Name: Transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation von subretinalen Transplantaten in einem retinalen Degenerations-Mausmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Lernen Sie die transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation subretinaler Zellen in einem Mausmodell zur Behandlung retinaler Degeneration. Diese Methode ermöglicht präzise Zelllieferung mit minimalen Komplikationen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde aus folgenden Mitteln finanziert: NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), Shulsky Foundation (MSS), Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (uneingeschränkter Zuschuss an das Wilmer Eye Institute an der Johns Hopkins University und das Cullen Eye Institute am Baylor College of Medicine). Wir danken Dr. Malia Edwards (Johns Hopkins University School of Medicine) für die freundliche Bereitstellung von Schulungen am Mikroskop.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, überarbeitet 1978) und der ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. Alle Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Johns Hopkins University genehmigt (Genehmigung M021M459).
1. Tiere
<ol><li>Verwenden Sie Rho::EGFP-Mäuse (im Alter von P3-P6) als Spender von Netzhautzellsuspensionen. HINWEIS: Diese Sorte war ein freundliches Geschenk von Dr. T. Wensel, Baylor College of Medicine.</li>
	<li>Verwenden Sie OPN1LW-EGFP/NRL-/- Mäuse14 (im Alter von P3) als Spender von Netzhautblättern.</li>
	<li>Verwenden Sie adulte Rd1/NS-Mäuse mit Netzhautdegeneration und Immunschwäche (beiderlei Geschlechts) als Empfänger.</li>
	<li>Unterbringung aller Mäuse in Käfigen unter einem 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Wasser und Futter nach Bedarf.</li>
</ol>2. Sammeln Sie die neuronale Netzhaut (Abbildung 1)
HINWEIS: Alle folgenden Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Lieferanteninformationen zu den Forschungswerkzeugen und -produkten finden Sie in der Materialtabelle.
<ol><li>Vorbereitung von Spendermäusen: Euthanasie von Spendermäusen mit einer Überdosis Kohlendioxid und Bestätigung der Euthanasie mit Gebärmutterhalsluxation.</li>
	<li>Isolieren Sie die Augäpfel von Mäusen. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.<ol><li>Öffnen Sie vorsichtig die Augenlider der Welpen mit einer Mikroschere, um den Augapfel freizulegen.</li>
		<li>Greife mit einer glatten Pinzette den Sehnerv und ziehe den Augapfel mit einer Pinzette heraus.</li>
	</ol></li>
	<li>Neurale Netzhaut isolieren HINWEIS: Dieser Schritt wird unter einem Präpariermikroskop durchgeführt.<ol><li>Schneiden Sie mit einer sterilen 25-G-Nadel ein Loch in die Mitte der Hornhaut.</li>
		<li>Schneiden Sie die Hornhaut durch das Loch in zwei Hälften und vergrößern Sie den Einschnitt bis zur Sklera und zum RPE, dann entfernen Sie die Sklera und das RPE.</li>
		<li>Verwenden Sie eine mikroverzahnte Pinzette, um die Linse vorsichtig zu entfernen, und entfernen Sie den Glaskörper, um die neurale Netzhaut zu isolieren.</li>
		<li>Fahren Sie mit Abschnitt 3 fort, um die Spender-Netzhautsuspension vorzubereiten, oder mit Abschnitt 4, um das Spender-Netzhautblatt vorzubereiten, je nach Bedarf.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorbereiten der Spender-Netzhautsuspension (Abbildung 1)
<ol><li>Inkubieren Sie die neurale Netzhaut in Papain-Lösung bei 37 °C für 20-30 Minuten, bis keine Zellklumpen mehr entdeckt werden. HINWEIS: Pifettieren Sie die Zellmischung vorsichtig 15x alle 10 Minuten.</li>
	<li>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers des Papain-Dissoziationskits, um einzelne Zellen zu entnehmen.</li>
</ol>4. Vorbereiten der Netzhautblätter des Spenders (Abbildung 1)
HINWEIS: Dieser Schritt folgt Abschnitt 2 und wird unter einem Präpariermikroskop durchgeführt.
<ol><li>Den isolierten neuralen Netzhautbecher in eine 35-mm-Petrischale mit vorgekühltem sterilem PBS geben.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikroschere, um die neurale Netzhautschale in mehrere Netzhautschichten (ca. 1 mm x 2 mm) zu schneiden.</li>
</ol>5. Empfängermäuse vorbereiten
<ol><li>Anästhesieren von Empfängermäusen mit intraperitonealer Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazinhydrochlorid (20 mg/kg Körpergewicht).</li>
	<li>Bestätigen Sie die chirurgische Ebene der Anästhesie, indem Sie den Verlust von Blinzel- und Schmerzreflexen, regelmäßiger Atmung und Atmung sicherstellen.</li>
	<li>Beurteilen Sie die Narkosetiefe anhand der mangelnden Reaktion auf das Einklemmen des Schwanzes oder den Rückzug der Pedalreflexe.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Narkosetiefe während des operativen Eingriffs immer erneut und passen Sie die Narkosetiefe an, wenn das Tier auf Schmerzen reagiert. Bewahren Sie die Mäuse auf dem vorgewärmten OP-Tisch auf, um eine Unterkühlung zu vermeiden.</li>
	<li>Erweitern Sie die Pupillen des Empfängers 5 Minuten vor der Operation mit 1 % (Gew./Vol.) Tropicamid Augentropfen. Eine gut erweiterte Pupille kann die transpupilläre Darstellung unter dem Operationsmikroskop erleichtern.</li>
	<li>Das operierende Mausauge und das umgebende Augengewebe mit Povidon-Jod desinfizieren, mit sterilisiertem PBS waschen.</li>
	<li>Tragen Sie 0,5% Proparacainhydrochlorid zur Analgesie auf das Mausauge auf.</li>
</ol>6. Subretinale Transplantation von Netzhauttransplantaten (Abbildung 2)
