Name: Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen in Hefe. Diese Technik ermöglicht die Analyse von CQD1-vermittelten Kontaktstellen und liefert Einblicke in die Architektur mitochondrialer Membranen sowie die Bildung von Cristae.

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Das M.E.H. bedankt sich bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), Projektnummer 413985647, für die finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians-Universität München, für seine großzügige und umfangreiche Unterstützung. Wir danken Walter Neupert für seinen wissenschaftlichen Input, seine hilfreichen Diskussionen und seine kontinuierliche Inspiration. J.F. bedankt sich bei der Graduate School Life Science Munich (LSM) für die Unterstützung.

1. Puffer und Vorratslösungen
<ol><li>Stellen Sie eine 1 M große 3-Morpholinopropan-1-sulfonsäure (MOPS)-Lösung in deionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 7,4 her. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in deionisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 8,0 vor. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 2,4 M Sorbit in deionisiertem Wasser vor. Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>2,5 M Saccharose in entionisiertem Wasser zubereiten. Nach dem Autoklavieren bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 200 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in Isopropanol vor. Bei −20 °C lagern. VORSICHT: PMSF ist beim Verschlucken giftig und verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden. Atmen Sie den Staub nicht ein und tragen Sie Schutzhandschuhe und Schutzbrille.</li>
	<li>Bereiten Sie 72%ige Trichloressigsäure (TCA) in deionisiertem Wasser vor. Bei 4 °C lagern. VORSICHT: TCA kann Atemwegsreizungen, schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Atmen Sie den Staub nicht ein und tragen Sie Schutzhandschuhe und Schutzbrille.</li>
	<li>Bereiten Sie den SM-Puffer vor: 20 mM MOPS und 0,6 M Sorbit, pH 7,4.</li>
	<li>Bereiten Sie den Quellpuffer vor: 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF und Proteaseinhibitor-Cocktail, pH 7,4.</li>
	<li>Bereiten Sie die Saccharose-Gradientenpuffer vor: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M und 1,3 M Saccharose in 20 mM MOPS und 0,5 mM EDTA, pH 7,4. HINWEIS: Alle Puffer können bei 4 °C gelagert werden. Es wird jedoch empfohlen, die saccharosehaltigen Puffer bei −20 °C zu lagern, um Pilzwachstum zu vermeiden. Die Proteasehemmer müssen vor der Anwendung frisch zugegeben werden.</li>
</ol>2. Generierung von submitochondrialen Vesikeln
<ol><li>Isolieren Sie rohe Hefe-Mitochondrien frisch gemäß den festgelegten Protokollen34,35. HINWEIS: Für dieses Experiment wurden Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae isoliert. Die Erzeugung von gradientenreinen Mitochondrien ohne andere Organellen ist nicht notwendig.</li>
	<li>Resuspendieren Sie 10 mg frisch isolierte Mitochondrien in 1,6 ml SM-Puffer (4 °C) durch Pipettieren (Abbildung 2, Schritt 1).</li>
	<li>Die mitochondriale Suspension wird in einen vorgekühlten 100-ml-Erlenmeyerkolben überführt.</li>
	<li>Fügen Sie langsam 16 ml Quellpuffer mit einer 20-ml-Glaspipette hinzu. Während der Zugabe auf dem Eis ständig leicht umrühren. Diese osmotische Behandlung führt zu einer Wasseraufnahme in den Matrixraum. Die Schwellung der mitochondrialen Innenmembran stört die Außenmembran. Beide Membranen bleiben jedoch an den Kontaktstellen9 in Kontakt (Abbildung 2, Schritt 2).</li>
	<li>Die Proben werden unter konstantem leichtem Rühren 30 min auf Eis inkubiert.</li>
