Name: Nachweis von Tollwut-IgG- und IgM-Antikörpern mit dem Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Tollwut-Antikörpern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Lernen Sie den indirekten fluoreszierenden Antikörpertest (IFA) zur Detektion von Tollwut-spezifischen IgG- und IgM-Antikörpern kennen. Diese Methode ermöglicht eine schnellere Alternative zu neutralisierenden Antikörpertests.

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Wir danken dem Wadsworth Center des New York State Department of Health für die Unterstützung dieses Projekts.

Das folgende Protokoll wurde vom Wadsworth Center des New York State Department of Health für die Entwicklung von Assays für die ethische Verwendung von menschlichen Proben genehmigt, Protokollgenehmigungsnummer #03-019.
1. Sicherheit
<ol><li>Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), mindestens Augenschutz (Brille oder Gesichtsschutz), eine chirurgische Maske und latexfreie Handschuhe.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Personal gegen Tollwut geimpft ist und dass innerhalb der letzten 6 Monate ein Titer von ≥0,5 IE/ml nachgewiesen wurde.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Antigen-Objektträgers
HINWEIS: Führen Sie alle Virus-, Liquor- und Serummanipulationen in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) unter Verwendung universeller Vorsichtsmaßnahmen durch.
<ol><li>Bereiten Sie 20 ml Maus-Neuroblastom- oder BHK-21-Zellen auf eine Konzentration von 3,0 x 105 Zellen/ml in den minimal essentiellen Medien von Eagle vor, die mit 10 % fötalem Kälberserum (EGM) ergänzt werden, und lassen Sie sie bis zur Verwendung kalt.</li>
	<li>Bereiten Sie das CVS-11-Virus vor, indem Sie es in EGM auf eine Arbeitsverdünnung von 1,0 x 106,5 50 % infektiöser Gewebekulturdosis (TCID50) pro Milliliter verdünnen und bis zur Verwendung kalt stellen. ANMERKUNG: TCID50 wird nach der zuvor veröffentlichten Reed- und Muench-Methode bestimmt5.</li>
	<li>Reinigen Sie eine Feuchtigkeits-Objektträgerkammer und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichtete Objektträger mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie in der BSC an der Luft trocknen.</li>
	<li>Geben Sie destilliertes Wasser (dH2O) zu saugfähigen Papierstreifen in der Objektträgerkammer, um sicherzustellen, dass die Luftfeuchtigkeit während des gesamten Verfahrens konstant bleibt.</li>
	<li>Beschriften Sie jeden zu verwendenden Objektträger mit einem Bleistift mit der Chargennummer, dem Datum, dem Zellentyp und allen anderen für die Lagerung erforderlichen identifizierenden Informationen und legen Sie sie in die Objektträgerkammer. HINWEIS: Die meisten Marker, Stifte oder Etiketten halten dem zukünftigen Aceton-Fixierungsschritt (Schritt 2.9) nicht stand.</li>
	<li>Tragen Sie 50 μl Virusverdünnung mit einer sich wiederholenden Pipette auf jedes Well auf den Objektträgern auf. Tragen Sie dann 50 μl Zellverdünnung auf jede Vertiefung auf und achten Sie darauf, die Pipettenspitze nicht mit dem Virus zu kontaminieren, das sich bereits auf der Vertiefung befindet.</li>
	<li>Schließen Sie die Feuchte-Objektträgerkammer und stellen Sie sie bei 34-36 °C in den feuchten Inkubator. Beurteilen Sie die Zellinfektiosität nach 24 Stunden. HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.8 bis 2.12 nur auf einer Folie aus.</li>
	<li>Nehmen Sie den Objektträger aus der Feuchtigkeitskammer und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab. Waschen Sie den Objektträger 2 Minuten lang in einem mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllten Coplin-Glas und lassen Sie den Objektträger dann an der Luft trocknen.</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger in das Coplin-Glas und fixieren Sie den Objektträger mindestens 1 Stunde lang in kaltem Aceton in einem Gefrierschrank bei -20 °C, der für brennbare Materialien zugelassen ist. Führen Sie alle Acetongieß- und Lufttrocknungsvorgänge in einem Abzug durch.</li>
	<li>Lassen Sie das Aceton ablüften und trocknen lassen. Tollwut-Direktfluoreszenz-Antikörper-Konjugat (DFA), das gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt wurde, auf die Vertiefungen des Objektträgers auftragen und 30 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 34-36 °C inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie den Objektträger zweimal für jeweils 2 Minuten in Coplin-Gläsern mit PBS. Trocknen Sie die Folie an der Luft.</li>