HINWEIS: Alle folgenden Schritte wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Chirurgische Instrumente wurden autoklaviert (verwenden Sie Instrumentenschalen, um die Werkzeugspitzen zu schützen, und nehmen Sie den Kolben aus den Mikrospritzen, um zu verhindern, dass sie im Lumen stecken bleiben). Lieferanteninformationen zu den Forschungswerkzeugen und -produkten finden Sie in der Materialtabelle.
<ol><li>Vorderkammerparazentese: Mit einer Insulinnadel wird die periphere Hornhaut in die Vorderkammer eingedrungen, um das Kammerwasser passiv entweichen zu lassen, um die Augeninnendruckspitzen (IOD) während der Transplantation zu verhindern. HINWEIS: Eine erfolgreiche Parazentese wird durch den Ausfluss von Kammerwasser durch das Hornhautloch angezeigt.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen Natriumhyaluronat und ein Deckglas (5 mm Durchmesser) auf die Hornhaut, um eine transpupilläre Visualisierung des Fundus unter dem chirurgischen Endoskop zu ermöglichen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Zahnzange, um den Injektionsort (1 mm post-cornealer Limbus) freizulegen, indem Sie entweder die obere oder untere Augenwand, wie für das Experiment erforderlich, in Richtung des Zentrums des transpupillären Sehens drücken.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikroinjektionsnadel, um senkrecht in die Sklera einzudringen.</li>
	<li>Drehen Sie die Nadelrichtung vorsichtig tangential, um eine vollständige Penetration des Sklera-Aderhaut-RPE-Komplexes in den subretinalen Raum zu ermöglichen.</li>
	<li>Führen Sie die Nadel tangential ein, um an den terminalen Injektionsort zu gelangen. HINWEIS: Überprüfen Sie die vollständige Positionierung der Abschrägung der Nadel durch die Führung des transpupillären Sehens. Verwenden Sie die oberflächlichen Netzhautgefäße als anatomische Referenz für eine genaue Nadelpositionierung im subretinalen Raum.</li>
	<li>Netzhauttransplantate injizieren HINWEIS: Das Vorhandensein kleiner Bläschen, die in der Spritze vorgeladen sind, kann die Validierung der genauen subretinalen Positionierung von Spenderzellen erleichtern. Ein erhöhter Augeninnendruck infolge der subretinalen Injektion erhöht das Risiko eines Spenderzellrefluxes.<ol><li>Wenn die Hornhaut trüb wird24,25, ein Indikator für einen hohen IOD, halten Sie die Nadel mindestens 3 Minuten lang im subretinalen Raum, bis die Hornhaut frei ist, ein Indikator dafür, dass der IOD ausreichend gesunken ist. HINWEIS: In seltenen Fällen kann es länger dauern, bis sich der Augeninnendruck normalisiert hat, und es wird empfohlen, die Nadel an Ort und Stelle zu lassen, bis die Klarheit der Hornhaut wiederhergestellt ist, auch wenn dies 8-10 Minuten dauern würde. Unter dem Operationsmikroskop beobachten, um Schäden an Netzhautstrukturen zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Fassen Sie den Rand des Injektionslochs mit einer mikroverzahnten Pinzette und ziehen Sie die Nadel schnell zurück. HINWEIS: Die Kriterien für eine erfolgreiche subretinale Verabreichung einer retinalen Zellsuspension und eines retinalen Blattes sind ein konstantes Bläschen bzw. ein sichtbares weißes Blatt im subretinalen Raum.</li>
	<li>Reinigen Sie den Operationsbereich des Auges mit künstlichen Tränen und tragen Sie bei Bedarf Salbe auf.</li>
	<li>Verabreichung nach der Operation<ol><li>Setzen Sie transplantierte Mäuse in einen vorgewärmten (37 °C) sauberen Erholungskäfig und überwachen Sie sie sorgfältig auf Stress.</li>
		<li>Tragen Sie einen Tropfen topisches 0,5%iges Proparacainhydrochlorid 2-3 Mal auf das chirurgische Auge auf, wenn Stress auftritt.</li>
		<li>Bringen Sie die Mäuse in den Käfig zurück, wenn die Mäuse vollständig wach und mobil sind. Legen Sie eine kleine Anzahl Futterpellets und einen Gelbecher in den Käfig, wenn die Mäuse Schwierigkeiten haben, den Futterbehälter zu erreichen. HINWEIS: Halten Sie die Augenoberfläche feucht, bis die Anästhesie nachlässt, um die Bildung von Katarakt zu verhindern.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Multimodale konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (cSLO)-Bildgebung
<ol><li>Zwei Monate nach der Transplantation werden Rd1 /NS-Empfängermäuse (n=5) durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazinhydrochlorid (20 mg/kg Körpergewicht) für die Bildgebung anästhesiert.</li>
	<li>Pupillen mit 1 % (Gew./Vol.) Tropicamid-Augentropfen erweitern.</li>
	<li>Führen Sie eine standardmäßige multimodale 55°-Bildgebung mit dem konfokalen Scanning-Laser-Ophthalmoskop-cSLO-System22 durch.</li>
	<li>Erhalten Sie MR- und SD-OCT-Bilder mit 30 Bildern ART-Mittelwertbildung.</li>
</ol>8. Histologische Färbung
<ol><li>Bereiten Sie gefrorene Objektträger von transplantierten Rd1/NS-Mäuseaugen vor, wie zuvor berichtet 14.</li>
	<li>Blockieren und penetrieren Sie die gefrorenen Objektträger der transplantierten Netzhaut mit einer Mischung aus 5 % Ziegenserum und 1 % Triton X100 in PBS.</li>
	<li>Proben mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubieren und in PBS spülen (5 min, 3x). Zu den primären Antikörpern gehören Ziegen-Anti-GFP-FITC (1:200), Kaninchen-Anti-Recoverin (1:1000) und Kaninchen-Anti-S-Opsin (1:500).</li>
	<li>Die Proben werden mit einem sekundären Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-Cy3, 1:500) inkubiert und mit DAPI gegengefärbt. HINWEIS: Die Lieferanten von Primär- und Sekundärantikörpern sind in der Materialtabelle aufgeführt.</li>
</ol>