	<li>Langsam 5 ml 2,5 M Saccharoselösung mit einer 5 ml Glaspipette zugeben, um die Saccharosekonzentration in den Proben auf ca. 0,55 M zu erhöhen. Diese osmotische Behandlung führt zu einem Wasseraustritt aus der Matrix36. Durch die Schrumpfung der inneren Membran soll der Abstand zu den verbleibenden Fragmenten der äußeren Membran maximiert werden. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, künstliche Hybridvesikel aus inneren und äußeren Membranen durch Beschallung zu erzeugen (Abbildung 2, Schritt 3).</li>
	<li>Die Proben werden unter leichtem Rühren 15 min auf Eis inkubiert.</li>
	<li>Unterziehen Sie die Mitochondrien einer Beschallung, um submitochondriale Membranvesikel zu erzeugen (Abbildung 2, Schritt 4).<ol><li>Die mitochondriale Suspension wird in eine vorgekühlte Rosettenzelle überführt.</li>
		<li>Die mitochondriale Suspension wird 30 s lang mit einer Amplitude von 10 % beschallt, während die Rosettenzelle in einem Eisbad gekühlt wird.</li>
		<li>Lassen Sie die Suspension 30 s in einem Eisbad ruhen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.8.2 und Schritt 2.8.3 noch dreimal. HINWEIS: Die Beschallungsbedingungen variieren je nach verwendetem Beschallungsgerät. Für einzelne Maschinen wird eine Optimierung notwendig sein. Eine zu harte Beschallung führt zur künstlichen Bildung von Vesikel, die aus mitochondrialen inneren und äußeren Membranen bestehen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Trennung der submitochondrialen Vesikel
<ol><li>Trennen Sie die erzeugten Vesikel von den verbleibenden intakten Mitochondrien durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 20 min bei 4 °C. Die intakten Mitochondrien werden pelletiert, während die Vesikel im Überstand bleiben.</li>
	<li>Konzentrieren Sie die Vesikelmischung.<ol><li>Den Überstand in frische Ultrazentrifugationsröhrchen überführen.</li>
		<li>Geben Sie ein Kissen von 0,3 ml 2,5 M Saccharoselösung mit einer 1-ml-Spritze mit einer Kanüle von 0,8 mm x 120 mm auf den Boden des Röhrchens.</li>
		<li>Bei 118.000 x g für 100 min bei 4 °C zentrifugieren. HINWEIS: Hier wurde ein Ausschwingrotor mit einem maximalen Radius von 153,1 mm verwendet. Die Zentrifugationsbedingungen hängen stark vom Rotor ab und müssen angepasst werden, wenn ein anderer Rotor verwendet wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Vesikel erscheinen nach der Zentrifugation als Scheibe auf der Oberseite des Saccharosekissens. Verwerfen Sie ca. 90 % des Überstandes. Ernten Sie nun die konzentrierten Vesikel, indem Sie sie in den verbleibenden Puffer einschließlich der 2,5 M Saccharose resuspendieren, indem Sie sie auf und ab pipettieren. Die Suspension in einen eiskalten Dounce-Homogenisator überführen.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Suspension mit mindestens 10 Hüben unter Verwendung eines Polytetrafluorethylen-Töpfers.</li>
	<li>Bereiten Sie den Saccharosegradienten vor.<ol><li>Für einen 11-ml-Stufengradienten mit fünf Stufen (1,3 m, 1,13 m, 1,02 m, 0,96 m und 0,8 M Saccharose in 20 mM MOPS und 0,5 mM EDTA, pH 7,4) enthält jede Schicht 2,2 ml Saccharoselösung. HINWEIS: Ein Refraktometer wird empfohlen, um die Saccharosekonzentrationen zu messen und einzustellen. Es ist jedoch nicht unbedingt erforderlich. Tragen Sie 10 μl des Puffers auf das Refraktometer auf und erfassen Sie die entsprechenden Brechungsindizes. Die Berechnung der Saccharosekonzentration erfolgt wie folgt: <img alt="Saccharosekonzentrationsgleichung in Molarität; Diagramm für die Analyse der Brechungsindexmessung." src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 1,3333 steht für den Brechungsindex von Wasser. 0,048403 ist ein saccharosespezifischer Umrechnungsindex, der aus der linearen Skalierung der molaren Brechung zur Saccharosekonzentration in wässrigen Lösungen 37 erhalten wird.</li>