	<li>Montieren Sie ein Deckglas mit 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) und 20 % Glycerin-Eindeckmittel und lesen Sie den Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung ab, um die Infektiosität zu beurteilen. Wenn die Zellen nicht zu etwa 50 % infiziert sind, wiederholen Sie die Schritte 2.7-2.12 am nächsten Tag, bis die gewünschte Infektiosität erreicht ist. HINWEIS: Die Zellinfektiosität wird auf der Grundlage der visuellen Bewertung des Verhältnisses von negativen Zellen zu tollwutpositiven Zellen auf der Objektträgervertiefung angenähert. Negative Zellen erscheinen rot, während positive Zellen eine grüne Fluoreszenzfärbung aufweisen.</li>
	<li>Entfernen Sie die restlichen Objektträger aus dem Inkubator und der Feuchtigkeitskammer. Saugen Sie den Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung an und legen Sie die Objektträger dann für 1-2 Minuten in ein oder mehrere Coplin-Gläser mit PBS. Lassen Sie die Objektträger ca. 30 Minuten an der Luft trocknen. Lagern Sie die Objektträger bis zur Verwendung bei -80 °C.</li>
</ol>3. Probenvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Verdünnungen von Patientenserum oder Liquorproben für den Test vor. Bereiten Sie das notwendige Konjugat für eine ordnungsgemäße Arbeitskonzentration vor, verdünnt in PBS mit 0,05 % Evansblau. HINWEIS: Bewahren Sie das Konjugat vor der Anwendung im Dunkeln auf, um die Integrität des Fluorophors zu erhalten</li>
</ol>4. IFA-Verfahren
<ol><li>Entfernen Sie die erforderliche Anzahl von vorbereiteten Antigen-Objektträgern, die für jeden Assay benötigt werden, und lassen Sie die Objektträger auftauen und vollständig trocknen.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in ein oder mehrere Coplin-Gläser und fixieren Sie die Objektträger in kaltem Aceton für 2 Stunden bis über Nacht in einem Gefrierschrank bei -20 °C, der für brennbare Materialien zugelassen ist. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Aceton und lassen Sie sie an der Luft trocknen.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammerbox im Inneren des BSC mit dH2O-getränkten Saugstreifen, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Tragen Sie 50 μl jeder Probenverdünnung, Kontrollprobe oder PBS auf die vorbestimmte Vertiefung auf. HINWEIS: Jeder Objektträger muss eine angemessene Anzahl von Patientenproben, Positivkontroll-, Negativkontroll- und PBS-Zellkontroll-Wells enthalten.</li>
	<li>Die geschlossene Feuchte-Objektträgerkammer wird in einen 37 °C warmen, 5 % CO2 -feuchten Inkubator gestellt. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang, nehmen Sie dann die Feuchtigkeitsobjektträgerkammer aus dem Inkubator und legen Sie sie in einen BSC.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Absaugspitze, um den Überstand vorsichtig aus jeder Vertiefung anzusaugen, und stellen Sie sicher, dass die Zellmonoschicht nicht gestört wird. Verwenden Sie eine sterile Tropfpipette, um einen Tropfen PBS auf jede Vertiefung aufzutragen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die sorgfältige Aspiration, legen Sie dann jeden Objektträger in ein mit PBS gefülltes Coplin-Glas und waschen Sie es zweimal für insgesamt 15 Minuten.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger zurück in die Feuchtigkeitskammer und tragen Sie 50 μl geeignetes Anti-Human-Antikörper-Konjugat auf jede Vertiefung auf. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 bis 4.6.</li>
	<li>Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen, montieren Sie ein Deckglas mit Eindeckmedien und lesen Sie die Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop ab.</li>
</ol>5. Analyse der Objektträger
<ol><li>Einstufung der Proben auf der Grundlage des Färbemusters und der Fluoreszenzintensität im Vergleich zu positiven Kontrollproben mit bestätigtem hohen Antikörpertiter gegen Tollwut.</li>
	<li>Bewerten Sie die Proben auf einer Skala von negativ, 1+, 2+, 3+ und 4+, wobei ein negatives Ergebnis keine Fluoreszenzfärbung zeigt und 4+ eine hellgrüne apfelfarbene Fluoreszenz mit einem Färbemuster ähnlich wie bei positiven Kontrollprobendarstellt 1. HINWEIS: Die Farbe des grünen Apfels gilt nur für FITC-markierte Antikörper. Die Farbe variiert je nach Auswahl des Fluorophors.</li>