<ol><li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li>
<li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nat Biotechnol. 36 (4), 328-337 (2018).</li>
<li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced%2C+dry+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Sci Transl Med. 10 (435), (2018).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-grade+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+rescues+retinal+degeneration+in+rodents+and+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs.</a> Sci Transl Med. 11 (475), (2019).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 1101-1106 (2013).</li>
<li>Shirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+two+primate+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E81-E90 (2016).</li>
<li>Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+full-thickness+retina+in+the+rhodopsin+transgenic+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig.</a> Retina. 24 (1), 98-109 (2004).</li>
<li>Klassen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cells+from+the+porcine+neural+retina+express+photoreceptor+markers+after+transplantation+to+the+subretinal+space+of+allorecipients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Progenitor cells from the porcine neural retina express photoreceptor markers after transplantation to the subretinal space of allorecipients.</a> Stem Cells. 25 (5), 1222-1230 (2007).</li>
<li>Das, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transplantation+of+human+fetal+neuroretinal+cells+in+advanced+retinitis+pigmentosa+patients%3A+results+of+a+long-term+safety+study%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study.</a> Exp Neurol. 157 (1), 58-68 (1999).</li>
<li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human neural retinal transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 3100-3106 (2000).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+of+human+retinal+progenitor+cell+transplantation+in+retinitis+pigmentosa+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 209(2017).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+allogeneic+transplantation+of+a+novel+transgenic+cone-rich+donor+mouse+line%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization and allogeneic transplantation of a novel transgenic cone-rich donor mouse line.</a> Exp Eye Res. 210, 108715(2021).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. 485 (7396), 99-103 (2012).</li>
<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+nanotubes+mediate+the+in+vivo+exchange+of+intracellular+material%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor nanotubes mediate the in vivo exchange of intracellular material.</a> EMBO J. 40 (22), 107264(2021).</li>
<li>Zou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-derived+C-Kit%28%2B%29%2FSSEA4%28-%29+human+retinal+progenitor+cells+promote+a+protective+retinal+microenvironment+during+transplantation+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents.</a> Nat Commun. 10 (1), 1205(2019).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+photoreceptor+precursors+transfer+proteins+to+host+photoreceptors+by+a+mechanism+of+cytoplasmic+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Transplanted photoreceptor precursors transfer proteins to host photoreceptors by a mechanism of cytoplasmic fusion.</a> Nat Commun. 7, 13537(2016).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).</li>
<li>Nickerson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+delivery+and+electroporation+in+pigmented+and+nonpigmented+adult+mouse+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes.</a> Methods Mol Biol. 884, 53-69 (2012).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+of+subretinal+injection+of+trypan+blue+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Rev+Med+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation of subretinal injection of trypan blue in rats.</a> Eur Rev Med Pharmacol Sci. 22 (10), 2923-2933 (2018).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifiable+in+vivo+imaging+biomarkers+of+retinal+regeneration+by+photoreceptor+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantifiable in vivo imaging biomarkers of retinal regeneration by photoreceptor cell transplantation.</a> Transl Vis Sci Technol. 9 (7), 5(2020).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+xenotransplanted+human+retinal+organoids+defines+two+migratory+cell+populations+of+nonretinal+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of xenotransplanted human retinal organoids defines two migratory cell populations of nonretinal origin.</a> Stem Cell Reports. 18 (5), 1138-1154 (2023).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+corneal+endothelial+dysfunction+to+facilitate+development+of+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Animal models of corneal endothelial dysfunction to facilitate development of novel therapies.</a> Ann Transl Med. 9 (15), 1271(2021).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ocular+hypertension+disrupts+barrier+integrity+and+pump+function+in+rat+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Acute ocular hypertension disrupts barrier integrity and pump function in rat corneal endothelial cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 6951(2017).</li>
<li>Chao, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+cells+into+the+subretinal+space+of+a+non-human+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal cells into the subretinal space of a non-human primate.</a> Transl Vis Sci Technol. 6 (3), 4(2017).</li>
<li>Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+tissue+in+the+subretinal+space+of+the+cat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye.</a> Stem Cells Dev. 28 (17), 1151-1166 (2019).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+refined+protocol+for+trans-scleral+subretinal+transplantation+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+into+rat+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of a refined protocol for trans-scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes.</a> J Vis Exp. (126), e55220(2017).</li>
<li>Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+injection+of+gene+therapy+vectors+and+stem+cells+in+the+perinatal+mouse+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye.</a> J Vis Exp. (69), e4286(2012).</li>
<li>Wongpichedchai, S., Weiter, J. J., Weber, P., Dorey, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+external+and+internal+approaches+for+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (12), 3341-3352 (1992).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+surgical+procedure+for+rhesus+epiretinal+scaffold+implantation+with+HiPSC-derived+retinal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Establishing a surgical procedure for rhesus epiretinal scaffold implantation with HiPSC-derived retinal progenitors.</a> Stem Cells Int. 2018, 9437041(2018).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+scaffolds+facilitate+epiretinal+transplantation+of+hiPSC-Derived+retinal+neurons+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biodegradable scaffolds facilitate epiretinal transplantation of hiPSC-Derived retinal neurons in nonhuman primates.</a> Acta Biomater. 134, 289-301 (2021).</li>
</ol>

