlen, um Zelltrümmer zu beseitigen.</li>
	<li>Legen Sie ein 40-μm-Zellsieb auf ein neues 50-ml-Röhrchen. Führen Sie den Überstand durch das Zellsieb in das neue Röhrchen. Bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand in einen Behälter für flüssige Abfälle gießen und das Pellet in FBS unter der Kulturhaube resuspendieren. Das Pellet ist in diesem Schritt sehr klein (Abbildung 1F). HINWEIS: Durch das Filtern durch das 40-μm-Sieb werden Ablagerungen entfernt, die bei der späteren Färbung der Kulturen ein unspezifisches Signal abgeben würden.</li>
</ol>6. (Optional) Einfrieren
HINWEIS: Abschnitt 6 ist optional. Das Protokoll kann nach der Filterung pausiert werden, was jedoch das Überleben der Zellen und den Kulturerfolg verringern kann.
<ol><li>Fügen Sie DMSO hinzu, um ein Verhältnis von 10 % DMSO zu 90 % FBS zu erhalten, und überführen Sie es in Kryoröhrchen (1 ml resuspendiertes Pellet pro 2 ml Kryoröhrchen).</li>
	<li>Legen Sie das Kryoröhrchen bei −80 °C über Nacht in eine Styroporbox. Am nächsten Tag auf −150 °C für eine langfristige Lagerung umstellen. HINWEIS: Eine kurzzeitige Lagerung bei −80 °C ist ebenfalls möglich.</li>
	<li>Zu Beginn der Kultur wird das Kryoröhrchen in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell aufgetaut, bis die Zellsuspension aufgetaut ist. Mischen Sie mit 4 ml DMEM unter der Kultivierungshaube. Bei 600 x g 5 min bei 4 °C schleudern. Pipettieren Sie den Überstand heraus und fahren Sie fort, wie in Schritt 7.2 beschrieben.</li>
</ol>7. Kultivierung
HINWEIS: Es kann davon ausgegangen werden, dass gefrorene oder frische Zellsuspensionen 24-32 Wells mit drei bis vier 8-Well-Platten füllen.
<ol><li>Beschichten Sie 8-Well-Platten mit der Beschichtungslösung, die bei 4 °C oder auf Eis aufgetaut werden sollte (Standardbeschichtungslösung wird normalerweise bei −20 °C aufbewahrt). Geben Sie 0,4 ml Beschichtungslösung in eine Vertiefung und pipettieren Sie sie von Vertiefung zu Vertiefung. Nachdem die Beschichtungslösung alle Vertiefungen durchlaufen hat, kann sie für zukünftige Kulturen wieder aufgefangen und wieder eingefroren werden. Halten Sie die beschichteten Platten 30 Minuten lang bei 37 °C, bevor Sie die Zellen plattieren.</li>
	<li>DMEM (ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin) ergänzt mit 4 ng/ml bFGF (siehe Materialtabelle) zur FBS-Zellsuspension hinzufügen, um ein FBS:80%-DMEM-Verhältnis von 20 % zu erhalten. HINWEIS: Auch wenn die Zugabe von bFGF in primären Myoblastenkulturen und bei der satellitenähnlichen Zellproduktion in Massenkulturen von Vorteil sein kann, ist ihre Zugabe optional, da ihre Auslassung in Massenkulturen von ~7 Tagen die Zellausbeute nicht ernsthaft beeinträchtigt.</li>
	<li>Platte 0,4 ml der Suspension pro Vertiefung (aus Schritt 7.2) in die beschichteten 8-Vertiefungsplatten. HINWEIS: Berechnen Sie 30cm2 Kultur pro Tier für gefrorene und frische Zubereitungen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C mit 5 % CO2 für bis zu 10 Tage, wobei das Medium jeden Tag gewechselt wird, nachdem die Kultur beginnt, eine gelbliche Farbe anzunehmen (normalerweise 5-7 Tage). HINWEIS: Um Zellen in der S-Phase des Zellzyklus 13 zu quantifizieren, fügen Sie 2 h vor der Fixierung10 μM EdU hinzu. Um die erste S-Phase einzufangen, fügen Sie 10 μM EdU von der Beschichtung hinzu und fixieren Sie sie bei 40 h Kultur.</li>