		<li>Geben Sie die höchste Saccharosekonzentration in das Zentrifugationsröhrchen und stellen Sie das Röhrchen auf −20 °C. Warten Sie, bis die Schicht vollständig gefroren ist, bevor Sie die nächste auftragen. Gehen Sie entsprechend vor, bis die letzte Schicht hinzugefügt ist, und lagern Sie die Farbverläufe bei −20 °C. HINWEIS: Denken Sie daran, die eingefrorenen Farbverläufe beim Starten des Experiments auf 4 °C zu übertragen, damit die Farbverläufe auftauen können. Dies dauert ca. 3 Stunden. Für die Zentrifugation wurde hier ein Ausschwingrotor mit einem Fassungsvermögen von 13,2 mL verwendet. Bei Verwendung eines anderen Rotors müssen die Gradientenstufenvolumina entsprechend angepasst werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Messen Sie die Saccharosekonzentration der Proben mit einem Refraktometer. Wenn kein Zugang zu einem Refraktometer vorhanden ist, könnte man alternativ davon ausgehen, dass die Saccharosekonzentration 2 M beträgt. Diese vermeintliche Saccharosekonzentration wird dann die Grundlage für den nächsten Schritt sein.</li>
	<li>Stellen Sie die Saccharosekonzentration auf 0,6 M ein, indem Sie eine geeignete Menge von 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF und Protease-Inhibitor-Cocktail mit einem pH-Wert von 7,4 hinzufügen. Wenn die Saccharosekonzentration nicht gemessen, sondern mit 2 M geschätzt wird, empfiehlt es sich zu prüfen, ob die Konzentration nach der Einstellung niedrig genug ist. Ein kleines Aliquot der Probe (ca. 50 μl) wird auf 200 μl 0,8 M Saccharose in ein Reagenzglas gegeben. Die Probe muss auf der 0,8 M Saccharose bleiben.</li>
	<li>Laden Sie die Proben (ca. 1 ml) auf den Saccharosegradienten (bewahren Sie 10 % für eine spätere Referenz auf). Sorgfältiges Pipettieren ist wichtig, um eine Störung des Gradienten zu vermeiden (Abbildung 2, Schritt 5).</li>
	<li>Die Vesikel werden durch Zentrifugation bei 200.000 x g und 4 °C für 12 h getrennt. Stellen Sie die Zentrifuge nach Möglichkeit auf langsame Beschleunigung und Verzögerung ein, um die Störung des Gefälles zu vermeiden (Abbildung 2, Schritt 6). HINWEIS: Hier wurde ein Ausschwingrotor mit einem maximalen Radius von 153,1 mm verwendet. Die Zentrifugationsbedingungen hängen stark vom Rotor ab und müssen angepasst werden, wenn ein anderer Rotor verwendet wird.</li>
	<li>Ernten Sie den Gradienten von oben nach unten in 700-μl-Fraktionen mit einer 1-ml-Pipette. Dies führt zu 17 Brüchen, was eine ausreichende Auflösung ermöglicht.</li>
</ol>4. Analyse der submitochondrialen Vesikel
<ol><li>Konzentrieren Sie die Proteine, indem Sie jede Fraktion zwei sequentiell durchgeführten TCA-Fällungen38 unterziehen, um die SDS-PAGE-Proben vorzubereiten.<ol><li>200 μl 72%ige TCA zu den einzelnen Fraktionen geben und mischen, bis die Lösung homogen ist. Die Fraktionen werden 30 min auf Eis inkubiert und die gefällten Proteine durch Zentrifugation bei 20.000 x g und 4 °C für 20 min pelletiert. Den Überstand verwerfen, 500 μl 28 %ige TCA-Lösung hinzufügen, gut mischen und den Zentrifugationsschritt wiederholen.</li>
		<li>Die Pellets werden mit 1 ml Aceton (−20 °C) gewaschen und 10 Minuten lang bei 20.000 x g und 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen. Resuspendieren Sie die Pellets in 60 μl SDS-Probenpuffer und inkubieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei 95 °C. HINWEIS: Nach dem ersten TCA-Niederschlag verbleibt eine große Menge an Saccharose, insbesondere in den Fraktionen mit hoher Dichte. Diese wird durch den zusätzlichen TCA-Niederschlag entfernt.</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie 20 μl jeder Fraktion mittels SDS-PAGE39 und Immunoblotting40,41,42,43.</li>
</ol>

Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die mitochondriale Subfraktionierung ist ein kompliziertes Experiment mit mehreren hochkomplexen Schritten. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, unsere etablierte Methode32 weiter zu verbessern und bis zu einem gewissen Grad zu vereinfachen. Die Herausforderungen lagen hier in der Anforderung an komplizierten und hochspezialisierten Geräten, bei denen es sich oft um Einzelkonstruktionen handelt, sowie dem enormen Zeit- und Energieverbrauch. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die Pumpen und Einze...

Mitochondrien erfüllen in Eukaryoten eine Vielzahl unterschiedlicher Funktionen, wobei die bekannteste die Produktion von ATP durch oxidative Phosphorylierung ist. Weitere Funktionen sind die Produktion von Eisen-Schwefel-Clustern, die Lipidsynthese und in höheren Eukaryoten die Ca2+-Signalgebung und die Induktion der Apoptose 1,2,3,4. Diese Funktionen sind untrennbar mit ihrer komplexen Ultrastruktur verbunden.
Die mitochondriale Ultrastruktur wurde erstmals mittels Elektronenmikroskopie5 beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass Mitochondrien ziemlich komplexe Organellen sind, die aus zwei Membranen bestehen: der mitochondrialen Außenmembran und der mitochondrialen Innenmembran. Somit werden von diesen Membranen zwei wässrige Kompartimente gebildet: der Intermembranraum und die Matrix. Die mitochondriale Innenmembran kann noch weiter in verschiedene Abschnitte unterteilt werden. Die innere Grenzmembran bleibt in unmittelbarer Nähe zur äußeren Membran, und die Cristae bilden Einstülpungen. Sogenannte Crista Junctions verbinden die innere Grenzmembran mit den Cristae (Abbildung 1). Darüber hinaus zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen osmotisch geschrumpfter Mitochondrien, dass es Stellen gibt, an denen die Mitochondrienmembranen fest miteinander verbunden sind 6,7. Diese sogenannten Kontaktstellen werden von Proteinkomplexen gebildet, die die beiden Membranen überspannen (Abbildung 1). Es wird angenommen, dass diese Interaktionsstellen aufgrund ihrer Bedeutung für die Regulierung der mitochondrialen Dynamik und Vererbung sowie für den Transfer von Metaboliten und Signalen zwischen dem Zytosol und der Matrix für die Lebensfähigkeit von Zellen unerlässlich sind8.
Der MICOS-Komplex in der mitochondrialen Innenmembran ist wahrscheinlich der am besten charakterisierte und vielseitigste kontaktstellenbildende Komplex. MICOS wurde 2011 in Hefe beschrieben und besteht aus sechs Untereinheiten 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 und Mic10. Diese bilden einen Komplex von ca. 1,5 MDa, der an den Crista-Kontakten 9,10,11 lokalisiert ist. Die Deletion einer der beiden Kernuntereinheiten, Mic10 oder Mic60, führt zum Fehlen dieses Komplexes 9,11, was bedeutet, dass diese beiden Untereinheiten für die Stabilität von MICOS essentiell sind. Interessanterweise bildet MICOS nicht nur eine, sondern mehrere Kontaktstellen mit verschiedenen mitochondrialen äußeren Membranproteinen und -komplexen: dem TOM-Komplex 11,12, dem TOB/SAM-Komplex 9,12,13,14,15,16, dem Fzo1-Ugo1-Komplex9,Por1 10, OM45 10 und Miro 17. Dies deutet stark darauf hin, dass der MICOS-Komplex an verschiedenen mitochondrialen Prozessen beteiligt ist, wie z. B. dem Proteinimport, dem Phospholipidstoffwechsel und der Bildung der mitochondrialen Ultrastruktur18. Die letztgenannte Funktion ist wahrscheinlich die Hauptfunktion von MICOS, da das Fehlen des MICOS-Komplexes, der durch die Deletion von MIC10 oder MIC60 induziert wird, zu einer abnormen mitochondrialen Ultrastruktur führt, der es praktisch vollständig an regelmäßigen Cristae mangelt. Stattdessen akkumulieren interne Membranvesikel ohne Verbindung zur inneren Grenzmembran19, 20. Wichtig ist, dass MICOS in Form und Funktion von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist21. Die Assoziation von Mutationen in MICOS-Untereinheiten mit schweren menschlichen Erkrankungen unterstreicht auch seine Bedeutung für höhere Eukaryoten22,23. Obwohl MICOS sehr vielseitig ist, müssen zusätzliche Kontaktstellen vorhanden sein (basierend auf unseren unveröffentlichten Beobachtungen). In der Tat wurden mehrere andere Kontaktstellen identifiziert, zum Beispiel die mitochondrialen Fusionsmaschinen Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 oder Mdm31-Por1, das an der Biosynthese des mitochondrial-spezifischen Phospholipids Cardiolipin beteiligt ist 27. Kürzlich haben wir die Methode, die uns zur Identifizierung von MICOS führte, verbessert, um Cqd1 als Teil einer neuartigen Kontaktstelle zu identifizieren, die mit dem äußeren Membrankomplex Por1-Om1428 gebildet wurde. Interessanterweise scheint diese Kontaktstelle auch an mehreren Prozessen wie der Homöostase der mitochondrialen Membran, dem Phospholipidstoffwechsel und der Verteilung von Coenzym Q28,29 beteiligt zu sein.
Hier haben wir eine Variation der zuvor beschriebenen Fraktionierung der Mitochondrien 9,30,31,32,33 verwendet. Die osmotische Behandlung von Mitochondrien führt zur Störung der mitochondrialen Außenmembran und zu einer Schrumpfung des Matrixraums, so dass die beiden Membranen nur noch an Kontaktstellen in unmittelbarer Nähe sind. Dies ermöglicht die Erzeugung von Vesikel, die ausschließlich aus der mitochondrialen Außenmembran oder der mitochondrialen Innenmembran bestehen oder an Kontaktstellen beider Membranen durch milde Beschallung enthalten. Da die mitochondriale Innenmembran ein viel höheres Protein-zu-Lipid-Verhältnis aufweist, weisen mitochondriale Innenmembranvesikel im Vergleich zu mitochondrialen Außenmembranvesikeln eine höhere Dichte auf. Der Dichteunterschied kann genutzt werden, um die Membranvesikel durch Saccharose-Auftriebsdichtegradientenzentrifugation zu trennen. So akkumulieren die mitochondrialen äußeren Membranvesikel bei niedrigen Saccharosekonzentrationen, während die mitochondrialen inneren Membranvesikel bei hohen Saccharosekonzentrationen angereichert sind. Die Vesikel, die Kontaktstellen enthalten, konzentrieren sich bei mittleren Saccharosekonzentrationen (Abbildung 2). Das folgende Protokoll beschreibt diese verbesserte Methode, die im Vergleich zu unserer zuvor etablierten Methode32 weniger spezialisierte Ausrüstung, Zeit und Energie erfordert, im Detail und bietet ein nützliches Werkzeug zur Identifizierung möglicher Proteine an der Kontaktstelle.