MSS ist/war bezahlter Berater von Revision Therapeutics, Johnson & Johnson, Third Rock Ventures, Bayer Healthcare, Novartis Pharmaceuticals, W. L. Gore & Associates, Deerfield, Trinity Partners, Kala Pharmaceuticals und Acucela. MSS erhält gesponserte Forschungsförderung von Bayer. Diese Vereinbarungen wurden von der Johns Hopkins University in Übereinstimmung mit ihren Richtlinien zu Interessenkonflikten geprüft und genehmigt. KVL wird bei Patentanmeldungen an der University of Colorado als Erfinder genannt. MSS und YVL werden in Patentanmeldungen an der Johns Hopkins University als Erfinder genannt.

Die subretinale Transplantation bei Mäusen ist aufgrund der geringen Größe der Mäuseaugen technisch anspruchsvoll. In dieser Studie haben wir eine einfache und reproduzierbare Plattform für die subretinale Transplantation bei Mausempfängern entwickelt. Die Plattform ermöglicht einen konsistenten Schutz der Lebensfähigkeit des Spenders, eine erfolgreiche subretinale Verabreichung und gewährleistet eine niedrige Komplikationsrate.
Die hier dargestellte subretinale Transplantationstechnik wurde auf der Grundlage des transskleralen Weges entwickelt, bei dem die Injektionsnadel in die äußeren Schichten (Sklera-Aderhaut-RPE-Komplex) der Augenwand eindringt. Im Vergleich zum trans-cornealen19,20- und trans-vitreösen21,26,27-Ansatz tritt der transsklerale Zugang direkt in den subretinalen Raum ein, ohne die vorderen Segmentstrukturen und die neurale Netzhaut zu durchdringen, wodurch eine harmlose Transplantation ermöglicht und das Risiko eines Spenderzellrückflusses durch das eindringende Loch verringert wird. Eine Herausforderung des transskleralen Ansatzes besteht darin, sicherzustellen, dass sich die Nadelspitze entlang des subretinalen Raums ausbreitet, bevor sie an der terminalen Entbindungsstelle ankommt, und gleichzeitig eine mögliche Störung der angrenzenden RPE- und Aderhautschichten zu vermeiden. Es ist eine Herausforderung, diese Ziele durch einen traditionellen transskleralen Ansatz28,29 ohne direkte visuelle Führung zu erreichen. In dieser Studie haben wir eine transpupilläre Visionsplattform entwickelt, die ein Operationsmikroskop und eine externe Beleuchtung der Netzhaut verwendet, um die subretinale Transplantation in Mausmodellen zu erleichtern. Die Plattform ermöglicht es dem Operateur, den chirurgischen Prozess und den Netzhautzustand des Empfängers zu verfolgen, indem er den Fundus des Empfängers unter dem Operationsmikroskop in Echtzeit visualisiert. Zum Beispiel kann die erfolgreiche Penetration des Sklera-Aderhaut-RPE-Komplexes einfach durch eine relativ helle Reflexion der Nadelspitze über die transpupille Visualisierung validiert werden. Wichtig ist, dass der Bediener bei Anleitung durch die transpupilläre Visualisierung den Winkel und die Tiefe der Injektion entsprechend der relativen Position zwischen der Nadel und den anatomischen Strukturen in der Netzhaut des Empfängers (z. B. Netzhautgefäße und Sehnervenkopf) genau modulieren kann. Darüber hinaus kann die genaue Verabreichung von Materialien mit dieser Technik RPE, Aderhauttraumata und andere chirurgische Komplikationen minimieren. In der Tat haben wir festgestellt, dass Blutungen minimiert werden können, indem Manöver in unmittelbarer Nähe der retinalen Blutgefäße mit Hilfe der transpupillären Visualisierung vermieden werden.
Der Rückfluss von Spenderzellen ist eine der Hauptursachen für chirurgisches Versagen nach der Injektion29,30. Es gibt mehrere Faktoren, die an der Förderung des Refluxes von Spenderzellen beteiligt sind. Der hohe Augeninnendruck (IOD) der Empfängeraugen, der durch die injizierten Spenderzellmischungen verursacht wird, ist ein wichtiger Faktor, der den Rückfluss von Zellen aus dem Auge fördert. Unser Protokoll reduziert den Augeninnendruck des Empfängers durch Penetration der Vorderkammer zu Beginn der Operation und ermöglicht es ihm, den Augeninnendruck spontan durch wässrigen Flüssigkeitsaustritt zu senken, bevor die Glaskörpernadel aus der Glaskörperhöhle herausgezogen wird. Ein zweiter Faktor ist der unverschlossene Injektionstunnel in den Augen der Empfänger. Um einen Rückfluss des Transplantats durch den Injektionstunnel zu verhindern, verwenden wir eine kleine Mikroinjektionsnadel (34G), um beim Eindringen in die Augenwand einen selbstdichtenden Tunnel zu schaffen, und eine gezahnte Mikropinzette, um die Ränder der äußeren Tunnelöffnung beim Herausziehen der Nadel zu halten. Bei der konventionellen Transplantation werden Refluxtransplantate kaum erkannt, da sie schnell auftreten oder sich schnell auflösen können. Das Natriumhyaluronat gleitet beim Auftragen des Deckglases fast ausnahmslos von der Hornhaut ab und bedeckt den größten Teil des Limbus und der Sklera einschließlich der Sklerotomiestelle. Nach der Zellinjektion kann das Natriumhyaluronat an der Sklerotomiestelle dazu beitragen, den Massenfluss von refluxiertem Inhalt, falls vorhanden, zu verlangsamen und ihn unter dem Operationsmikroskop visuell erkennbar zu machen. Darüber hinaus kann die Abwesenheit von Reflux auch überprüft werden, indem die Konstanz der subretinalen Blase für Zellsuspensionen und die intraokulare Lage der Netzhautfolie mit unserem Protokoll verfolgt werden, was für Labore nützlich sein könnte, in denen keine optische Kohärenztomographie (OCT) verfügbar ist.
Während eine beträchtliche Anzahl von Photorezeptorzellen in den transplantierten Netzhautschichten überlebte, konnte keine erkennbare Zellorientierung oder Blattorientierung nachgewiesen werden. Obwohl die Verabreichung von 3D-Netzhautblättern an große Tiere etabliert ist 26,31,32, macht es der subretinale Raum bei Mäusen in Verbindung mit der fehlenden intraoperativen Netzhautbildgebungsfähigkeit sehr schwierig, die Aufrechterhaltung der Blattorientierung sowohl intraoperativ als auch in der unmittelbaren postoperativen Phase sicherzustellen, in der die transplantierten Zellen oder Blätter instabil werden können, wenn die Maus wieder läuft.
Wir beschreiben eine transsklerale chirurgische Plattform mit direkter transpupillärer Visionsführung für die subretinale Transplantation bei Mausempfängern. Diese Plattform ermöglicht eine hohe Injektionsgenauigkeit und eine geringe Rate an chirurgischen Komplikationen. Diese Plattform ermöglicht die präzise Verabreichung bekannter Zelldosen, ist relativ einfach zu erlernen und erleichtert die subretinale Verabreichung zusätzlich zu intraretinalen oder intravitrealen Injektionen für verschiedene Arten von Therapeutika, einschließlich der Gentherapie.