</ol>8. Fixierung
HINWEIS: Die Abschnitte 8-10 sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>Pipettieren Sie das Kulturmedium heraus und fixieren Sie die Zellen mit 4 % PFA (0,15 ml/Well). VORSICHT: Fügen Sie PFA unter einer chemischen Haube hinzu. HINWEIS: Wenn alle Vertiefungen gleichzeitig fixiert sind, 10 Minuten lang mit PFA bei Raumtemperatur inkubieren. Wenn die Vertiefungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert sind, fügen Sie PFA zu den zu fixierenden Vertiefungen hinzu und lassen Sie die Platte 5 Minuten lang bei 37 °C im Inkubator.</li>
	<li>Pipettieren Sie die PFA heraus und fügen Sie PBS für 10 s (0,15 ml/Well) hinzu. Pipettieren Sie das PBS heraus und fügen Sie frisches PBS für 5 Minuten (0,15 ml/Well) hinzu. HINWEIS: Wenn alle Vertiefungen gleichzeitig fixiert sind, inkubieren Sie mit PBS bei Raumtemperatur. Wenn die Vertiefungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert sind, fügen Sie PBS zu den festen Vertiefungen hinzu und lassen Sie die Platte 5 Minuten lang bei 37 °C im Inkubator. Fügen Sie dann 0,4 ml PBS hinzu und bewahren Sie die Platte bis zu 1 Woche im Inkubator auf.</li>
</ol>9. Permeabilisierung und Blockierung
<ol><li>Wenn Sie bereit sind, das PBS zu färben, pipettieren Sie es aus und permeabilisieren Sie es mit 0,5 % TritonX 100 in PBS (0,15 ml/Well) für 8 Minuten. Pipettieren Sie den TritonX 100, spülen Sie ihn 10 s lang (0,15 ml/Well) mit PBS, pipettieren Sie den PBS heraus und waschen Sie ihn 5 Minuten lang mit PBS (0,15 ml/Well).</li>
	<li>Block mit 5% IgG-freiem BSA in PBS für 30-60 min (0,15 ml/Well).</li>
</ol>10. Färbung
<ol><li>Pipettieren Sie die BSA heraus und fügen Sie die primäre Antikörpermischung in PBS verdünnt (0,15 ml/Well) hinzu (siehe Materialtabelle; Verdünnungen: Anti-CD31 1:100, Anti-FOSB 1:200, Anti-GFP 1:1.000, Anti-KI67 1:1.000, Anti-MyHC 1:400, Anti-MYOD 1:200, Anti-MYOG 1:150, Anti-PAX7 1:100, Anti-PDGFRa 1:50) für die nächtliche Inkubation bei 4 °C. HINWEIS: Nach der Antikörperinkubation die Antikörpermischung auffangen, Natriumazid hinzufügen und bei 4 °C oder −20 °C (gemäß den Anweisungen des Antikörperherstellers) für die zukünftige Wiederverwendung aufbewahren.</li>
	<li>Pipettieren Sie die Antikörpermischung heraus, spülen Sie sie 10 s lang mit PBS (0,15 ml/Well), pipettieren Sie die PBS heraus und waschen Sie sie 5 Minuten lang mit PBS (0,15 ml/Well).</li>
	<li>Pipettieren Sie das Wasch-PBS heraus, fügen Sie die sekundäre Antikörpermischung (Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 488, Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555, Ziegen-Anti-Ratten-Alexa Fluor 647, Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 555, Ziegen-Anti-Huhn Alexa Fluor 488, alle in Verdünnungen von 1:500-1.000 verwendet) und Zellmarker (z. B. DAPI) in PBS (0,15 ml/Well) verdünnt hinzu (siehe Materialtabelle), und 1 h bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren.</li>
	<li>Pipettieren Sie die sekundäre Antikörpermischung, spülen Sie sie 10 s lang (0,15 ml/Well) mit PBS ab, pipettieren Sie die PBS, waschen Sie sie 5 Minuten lang mit PBS (0,15 ml/Well), pipettieren Sie die PBS heraus und montieren Sie sie. HINWEIS: Wenn 8-Well-Platten mit abnehmbaren Separatoren verwendet werden, ziehen Sie die Separatoren vor der Montage ab.</li>
</ol>