	<li>Weisen Sie den Proben einen Endpunktwert zu, der durch den Verdünnungsfaktor dargestellt wird, bei dem die Probe einen Gehalt von 1-2+ aufweist. Testen Sie die Proben mit einem höheren Verdünnungsfaktor, wenn der Endpunkt im ersten Assay nicht erreicht wird.</li>
</ol>

Schneller und frühzeitiger Nachweis von Tollwut-Antikörpern zur Bewertung der Immunantwort bei einem Patienten

<ol><li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Techniques+in+Rabies.+Volume+1%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1.</a> World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).</li>
<li>Moore, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+rabies+serology%3A+defining+context+of+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Challenges of rabies serology: defining context of interpretation.</a> Viruses. 13 (8), 1516(2021).</li>
<li>Zajac, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+rabies+enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29+targeting+IgM+and+IgG+in+human+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera.</a> Viruses. , 40-49 (2019).</li>
<li>Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+antibodies+and+boostability+after+rabies+intradermal+pre-exposure+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Travel+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis.</a> Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+cross-reactions+with+other+viral+encephalitides+in+the+indirect+fluorescent-antibody+test+for+diagnosis+of+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).</li>
<li>Fooks, A. R., Jackson, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFooks%2C+AR+%22Rabies%3A+scientific+basis+of+the+disease+and+its+management%22">Rabies: scientific basis of the disease and its management</a>. , Academic Press. (2020).</li>
<li>Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Chlamydia+pneumoniae-specific+immunoglobulin+A+%28IgA%29+antibodies+by+the+microimmunofluorescence+%28MIF%29+method%3A+comparison+of+seven+fluorescein-labeled+anti-human+IgA+conjugates+in+an+in-house+MIF+test+using+one+commercial+MIF+and+one+enzyme+immunoassay+kit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).</li>
<li>Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+anti-rabies+glycoprotein+antibodies%3A+current+state+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).</li>
<li>Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+of+rabies%3A+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects of rabies: a literature review.</a> Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).</li>
<li>Moore, S. M., Hanlon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies-specific+antibodies%3A+measuring+surrogates+of+protection+against+a+fatal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der IFA-Test nutzt einen Antigen-Antikörper-Komplex, der eine Markierungsstelle zur Visualisierung tollwutspezifischer Antikörper ermöglicht. Neuroblastom- oder BHK-Zellen werden auf PTFE-beschichtete Objektträger mit mehreren Wells gesetzt und mit dem Tollwutvirus-Laborstamm CVS-11 inokuliert. Sobald die Monoschicht konfluiert ist und die Zellen die gewünschte Infektiosität von ca. 50 % erreicht haben, werden die Objektträger bis zur Gebrauchsbereitschaft gelagert6.
Patientenserum oder Liquor wird auf die infizierte Zellmonoschicht aufgetragen und inkubiert, damit sich alle tollwutspezifischen Antikörper an das Virusantigen anheftenkönnen 7. Nach einem Waschvorgang wird ein fluoreszenzmarkierter Anti-Human-IgG- oder IgM-Antikörper appliziert, der an jeden virusgebundenen Antikörper aus der Probenanwendung bindet. Markierte Antikörper können dann unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.
Bei der Vorbereitung auf die Durchführung dieses Assays ist es wichtig, die beste Vorbereitung von Patientenproben, Kontrollen und Konjugaten zu bestimmen. Die ersten Patientenproben wurden mit einem niedrigen Verdünnungsfaktor oder unverdünnt gescreent, um auf das Vorhandensein von Antikörpern zu testen. Gepaarte Proben oder zuvor gescreente Proben, die einen hohen Antikörperspiegel aufwiesen, wurden dann weiter bis zum Endpunkt verdünnt. Die ersten Verdünnungen der Patientenproben für den IgG-Test wurden in einem kommerziell erhältlichen IFA-Verdünnungsmittel hergestellt. Die IgM-Testproben wurden zunächst in einem kommerziell erhältlichen IgG-Blockierungsreagenz hergestellt. Anschließend wurden die seriellen Verdünnungen für beide Tests in PBS hergestellt.