Die Transplantation von Photorezeptor- und retinalen pigmentierten Epithelzellen (RPE) bietet eine potenzielle Therapie für degenerative Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Morbus Stargardt und Retinitis pigmentosa (RP)1,2,3,4,5,6,7 . Um die erkrankten Photorezeptoren und RPE-Zellen in degenerierten Netzhäuten wieder aufzufüllen oder zu ersetzen, eignet sich der subretinale Raum aufgrund der laminaren Anatomie der Wirts-Photorezeptoren und RPE-Zellen besonders gut als Transplantationsziel. Während chirurgische Verfahren der subretinalen Transplantation von RPE-Zellen bei großen Tieren gut etabliert sind 8,9,10 und klinische Studien11,12,13, zu den Herausforderungen für die Photorezeptortransplantationsforschung gehören unter anderem der Mangel an transgenen Großtiermodellen und das begrenzte Verständnis der tiefgreifenden Synaptogenesemechanismen, die an der neuronalen Transplantation beteiligt sind. Genetisch modifizierte Mausmodelle mit verschiedenen Arten von retinalen Degenerationsmutanten bieten nützliche Werkzeuge, um molekulare Mechanismen im Kontext von Transplantationen zu untersuchen und die Entwicklung wirksamer Zellersatztherapien im präklinischen Stadium zu steuern 14,15,16,17,18.
Im Gegensatz zu dem relativ großen Auge und der kleinen Augenlinse bei großen Tieren (z. B. Schwein, Affe) machen die geringe Größe und die große kristalline Linse von Mäuseaugen sie zu schwierigen chirurgischen Zielen, insbesondere für subretinale Transplantationen, bei denen der räumliche Raum und die eingeschränkte direkte Visualisierung die größten Herausforderungen darstellen.
Derzeitige Ansätze können je nach Injektionsweg in drei Haupttypen eingeteilt werden. Zunächst wird beim transkornealen Zugang die Nadel durch die Hornhaut in den Glaskörper und dann in den subretinalen Raum19,20 eingeführt. Mit dieser Methode kann eine erfolgreiche subretinale Verabreichung erreicht werden, aber die Schädigung der Strukturen des vorderen Segments (d. h. Hornhaut, Iris, Linse) ist ein großes Risiko, das die nachgeschaltete In-vivo-Analyse stark behindern kann. Zweitens tritt die Nadel im Falle des trans-glasartigen Zugangs durch die Pars plana in die Glaskörperhöhle und dann in den subretinalen Raum21 ein. Dieser Ansatz ist bei Menschen und Großtieren weit verbreitet. Es besteht jedoch ein potenzielles Risiko einer Linsenschädigung bei Nagetieren, da die Linse ein größeres relatives Volumen des Glaskörpers einnimmt. Bemerkenswert ist, dass sowohl transkorneale als auch transglasartige Protokolle eine Penetration der neuralen Netzhaut erfordern, um in den subretinalen Raum zu gelangen, was die Wirtsnetzhaut schädigt und das Risiko eines Rückflusses von Spenderzellen durch das Penetrationsloch erhöht. Drittens dringt die Nadel im Falle des transskleralen Zugangs22,23 durch den Skleral-Aderhaut-RPE-Komplex und dringt direkt in den subretinalen Raum ein. Dieser Ansatz reduziert das potenzielle Trauma von vorderen Segmentstrukturen und der Glaskörperhöhle. Ohne direkte Visualisierung des Wirtsfundus werden jedoch häufig chirurgische Misserfolge durch transretinale Punktionen, RPE-Ablösung und Aderhautblutungen erkannt.
Hier haben wir eine transsklerale chirurgische Plattform mit direkter transpupillär Visionsführung für die subretinale Transplantation bei Mausempfängern entwickelt. Validierung der Lebensfähigkeit von Spender-Netzhautfolien und Zellsuspensionen vor der Transplantation. Die erfolgreiche Einschleusung der Spenderzellen in den subretinalen Raum eines retinhautdegenerativen Mausmodells wurde bestätigt. Es wurden nur seltene chirurgische Komplikationen festgestellt. Darüber hinaus überlebten transplantierte Photorezeptoren in den Netzhauttransplantaten und zeigten zwei Monate nach der Transplantation Anzeichen einer fortgeschrittenen Reifung zu "erwachsenen" Stäbchen und Zapfen.

<table><tbody><tr><td>Künstliche Tränen</td><td>CareAll</td><td>P31447-04</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (5mm Durchmesser)</td><td>Deckglaser</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-GFP (FITC)</td><td>Abcam</td><td>Ab6662</td><td></td></tr><tr><td>Ziege-Anti-Kaninchen Cy3&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A10520</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze (30G)</td><td>Easy Touch</td><td>08496-3015-11</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>VETone Zetamin</td><td>AH2017J</td><td></td></tr><tr><td>Live Dead Viability Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8503</td><td></td></tr><tr><td>Mikro glatte Pinzette</td><td>ASICO</td><td>AE-4360</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozahnzange</td><td>World Precision Instruments</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsnadel (26G)</td><td>Hamilton</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsnadel (34G)</td><td>Hamilton</td><td>207434</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsspritze</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>Papain-Dissoziationskit</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (35 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB012920</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Jod (10%)</td><td>Betadin-Lösung</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Proparacainhydrochlorid (0,5%)</td><td>Keeler</td><td>AX0500</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Recoverin</td><td>Millipore</td><td>Ab5585</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-S-Opsin</td><td>Millipore</td><td>Ab5407</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhyaluronat</td><td>Johnson & Johnson Vision &nbsp;</td><td>10-2400-11</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Wattestäbchen</td><td>Puritan</td><td>25-806 2PC</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Nadel (25G)</td><td>BD PrecisionGlide Nadel</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Handtuchabdeckungen</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Materialien/Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tropicamid ophthalmische Lösung</td><td>Henry Schein</td><td>112-7192</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>AnaSed Injektion</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

transpupillengesteuerte transsklerale transplantation von subretinalen transplantaten in einem retinalen degenerations-mausmodell