Gewinnung von Skelettmuskeln der Maus zur Kultivierung von Stammzellen und ihrer Nische

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<li>Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+macrophage+conditioned-medium+on+murine+and+human+muscle+cells%3A+analysis+of+proliferation%2C+differentiation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).</li>
<li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).</li>
<li>Tabula Muris Consortium et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern+surface+improves+cultured+human+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 12(2021).</li>
<li>Denes, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+C2C12+myotubes+on+micromolded+gelatin+hydrogels+accelerates+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 9 (1), 17(2019).</li>
<li>LaFramboise, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+muscle+origin+and+phenotype+on+satellite+cell+muscle-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).</li>
<li>Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+potential+of+Pax3%2FPax7+on+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Generic+Engineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury.</a> Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143(2022).</li>
<li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+injury+models+for+studying+muscle+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die Funktion der Skelettmuskulatur bei Erwachsenen wird durch eine fein orchestrierte Reihe von zellulären Interaktionen und molekularen Signalen untermauert. Hier wird eine Methode vorgestellt, die es ermöglicht, diese Parameter in einer ex vivo Umgebung zu untersuchen, die der physiologischen Mikroumgebung sehr ähnlich ist.
Mehrere Gruppen haben über In-vitro-Methoden zur Kultivierung myogener Zellen berichtet. Diese Methoden zielten darauf ab, Satellitenzellen zu isolieren...