Die für die Testung verwendeten Kontrollen stammten von bekannten Empfängern der Tollwut-PrEP oder von Personen ohne Tollwutimpfung in der Vorgeschichte. Alle Kontrollproben wurden vor der Anwendung auf das Vorhandensein von Antikörpern getestet. Die IgG-Kontrolle wurde von einem Tollwutimpfstoffempfänger mit einem etablierten tollwutneutralisierenden Antikörpertiter erhalten, der von FAVN bestätigt wurde. Die IgM-positive Kontrollprobe wurde ca. 2 Wochen nach Abschluss der Impfung von einem Tollwutimpfstoffempfänger gewonnen.
Die Verwendung eines geeigneten Konjugats ist ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Durchführung des IFA-Tests. Das für jeden Test verwendete Konjugat hängt vom Antikörper-Isotyp-Ziel für diesen Assay ab. In diesem Fall wurden kommerziell erhältliche FITC-markierte Anti-Human-IgG- und Anti-Human-IgM-Antikörper verwendet. Die Verdünnungen der Arbeitsantikörperkonjugate wurden vor dem Test auf der Grundlage der Empfehlung des Herstellers bestimmt.
Es gibt mehrere wichtige Schritte im Verfahren, die eine erfolgreiche Durchführung des IFA-Tests gewährleisten, wobei der vielleicht wichtigste die Vorbereitung der Antigen-Objektträger ist. Das Erreichen einer Infektiosität von ca. 50 % bietet reichlich Bindungsstellen für verfügbare Antikörper und schafft gleichzeitig Klarheit beim Lesen und Bewerten von Proben. Die tollwutnegativen Zellen bilden einen kontrastreichen Hintergrund, um markierte Antikörper besser sichtbar zu machen. Unspezifische Färbungen können auch ein Problem darstellen, wenn die Fluoreszenzfärbung mit komplexen Probenmatrizen, wie z. B. Serum, durchgeführt wird. Die Verwendung von IgG-Inaktivierungsreagenzien (z. B. Gullsorb) trägt dazu bei, die unspezifische Färbung aufgrund von störenden IgG-Antikörpern bei der Beurteilung des Vorhandenseins von IgM8 zu reduzieren. Die richtige Vorbereitung der Materialien und die Einarbeitung spezieller Reagenzien in das Verfahren tragen dazu bei, problematische Färbungen zu verringern und gleichzeitig qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erhalten.
Es wurde eine Vielzahl von Testmethoden entwickelt, die sich auf den Nachweis, die Quantifizierung und die Identifizierung von Tollwut-Antikörpern konzentrieren. Jeder dieser Tests liefert Ergebnisse, die je nach den gesuchten Informationen auf unterschiedliche Weise verwendet werden können. Der Tollwut-IFA-Test ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung virusspezifischer Antikörper-Isotypen, und die Ergebnisse können im Vergleich zu anderen Testmethoden, wie z. B. den RFFIT- und FAVN-Tests, in relativ kurzer Zeit vorliegen.
Der IFA-Test kann zwar Tollwut-Antikörper in einer Probe nachweisen, liefert aber keine standardisierte Quantifizierung der Antikörper. Der IFA-Test liefert einen Serumverdünnungsfaktor, bei dem der Antikörpernachweis endet. Im Vergleich dazu quantifizieren die RFFIT- und FAVN-Tests die neutralisierenden Fähigkeiten von Antikörpern in einer Probe, was zu einem Titer von Internationalen Einheiten (IE) führt, was ein detaillierteres und standardisierteres Ergebnis liefert. Die Ergebnisse eines FAVN- oder RFFIT-Tests zeigen das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern, bei denen es sich um IgG-Antikörper handelt9. Es wird davon ausgegangen, dass die Rolle von IgM bei der neutralisierenden Aktivität aufgrund seiner Struktur begrenzt ist10. Daher weisen diese Tests das Vorhandensein von IgM nicht spezifisch nach.