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Die Transplantation von Photorezeptorzellen und retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) stellt eine potenzielle Therapie für Netzhautdegenerationserkrankungen dar. Die subretinale Transplantation von therapeutischen Spenderzellen in Mäuseempfänger ist aufgrund des begrenzten chirurgischen Raums, der durch das geringe Volumen des Mausauges zur Verfügung steht, eine Herausforderung. Wir haben eine transsklerale chirurgische Transplantationsplattform mit direkter transpupillärischer Sehführung entwickelt, um die subretinale Verabreichung exogener Zellen bei Mausempfängern zu erleichtern. Die Plattform wurde mit retinalen Zellsuspensionen und dreidimensionalen Netzhautblättern getestet, die von stäbchenreichen Rho:: EGFP-Mäusen und zapfenreichen OPN1LW-EGFP gesammelt wurden. NRL-/- Mäusen. Der Lebend-/Tottest zeigte eine geringe Zellmortalität für beide Formen von Spenderzellen. Netzhauttransplantate wurden erfolgreich in den subretinalen Raum eines Mausmodells für Netzhautdegeneration, Rd1/NS, eingebracht, mit minimalen chirurgischen Komplikationen, die durch multimodale konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskop-Bildgebung (cSLO) festgestellt wurden. Zwei Monate nach der Transplantation zeigte die histologische Färbung Hinweise auf eine fortgeschrittene Reifung der Netzhauttransplantate zu "adulten" Stäbchen und Zapfen (durch robuste Rho::EGFP-, S-Opsin- bzw. OPN1LW:EGFP-Expression) im subretinalen Raum. Hier stellen wir eine chirurgische Plattform zur Verfügung, die eine hochpräzise subretinale Verabreichung mit einer geringen Komplikationsrate bei Mausempfängern ermöglichen kann. Diese Technik bietet Präzision und relativ einfaches Erlernen von Fähigkeiten. Darüber hinaus könnte die Technik nicht nur für Studien zur subretinalen Zelltransplantation verwendet werden, sondern auch für andere intraokulare therapeutische Studien, einschließlich Gentherapien.

Netzhauttransplantate werden erfolgreich in den subretinalen Raum eingebracht und in vivo überlebt. Die Leistungsfähigkeit unserer subretinalen Transplantationsplattform wurde bei Rd1/NS-Empfängermäusen im Alter von 6-8 Wochen untersucht, als ihre verbleibende Netzhaut aufgrund der fast vollständigen Degeneration der äußeren Kernschicht (ONL) stark ausgedünnt war. Angesichts der Zerbrechlichkeit der Netzhaut, der Seltenheit von Zapfen-Photorezeptoren und der relativ schlechten Lebensfähigkeit von Zellen in Suspension im Vergleich zu Blattspendern sollten zapfenreiche Mäuse (OPN1LW-EGFP; NRL-/-)14 wurden als Quellen für Spender-Netzhautblätter und stäbchenreiche Mäuse (Rho::EGFP) als Spender für Zellsuspensionen verwendet. Zapfenreiches Netzhautblatt und stäbchenreiche Zellsuspensionen wurden allen Empfängermäusen mit unserer chirurgischen Plattform erfolgreich in den subretinalen Raum eingebracht, was durch die subretinale Blase und das weiße Blatt bestätigt wird, die unmittelbar nach der Injektion mittels transpupillärer Visualisierung zu sehen sind. Zwei Monate nach der Transplantation wurde eine multimodale cSLO-Bildgebung durchgeführt, um den Zustand der Netzhauttransplantate in vivo zu verfolgen. OCT-Querschnittsuntersuchungen zeigten, dass Netzhauttransplantate im subretinalen Raum überlebten und die ONL in allen Empfängermäusen rekonstituierten (Abbildung 3A). Die Infrarot-Bildgebung detektierte keine offensichtlichen Katarakte in allen transplantierten Augen (Abbildung 3B). Andere chirurgische Komplikationen, einschließlich Blutungen, wurden in transplantierten Netzhäuten (n = 1/10 Augen) durch mehrfarbige Reflexionsbildgebung zwei Monate nach der Transplantation selten nachgewiesen (Abbildung 3C). Wir führten histologische Färbungen durch, um das Überleben und das Ausmaß der Reifung von Photorezeptoren in Netzhauttransplantaten weiter zu beurteilen. Es wurden reichlich Zapfen-Photorezeptoren beobachtet, die OPN1LW:EGFP und S-Opsin in transplantierten Netzhautschichten exprimieren. Ebenso zeigten transplantierte Netzhautzellsuspensionen in vivo einen großen Anteil an Rec+-Photorezeptoren, darunter zahlreiche Rho::EGFP+-Stäbchen (Abbildung 3D). Die nicht transplantierten Kontrollmäuse zeigten eine starke ONL-Degeneration mit spärlichen Restzapfen-Photorezeptoren (Rec+). In der nicht transplantierten Rd1/NS-Netzhaut wurde kein EGFP-Signal nachgewiesen (Abbildung 3D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entnahme von Spendernetzhautfolien und Zellsuspensionen. Schematische Darstellung der wichtigsten Schritte der Entnahme von Netzhautzellsuspensionen und -blättern von Rho::EGFP-Spendermäusen . Die Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung zeigte repräsentative Bilder von dissoziierten Zellen und einem präparierten Blatt, das aus Rho::EGFP-Mäusen isoliert wurde. Gelbe gestrichelte Linie: Schnittrand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig02v3.jpg"> Abbildung 2: Verfahren der subretinalen Transplantation von Netzhautblättern und Zellsuspension bei Rd1/NS-Mäusen . (A) Schematische Bilder der Präparation der Empfängermäuse. (B) Wichtige chirurgische Verfahren und entsprechende Diagramme, die die subretinale Transplantation von retinalen Zellsuspensionen und -folien zeigen. Zu den chirurgischen Schritten gehören: 1. Eindringen in die Vorderkammer; 2. Tropfen Sie das Natriumhyaluronat auf die Hornhaut und montieren Sie dann das Deckglas auf das Natriumhyaluronat, um die transpupilläre Visualisierung zu erleichtern. 3. die äußeren Schichten der Augenwand durchdringen (Sklera-Aderhaut-RPE-Komplex). Die Eindringwinkel der Nadel befinden sich oben rechts in der Abbildung. 4. Injektionsnadel einführen; 5. Injizieren Sie Transplantate. Repräsentative Bilder zeigen die erfolgreiche Verabreichung von Netzhautzellsuspensionen und -blättern bei zwei einzelnen Empfängern. Sternchen: Sehnervenkopf; Rote Pfeilspitzen: retinales Blutgefäß; Weiße Pfeilspitze: durchdrungene Nadelspitze; Weiße Pfeile: transplantierte Netzhautsuspensionen oder -blätter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65448/65448fig03.jpg"> Abbildung 3: Erfolgreiche Verabreichung von Netzhauttransplantaten in den subretinalen Raum und Überleben in vivo. (A) Repräsentative SD-OCT-Bilder zeigten die subretinale Verteilung der transplantierten Netzhautblätter und Zellsuspensionen in jeweils zwei einzelnen Rd1/NS-Mäusen . Nicht transplantierte Rd1/NS-Mäuse wurden als Kontrolle gesammelt. Die Region of Interest (ROI) wird durch gelb gepunktete Kästchen auf Infrarot-Fundusbildern (IR) angezeigt. Die innere Netzhaut wird als Lamina der retinalen Ganglienzellschicht (RGC), der inneren plexiformen Schicht (IPL) und der inneren Kernschicht (INL) bezeichnet. (B) Repräsentatives Infrarot (IR)-Bild einer transplantierten Rd1/NS-Maus zeigte keinen Katarakt durch die erweiterte Pupille. (C) Repräsentative mehrfarbige Reflexionsbilder (MR) von transplantierten und nicht transplantierten Rd1/NS-Augen . Die transplantierten Augen wiesen keine offensichtlichen chirurgischen Komplikationen einschließlich Blutungen auf. (D) Immunhistochemische (IHC) Färbung von transplantierten (Blatt und Suspension) und nicht transplantierten (Kontroll) Rd1/NS-Mäusen . Die Daten zeigten zwei Monate nach der Transplantation zahlreiche transplantierte Photorezeptoren, die spezifische Marker von Photorezeptoren (Rec), Stäbchen (Rho::EGFP), L/M-Zapfen (OPN1LW:EGFP) und S-Zapfen (S-Opsin) exprimierten. Die retinalen Laminae des Empfängers wurden durch DAPI-Färbung (blau) identifiziert. Netzhauttransplantate wurden von einem EGFP-Reporter (grün) identifiziert. Die nicht transplantierte Retina der Mäuse zeigte eine schwere ONL-Degeneration mit spärlichen Restzapfen-Photorezeptoren (Rec+). In nicht-transplantierten Rd1/ NS-Netzhäuten wurde kein EGFP-Signal detektiert. Vergrößerte Bilder wurden auf den rechten beiden Tafeln präsentiert. Abkürzungen: RGC: retinale Ganglienzellschicht; INL: innere Kernschicht. ONL: äußere Kernschicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65448/65448fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll stellt einen transpupillengesteuerten transskleralen Ansatz zur sicheren und präzisen Verabreichung subretinaler zellulärer Transplantate mit einer geringen Rate an chirurgischen Komplikationen bei Mäuseempfängern mit oder ohne Netzhautdegeneration dar.

Transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation von subretinalen Transplantaten in einem retinalen Degenerations-Mausmodell

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, eine transsklerale Transplantationsplattform mit direkter transpupillärer Führung zu entwickeln, um die subretinale Verabreichung von Zellen bei Mausempfängern zu erleichtern. Alle Tierversuche wurden gemäß dem Leitfaden des National Institute of Health durchgeführt. Unsere Erklärung zur Verwendung von Tieren, die vom Animal Care and Use Committee der Johns Hopkins University genehmigt wurde.Die Annahme des EGFP-Alters von Mäusen am postnatalen Tag 3-6 wurde als Spender von Netzhautzellsuspensionen verwendet. OPN1LW-EGFP/NRL-Mäuse im Alter von postnatalem Tag 3 wurden als Netzhautblattspender adoptiert. Als Empfänger wurden adulte Rd1/NS-Mäuse mit Netzhautdegeneration und Immunschwäche verwendet.Euthanasie von Spendermäusen mit einer Überdosis Kohlendioxid. Um die Augäpfel von Mäusen zu isolieren, öffnen Sie vorsichtig die Augenlider der Jungtiere mit einer Mikroschere und legen Sie den Augapfel frei. Wickeln Sie den Sehnerv ein und ziehen Sie den Augapfel mit einer glatten Pinzette heraus.Sobald die Augäpfel isoliert sind, schneiden Sie mit einer 25-Gauge-Nadel ein Loch in die Mitte der Hornhaut. Schneiden Sie die Hornhaut durch das Loch in zwei Hälften. Und vergrößern Sie den Schnitt bis zur Sklera und RPE.Entfernen Sie dann die Sklera und RPE. Verwenden Sie als Nächstes eine mikroverzahnte Pinzette, um die Linse vorsichtig zu entfernen, und Glaskörper, um die neurale Netzhaut zu isolieren. Um die Spender-Netzhautsuspension zu gewinnen, inkubieren Sie die neurale Netzhaut in Papain-Lösung bei 37 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten, bis keine Zellklumpen mehr nachweisbar sind.Entnehmen Sie die einzelnen Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers des Papain-Kits. Um ein Netzhautblatt vorzubereiten, legen Sie die isolierte Netzhaut in eine Petrischale mit PBS. Schneiden Sie dann die neurale Netzhaut vorsichtig mit einer Mikroschere in mehrere Netzhautschichten.Anästhesieren Sie Empfängermäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin. Stellen Sie sicher, dass die erreichte Anästhesieebene die chirurgische Ebene ist, bei der das Tier Blinzeln und Schmerzreflexe verliert, aber Atmung und Atmung regelmäßig bleiben. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch das Einklemmen des Schwanzes oder die Pedalrückzugsreflexe.Überprüfen Sie die Narkosetiefe während des operativen Eingriffs erneut. Bewahren Sie die Mäuse auf dem vorgewärmten Operationstisch auf, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Erweitern Sie die Pupillen des Empfängers fünf Minuten vor der Operation mit Tropicamid Augentropfen.Eine gut erweiterte Pupille kann die transpupilläre Darstellung unter dem Operationsmikroskop erleichtern. Geben Sie einen Tropfen Proparacainhydrochlorid zur Analgesie auf das Auge der Maus. Desinfizieren Sie das operierende Mausauge und das umgebende Augengewebe mit Jod.Reinigen Sie anschließend das Auge mit sterilem PBS. Eindringen in den peripheren Tunnel in die innere Kammer, um den Augeninnendruck zu senken. Geben Sie als Nächstes einen Tropfen Natriumhyaluronat und ein Deckglas auf die Hornhaut.Die transpupilläre Visualisierung des Mausfundus ist nun unter dem chirurgischen Scope verfügbar. Legen Sie den Injektionsort frei, indem Sie die Augenwand mit einer Zahnzange in Richtung der Mitte des Augenblicks schieben. Dann wird die Sklera teilweise mit einer Mikroinjektionsnadel penetriert, die im 90-Grad-Winkel zur Augenwand ausgerichtet ist.Die oberflächlichen Netzhautgefäße können als anatomische Referenz dienen, um die Nadel im subretinalen Raum zu lokalisieren. Dann injizieren Sie die Netzhauttransplantate. Die vorgeladenen kleinen Bläschen in der Spritze können die Validierung der subretinalen Lokalisation von Spenderzellen erleichtern.Wenn die Hornhaut trüb wird, halten Sie die Nadel im subretinalen Raum, bis die Hornhaut durchsichtig wird, um den Augeninnendruck zu normalisieren. Fassen Sie den Rand des Injektionslochs und ziehen Sie die Nadel schnell heraus. Das Kriterium für die erfolgreiche Verabreichung der Zellsuspension ist eine konstante Blase im subretinalen Raum.Eine erfolgreiche Lieferung von Netzhautfolie wird durch eine sichtbare weiße Folie überzeugt. Halten Sie transplantierte Mäuse in einem vorgewärmten, sauberen Erholungskäfig und überwachen Sie sie sorgfältig auf Anzeichen von Not. Wenn dies der Fall ist, geben Sie zwei- bis dreimal einen Tropfen topisches Proparacainhydrochlorid auf das chirurgische Auge.Bringen Sie die Mäuse zurück in den Hauskäfig, wenn die Mäuse vollständig wach und beweglich sind. Geben Sie eine kleine Anzahl Futterpellets in den Gelbecher auf dem Boden des Käfigs. Wenn die Mäuse Schwierigkeiten haben, den Futtertrichter zu erreichen.Zwei Monate nach der Transplantation wurde eine multimodale konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie durchgeführt, um den Zustand der in vivo beobachteten Netzhauttransplantate zu überprüfen. Die optische Kohärenztomographie im Spektralbereich zeigte, dass die Netzhauttransplantate im subretinalen Raum überlebten und die äußere Kernschicht aller Empfängermäuse rekonstituierten. Die Infrarot-Bildgebung zeigte bei allen transplantierten Mäusen keinen offensichtlichen Katarakt.Andere chirurgische Komplikationen, einschließlich Blutungen, wurden bei transplantierten Mäusen durch mehrfarbige Reflexionsbildgebung schlecht erkannt. Die histologische Färbung zeigte eine Vielzahl von Zapfen-Photorezeptoren, die OPN1LW:EGFP und S-Opsin in transplantierten Netzhautschichten exprimierten. Ebenso zeigte die Transplantation von Netzhautzellsuspensionen einen großen Anteil an sich erholenden positiven Photorezeptoren in vivo, einschließlich zahlreicher reifer EGFP-positiver Stäbchen.Die nicht transplantierten Mäuse zeigten eine schwere Degeneration der äußeren Kernschicht mit spärlichen Restzapfen-Photorezeptoren, die eine Erholung ausdrückten. Bei nicht transplantierten Mäusen wurde jedoch kein EGP-Signal nachgewiesen. Diese Studie bietet eine transsklerale chirurgische Plattform mit direkter Führung des transpupillären Sehens für die subretinale Transplantation bei Mausempfängern.Diese Plattform ermöglicht die präzise Verabreichung bekannter Zelldosen. Es ist relativ einfach, die subretinale Verabreichung zusätzlich zu intraretinalen oder intravitrealen Injektionen für verschiedene Arten von Therapeutika, einschließlich der Gentherapie, zu erlernen und zu erleichtern.