Bewegung, Atmung, Stoffwechsel, Körperhaltung und Aufrechterhaltung der Körpertemperatur hängen alle von der Skelettmuskulatur ab, und Fehlfunktionen in der Skelettmuskulatur können daher schwächende Pathologien (d. h. Myopathien, Muskeldystrophien usw.) verursachen. 1. Aufgrund seiner wesentlichen Funktionen und seines Überflusses hat die Skelettmuskulatur die Aufmerksamkeit von Forschungslabors weltweit auf sich gezogen, die sich bemühen, die Schlüsselaspekte zu verstehen, die eine normale Muskelfunktion unterstützen und als therapeutische Ziele dienen können. Darüber hinaus ist die Skelettmuskulatur ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der Regeneration und Stammzellfunktion, da sich ein gesunder Muskel nach einer vollständigen Verletzung und Degeneration vollständig selbst reparieren kann, hauptsächlich aufgrund seiner ansässigen Stammzellen2; Diese werden auch Satellitenzellen genannt und sind unter der Basallamina in der Peripherie der Muskelfasern lokalisiert3.
Die Kernzellen der adulten Skelettmuskulatur sind die Myofasern (lange synzytiale multinukleäre Zellen) und die Satellitenzellen (Stammzellen mit myogenem Potenzial, die ruhen, bis eine Verletzung sie aktiviert). Die letztgenannten Zellen sind die zentralen Zellen der Muskelregeneration, und dieser Prozess kann in ihrer Abwesenheit nicht stattfinden 4,5,6,7. In ihrer unmittelbaren Mikroumgebung gibt es mehrere Zelltypen und molekulare Faktoren, die ihnen Signale geben. Diese Nische etabliert sich allmählich im Laufe der Entwicklung und bis ins Erwachsenenalter8. Der adulte Muskel enthält mehrere Zelltypen (Endothelzellen, Perizyten, Makrophagen, fibroadipogene Vorläuferzellen (FAPs), regulatorische T-Zellen usw.) 9,10 und extrazelluläre Matrixkomponenten (Laminine, Kollagene, Fibronektin, Fibrilline, Periostin, etc.) 11, die miteinander und mit den Satellitenzellen im Kontext von Gesundheit, Krankheit und Regeneration interagieren.
Die Bewahrung dieser komplexen Nische in experimentellen Umgebungen ist grundlegend, aber auch eine Herausforderung. Ebenso schwierig ist es, die Ruhe aufrechtzuerhalten oder wieder herzustellen, ein Zellzustand, der für Satellitenzellen kritisch ist9. Es wurden mehrere Methoden eingeführt, um diese Herausforderungen teilweise zu bewältigen, jede mit ihren Vor- und Nachteilen (ausführlich im Diskussionsabschnitt). Hier wird eine Methode vorgestellt, die diese beiden Barrieren teilweise überwinden kann. Muskeln werden zunächst entnommen und dann mechanisch und enzymatisch abgebaut, bevor die heterogene Zellmischung in Kultur gegeben wird. Im Verlauf der Kultur werden viele Zelltypen der Nische nachgewiesen und Satellitenzellen beobachtet, die in den Ruhezustand zurückgekehrt sind. Als letzter Schritt des Protokolls werden die Immunfluoreszenzschritte vorgestellt, die den Nachweis jedes Zelltyps durch die Verwendung allgemein anerkannter Marker ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD</td><td>550274</td><td>Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Anti-FOSB</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7203</td><td>Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>Verdünnung 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20-c</td><td>Verdünnung 1:400</td></tr><tr><td>Anti-MYOD</td><td>Active Motif</td><td>39991</td><td>Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>anti-MYOG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-576</td><td>Verdünnung 1:150</td></tr><tr><td>anti-Pax7</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81648</td><td>Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>anti-PDGFR&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-16571</td><td>Verdünnung 1:50</td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>Konzentration 4 ng/ml</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) &ndash; zur Verdauung verwendet&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-1006</td><td>Konzentration 0,2%</td></tr><tr><td>BSA IgG-frei, proteasefrei &ndash; zur Färbung verwendet</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>Konzentration 5%</td></tr><tr><td>Zellsieb 40 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 70 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 100 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td>Konzentration 0,5 U/ml</td></tr><tr><td>Kulturplatte</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.802</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Euromedex</td><td>UD8050-05-A</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Konzentration 3 U/ml</td></tr><tr><td>Präparierzange Größe 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Sezierzange Größe 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschere (groß, gerade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>9146-11</td><td>ideal zum Zerkleinern</td></tr><tr><td>Präparierschere (klein, gebogen)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15017-10</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschere (klein, gerade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>EdU Click-iT Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum &ndash; Option 1</td><td>Eurobio</td><td>CVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum &ndash; Option 2</td><td>Gibco</td><td>10270-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Life Sciences</td><td></td><td>354234 Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Dominique Dutscher</td><td>090261</td><td>flexible Folie</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd &ndash; Option 1</td><td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td><td>211511.1209</td><td>Konzentration 4%</td></tr><tr><td>Paraformaldeyde &ndash; Option 2</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td>Konzentration 4%</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad</td><td>ThermoFisher</td><td>TSSWB27</td><td></td></tr><tr><td>TritonX100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8532-500 ML</td><td>Konzentration 0,5%</td></tr><tr><td>Wildtyp-Mäuse</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6NRj</td><td></td></tr></tbody></table>

unfraktionierte massenkultur des mausskelettmuskels zur rekapitulation der nischen- und stammzellruhe

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

Der Skelettmuskel ist das größte Gewebe des Körpers und erfüllt mehrere Funktionen, von der Fortbewegung bis zur Kontrolle der Körpertemperatur. Seine Funktionalität und Genesung nach Verletzungen hängt von einer Vielzahl von Zelltypen und von molekularen Signalen zwischen den Kernmuskelzellen (Myofasern, Muskelstammzellen) und ihrer Nische ab. Die meisten Versuchsumgebungen bewahren diese komplexe physiologische Mikroumgebung nicht, und sie erlauben auch nicht die Ex-vivo-Untersuchung von Muskelstammzellen in Ruhezustand, einem Zellzustand, der für sie entscheidend ist. Hier wird ein Protokoll für die ex vivo Kultur von Muskelstammzellen mit zellulären Komponenten ihrer Nische skizziert. Durch den mechanischen und enzymatischen Abbau von Muskeln erhält man eine Mischung von Zelltypen, die in eine 2D-Kultur gegeben wird. Die Immunfärbung zeigt, dass innerhalb von 1 Woche mehrere Nischenzellen in Kultur neben Myofasern und vor allem Pax7-positiven Zellen vorhanden sind, die die Eigenschaften ruhender Muskelstammzellen aufweisen. Diese einzigartigen Eigenschaften machen dieses Protokoll zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Zellamplifikation und die Erzeugung von ruhenden Stammzellen, die zur Beantwortung grundlegender und translationaler Fragen verwendet werden können.