<table><tbody><tr><td>13,2 mL, Dünnwandiges Ultra-Clear-Rohr mit offenem Deckel, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Instruments, Deutschland</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml, Dickwandiges Rohr aus Polycarbonat mit offenem Deckel, 29 x 104 mm</td><td>Beckman Instruments, Deutschland</td><td>363647</td><td></td></tr><tr><td>A-25.50 Festwinkelrotor - Aluminium, 8 x 50 ml, 25.000 U/min, 75.600 x g</td><td>Beckman Instruments, Deutschland</td><td>363055</td> Abbe-Refraktometer <td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss, Deutschland</td><td></td><td>eingestellt, jedes Abbe-Refraktometer kann verwendet werden</td></tr><tr><td>accu-jet pro Pipettierhilfe</td><td>Brandtech, USA</td><td>BR26320</td><td>eingestellt, jede Pipettierhilfe reicht aus</td></tr><tr><td>Becher 1000 mL</td><td>DWK Life Science, Deutschland</td><td>C118.1</td><td></td></tr><tr><td>Branson&nbsp; Digitaler Sonifikator W-250 D</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>FIS15-338-125</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultraschall 3mm TAPERED MICROTIP</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 200- und 400-Watt-Sonifikatoren: Rosettenkühlzelle</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>15-338-70</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Avanti JXN-26</td><td>Beckman Instruments, Deutschland</td><td>B37912</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Optima XPN-100 ultra</td><td>Beckman Instruments, Deutschland</td><td>8043-30-0031</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td><td>Roche, Schweiz</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Roth, Deutschland</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamin-tetraessigsäure Dinatriumsalz-Dihydrat)</td><td>Roth, Deutschland</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben, 100 mL</td><td>Roth, Deutschland</td><td>X747.1</td><td></td></tr><tr><td>Messpipette, Kl. B, 25:0, 0.1</td><td>Hirschmann, Deutschland</td><td>1180170</td><td></td></tr><tr><td>Messpipette, Kl. B, 5:0, 0.05</td><td>Hirschmann, Deutschland</td><td>1180153</td><td></td></tr><tr><td>Eisbad</td><td>neoLab, Deutschland</td><td>&nbsp; S12651</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer RCT basic</td><td>IKA-Werke GmbH, Deutschland</td><td>Z645060GB-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (3-(N-Morpholino)propansulfonsäure)</td><td>Gerbu, Deutschland</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P1000</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10006S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P20</td><td>Gilson, USA</td><td>FP10003S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P200</td><td>Gilson, USA</td><td></td><td></td>FP10005S</tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>Braun, Deutschland</td><td>4022495251879</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Serva, Deutschland</td><td>32395.03</td><td></td></tr><tr><td>STERICAN Kanüle 21 Gx4 4/5 0,8x120 mm</td><td>Braun, Deutschland</td><td>4022495052414</td><td></td></tr><tr><td>Rührstab, 15 mm</td><td>VWR, USA</td><td>442-0366</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck, Deutschland</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Schwingschaufelrotor</td><td>Beckman Instruments, Deutschland</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzgläser</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Gewebeschleifer, Typ Potter-Elvehjem, 2 mL Glasgefäß</td><td>VWR, USA</td><td>432-0200</td><td></td></tr><tr><td>Gewebeschleifer, Typ Potter-Elvehjem, 2 ml Kolben mit gezackter Spitze</td><td>VWR, USA</td><td>432-0212</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure ( TCA)</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland</td><td>33731</td><td>eingestellt, jede TCA genügt (CAS: 73-03-9)</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Deutschland</td><td>4855</td><td></td></tr></tbody></table>