transpupillary-guided-trans-scleral-transplantation-subretinal-grafts

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Zelltransplantation stellt eine Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration dar, die durch Photorezeptorverlust gekennzeichnet ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren und deren subretinaler Transplantation in erwachsene Mäuse.

Subretinale Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina

Hier präsentieren wir ein von der Community akzeptiertes Protokoll im Multimedia-Format für die subretinale Injektion eines Bolus von RPE-Zellen in Ratten und Mäuse. Dieser Ansatz kann zur Bestimmung von Rettungspotenzialen, Sicherheitsprofilen und Überlebenskapazitäten von transplantierten RPE-Zellen nach Implantation in Tiermodellen der Netzhautdegeneration verwendet werden.

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

Retinalen Pigmentepithel (RPE) Ersatzstrategien und Gen-Therapie für mehrere degenerativen Retina Bedingungen betrachtet. Für die klinische Übersetzung werden große Auge Tiermodellen erforderliche chirurgische Techniken anwendbar bei Patienten zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Kaninchenmodell für subretinalen Chirurgie zu RPE-Transplantation ausgerichtet, die vielseitig und kosteneffizient ist.

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Subretinale Injektion hat weit in präklinischen Studien der Stammzell-Ersatz-Therapie bei altersbedingter Makuladegeneration angewendet worden. In diesem visualisierte Artikel beschreiben wir eine weniger riskante, reproduzierbar und präzise modifizierte subretinalen Injektionstechnik über den Trans-skleralen Ansatz um Zellen in Ratte Augen zu liefern.

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Hier wird eine Operationstechnik zur Transplantation von aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnenem Netzhautgewebe in den subretinalen Raum eines Großtiermodells vorgestellt.

Subretinale Transplantation von menschlichem embryonalem Stammzellgewebe in einem katzenartigen Großtiermodell

Der nicht-menschliche Primat (NHP) ist aufgrund der anatomischen und genetischen Ähnlichkeiten ein ideales Modell für die Untersuchung der zellulären Therapeutika der menschlichen Netzhaut. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur submakulären Transplantation von retinalen Pigmentepithelzellen im NHP-Auge und Strategien zur Verhinderung intraoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit der Makulamanipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Präparation von post-kryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die subretinale Verabreichung dieser Zellen in rd10-Mäusen .

Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen

Subretinale Injektionen sind eine unverzichtbare Technik für die präklinische Entwicklung von Therapeutika für Photorezeptor- und RPE-Erkrankungen. Wir beschreiben eine optimierte transsklerale subretinale Injektionstechnik bei Mäusen, die die intraoperativen Erfolgsraten verbessert und Netzhautschäden minimiert.

Optimierte minimal-invasive transsklerale subretinale Injektionstechnik in der Maus

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Lernen Sie die transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation subretinaler Zellen in einem Mausmodell zur Behandlung retinaler Degeneration. Diese Methode ermöglicht präzise Zelllieferung mit minimalen Komplikationen.

Transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation von subretinalen Transplantaten in einem retinalen Degenerations-Mausmodell (Video) | JoVE Journal

Transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation von subretinalen Transplantaten in einem retinalen Degenerations-Mausmodell

Weitere Videos entdecken