Dieses Protokoll ermöglicht die Kultivierung von Muskelzellen, während die Satellitenzellen und die meisten Zellen aus ihrer endogenen Nische geschützt werden. Abbildung 2 fasst die wichtigsten Schritte des Protokolls zusammen, während wesentliche Teile der Dissektion und des Aufschlusses in Abbildung 1 dargestellt sind. Eine Dissektion der Muskulatur der Hintergliedmaßen wird empfohlen (Abbildung 1A-C</stro...

Die Skelettmuskulatur besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich residenter Stammzellen, von denen jede einen besonderen Beitrag zur Muskelhomöostase und -regeneration leistet. Hier werden die 2D-Kultur von Muskelstammzellen und die Muskelzellnische in einer ex vivo Umgebung beschrieben, die viele der physiologischen, in vivo und Umwelteigenschaften bewahrt.

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

Unsere Forschung umfasst die Untersuchung gesunder und kranker Skelettmuskeln mit besonderem Schwerpunkt auf den Satellitenzellen. Einer der grundlegenden Aspekte, die wir untersuchen, ist die Identifizierung von transkriptionellen Enhancern, die die zellspezifische Genexpression koordinieren. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Schnelltests zur Bestimmung der Spezifität durchzuführen.Im Bereich der Skelettmuskelforschung werden häufig Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierungsansätze verwendet, um verschiedene Zellpopulationen in Homöostase, Regeneration und Krankheit zu untersuchen. Außerdem könnten Satellitenzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert und kultiviert werden, um Hypothesen zu testen und die Sequenzierungsergebnisse zu validieren. Die Untersuchung von Satellitenzellen in vitro stellt eine große Herausforderung dar.Jüngste Studien haben die Rolle von Satellitenzellen in ihrer Physiologie hervorgehoben. Während es üblich ist, FACS-isolierte Satellitenzellen zu kultivieren, muss die Replikation der Satellitenzellnische in vitro noch erreicht werden. Unser Protokoll bietet eine effiziente und praktische Methode zur Kultivierung des gesamten Muskelgewebes, einschließlich nicht-myogener Zellen wie Endothelzellen und fibroöprogenetischen Vorläuferzellen.Wir konnten zeigen, dass ruhende Zellen innerhalb einer Woche nach der Kultivierung auftreten. Dieses Protokoll könnte auch verwendet werden, um den Einfluss zu untersuchen, den andere Zellen auf die Wiederherstellung dieses ruheähnlichen Pools haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Myoblaste sind proliferierende Vorläuferzellen, die sich unterscheiden, um polynukleierte Myotuben und schließlich Skelettmuskelmyofien zu bilden. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultur von primären Myoblasten von jungen erwachsenen Mausskelettmuskeln vor. Die Methode ermöglicht molekulare, genetische und metabolische Studien von Muskelzellen in der Kultur.

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.

FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Muskelstammzellen und fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus einzelnen Skelettmuskeln bei Mäusen. Das Protokoll umfasst die Dissektion einzelner Muskeln, die Isolierung von Stammzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die Reinheitsbewertung durch Immunfluoreszenzfärbung und die quantitative Messung des S-Phaseneintritts mittels 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin-Inkorporationsassay.

Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein kostengünstiges Verfahren zur Reinigung, Erweiterung und Charakterisierung von hochhomogenen mesenchymalen Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks von Mäusen. Dieser Ansatz ermöglicht die Gewinnung großer Mengen von BMSCs mit hohem Proliferations- und Differenzierungspotenzial, unterstützt Mausmodelle und fördert die präklinische Forschung.

Aufreinigung, Expansion und durchflusszytometrische Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Erfahren Sie die Kultur von Maus-Skelettmuskelgewebe zur Untersuchung von Satellitenzellen und deren Nische. Diese Methode ermöglicht die Analyse quieszenter Zellen und unterstützt die Muskelforschung.

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

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