eine verbesserte methode zur isolierung mitochondrialer kontaktstellen

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondrien sind in praktisch allen eukaryotischen Zellen vorhanden und erfüllen essentielle Funktionen, die weit über die Energiegewinnung hinausgehen, z. B. die Synthese von Eisen-Schwefel-Clustern, Lipiden oder Proteinen, die Ca2+ -Pufferung und die Induktion von Apoptose. Ebenso führt eine mitochondriale Dysfunktion zu schweren menschlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Neurodegeneration. Um diese Funktionen erfüllen zu können, müssen die Mitochondrien über ihre Hülle, die aus zwei Membranen besteht, mit dem Rest der Zelle kommunizieren. Daher müssen diese beiden Membranen ständig miteinander interagieren. Proteinhaltige Kontaktstellen zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien sind dabei essentiell. Bisher wurden mehrere Kontaktstellen identifiziert. Bei der hier beschriebenen Methode werden die Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae verwendet, um Kontaktstellen zu isolieren und so Kandidaten zu identifizieren, die für Kontaktstellenproteine in Frage kommen. Wir haben diese Methode verwendet, um den mitochondrialen Kontaktstellen- und Cristae-Organisierungssystem-Komplex (MICOS) zu identifizieren, einen der wichtigsten kontaktstellenbildenden Komplexe in der mitochondrialen Innenmembran, der von der Hefe bis zum Menschen konserviert ist. Kürzlich haben wir diese Methode weiter verbessert, um eine neue Kontaktstelle zu identifizieren, die aus Cqd1 und dem Por1-Om14-Komplex besteht.

Es ist relativ einfach, die innere und äußere Membran der Mitochondrien zu trennen. Die Erzeugung und Trennung von Vesikeln, die Kontaktstellen enthalten, ist jedoch wesentlich schwieriger. Unserer Meinung nach sind zwei Schritte entscheidend und wesentlich: die Beschallungsbedingungen und der verwendete Gradient.
In der Regel wird angenommen, dass lineare Farbverläufe im Vergleich zu Stufengradienten eine bessere Auflösung haben. Ihre reproduzierbare Herstellung ist jedoch langwierig und erfo...

Mitochondriale Kontaktstellen sind Proteinkomplexe, die mit mitochondrialen inneren und äußeren Membranproteinen interagieren. Diese Stellen sind essentiell für die Kommunikation zwischen den mitochondrialen Membranen und damit zwischen dem Zytosol und der mitochondrialen Matrix. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung von Kandidaten, die sich für diese spezifische Klasse von Proteinen qualifizieren.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Unser Ziel ist es, die molekulare Funktion der mitochondrialen Kontaktstellen zu verstehen, die die Kommunikation zwischen den beiden Mitochondrienmembranen ermöglichen. Dies ist tatsächlich eine Voraussetzung, um die Funktion für die mitochondriale Biogenese und damit die Lebensfähigkeit von Zellen zu verstehen. Wir entdeckten eine neue Kontaktstelle zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien, die von Cqd1 und Om14-Por1 gebildet wurde.Unsere Daten deuten darauf hin, dass diese Stelle beim Import von Lipiden wie Phosphatidsäure helfen könnte. Basierend auf der Identifizierung des MICOS-Komplexes trugen wir zu einem tieferen Verständnis bei, wie die mitochondriale Membranarchitektur erzeugt wird. Dies ermöglichte es uns, ein Arbeitsmodell zu entwickeln, das erklärt, wie die beiden Formen der mitochondrialen Cristae, lamelläre und tubuläre Cristae, gebildet werden.Unsere Forschung wurde in der Vergangenheit an Hefe durchgeführt. Wir sind jedoch davon überzeugt, dass die Bildung einer korrekten mitochondrialen Architektur auch für höhere Eukaryoten wichtig ist. Der nächste Schritt in unserer Forschung ist daher die Analyse der Rolle von mitochondrialen Architekturelementen in komplexeren Modellen wie primären Neuronen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein Verfahren zur schnellen Isolierung von Mitochondrien aus Säugergewebebiopsien beschrieben. Rattenleber-oder Skelettmuskelpräparate wurden mit einem kommerziellen Gewebe Dissociator homogenisiert und Mitochondrien wurden durch Differentialfiltration durch Nylon-Mesh-Filter isoliert. Mitochondriale Isolation Zeit &lt;30 min im Vergleich zu 60 bis 100 min mit alternativen Methoden.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine ​​durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Der Vergleich des mitochondrialen Membranpotentials zwischen Proben liefert wertvolle Informationen über den zellulären Status. Detaillierte Schritte zur Isolierung von Mitochondrien und zur Beurteilung des Ansprechens auf Inhibitoren und Entkoppler mittels Fluoreszenz werden beschrieben. Die Methode und der Nutzen dieses Protokolls werden anhand eines Zellkultur- und Tiermodells für zellulären Stress veranschaulicht.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Hier präsentieren wir eine Modifikation einer zuvor berichteten Methode, die die Isolierung von qualitativ hochwertigen und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Verfahren führt zu hochgradig gekoppelten Mitochondrien, die während mikrotiterplattenbasierter Respirometirc-Assays mit hoher Funktion atmen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Da Mitochondrien nur ein kleiner Prozentsatz der Pflanzenzelle sind, benötigen sie für eine Reihe von Studien gereinigt werden. Mitochondrien können aus einer Vielzahl von Pflanzenorganen durch Homogenisierung, gefolgt von Differential und Dichte Gradienten Zentrifugation zu einem hochgereinigten mitochondriale Bruchteil isoliert werden.

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um mitochondriale Superkomplexe zu extrahieren, zu lösen und zu identifizieren, die die Exposition gegenüber Waschmitteln und Coomassie Blue minimieren. Dieses Protokoll bietet ein optimales Gleichgewicht zwischen der Auflösung und der Erhaltung von Enzymaktivitäten und minimiert gleichzeitig das Risiko, labile Wechselwirkungen mit Eiweißprotein zu verlieren.

Hybrid Clear/Blaue Elektrophorese für die Trennung und Analyse von Mitochondrialen Respiratory Chain Supercomplexen

Wir präsentieren ein zweistufiges Protokoll für die qualitativ hochwertige Isolierung von Mitochondrien, das mit der Entdeckung und Quantifizierung von Proteinen auf Proteomebene kompatibel ist. Unser Protokoll kommt ohne Gentechnik aus und eignet sich daher für die Untersuchung von Mitochondrien aus allen primären Zellen und Geweben.

Zweistufige tag-freie Isolierung von Mitochondrien für eine verbesserte Proteinentdeckung und -quantifizierung

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Analyse von respiratorischen Superkomplexen, wenn nur geringe Mengen an Proben zur Verfügung stehen.

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben 

Bioenergetische und metabolomische Studien an Mitochondrien haben ihre facettenreiche Rolle bei vielen Krankheiten gezeigt, aber die Isolierungsmethoden für diese Organellen variieren. Die hier beschriebene Methode ist in der Lage, hochwertige Mitochondrien aus mehreren Gewebequellen zu reinigen. Die Qualität wird durch Atemkontrollverhältnisse und andere Metriken bestimmt, die mit hochauflösender Respirometrie bewertet werden.

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren 

Erfahren Sie eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen in Hefe. Diese Technik ermöglicht die Analyse von CQD1-vermittelten Kontaktstellen und liefert Einblicke in die Architektur mitochondrialer Membranen sowie die Bildung von Cristae.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

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