Die Art des Tests und sein Ergebnis können etwas problematisch sein, wenn sie auf ein bestimmtes Problem angewendet werden. Das Konzept eines schützenden Antikörperschutzes gegen eine Tollwutvirusinfektion wird nicht mehr verwendet, um die Immunantwort auf eine Tollwutimpfung zu bewerten. Zuvor wurde eine Schutzreaktion mit ≥0,5 IE definiert. In aktuellen Veröffentlichungen wird die Antikörperantwort nach der Immunisierung jedoch in der Regel als akzeptabel (≥0,5 IE) oder inakzeptabel (<0,5 IE) bezeichnet. Wie bereits erwähnt, liefert der IFA-Test keinen Antikörpertiter in IE und sollte nicht verwendet werden, um einen Schutz gegen Tollwut abzuleiten. Die Verwendung des IFA-Tests bei der Beurteilung eines Patienten, der an Tollwut erkrankt ist, führt aufgrund von Variationen der Immunantwort während der gesamten Erkrankung möglicherweise nicht immer zu einem positiven Antikörper. Aufgrund der nahezu 100%igen Letalität einer Tollwutinfektion ist es wichtig, den Test zu berücksichtigen und zu berücksichtigen, wie viele Informationen aus diesen Ergebnissen sicher abgeleitet werden können11. Aus diesen Gründen ist es immer am besten, alle Tollwut-Antikörpertestmethoden zu bewerten und festzustellen, welche in einem bestimmten Szenario am besten funktioniert.

Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) dient zum Nachweis verschiedener tollwutspezifischer Antikörper-Isotypen in Seren oder im Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit. Er gehört zu einem Arsenal von Tests, die für die Überwachung eines antemortalen Tollwutpatienten zur Verfügung stehen. Es ist besonders nützlich für die Früherkennung von Antikörpern, um die Immunantwort eines Patienten auf eine Tollwutinfektion zu bewerten. In Verbindung mit anderen Tests, der Anamnese und dem Impfstatus des Patienten kann der IFA-Test bei der Bestimmung der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einem Impfstoff helfen1. Da der IFA-Test IgM und/oder IgG misst, können die Werte des spezifischen Antikörpers einen ungefähren Zeitrahmen von der Exposition gegenüber dem Antigen1 anzeigen. Dieser Test kann in den aufgeführten Anwendungen oder anderen, die noch nicht untersucht wurden, nützlich sein.
Es stehen mehrere serologische Tollwuttests zur Verfügung. Der Fluoreszenz-Fokus-Inhibitions-Schnelltest (RFFIT), der Fluoreszenz-Antikörper-Virus-Neutralisationstest (FAVN) oder deren Modifikationen sind die primären Methoden zur Messung von Tollwutvirus-neutralisierenden Antikörpern (RVNAs)1. Diese Tests unterscheiden jedoch nicht zwischen IgM- und IgG-Antikörpern. Wenn die Differenzierung des Antikörper-Isotyps für die Überwachung der Tollwut-Immunantwort wichtig ist, werden die Tollwut-IFA- und die Tollwut-ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) verwendet, die jedoch keine RVNAs messen. Obwohl die IFA- und ELISA-Tests verwendet werden können, um das Vorhandensein von tollwutspezifischen Antikörpern in einer Probe zu bestimmen, gibt es einige Unterschiede in der Art und Weise, wie sie durchgeführt werden. Der IFA-Test verwendet ein zellkultiviertes lebendes Virus als Antigensubstrat, während ein typischer ELISA für den Tollwutnachweis eines oder mehrere der viralen Proteine verwendet. In einer Laborumgebung, in der das Tollwutvirus kultiviert werden kann, kann der IFA-Test einfacher durchgeführt werden, anstatt einzelne virale Proteine für den ELISA zu kaufen oder zu kultivieren. Der Zweck der Untersuchung und die Informationen, die aus den Ergebnissen eines serologischen Tollwuttests gewonnen werden, sollten bei der Entscheidung berücksichtigt werden, welche zu wählenist 2.
IgM reagiert zuerst und steigt an, bis etwa am 28. Tag ein Klassenwechsel beobachtet wird, an dem IgG zum vorherrschenden zirkulierenden Antikörperwird 3. Daher wäre IgM nur für einen begrenzten Zeitraum nach der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einer Impfung zu erwarten. Die Untersuchung von Serum und Liquor cerebrospinalis (CSF) kann darauf hinweisen, ob die Exposition durch eine Impfung erfolgte, bei der Antikörper nur in Seren zu sehen sind, oder durch eine Virusinfektion, die möglicherweise Antikörper im Liquor1 aufweisen würde.
Es wurde festgestellt, dass Tollwut-Antikörper nach einer Präexpositionsprophylaxe (PrEP) mehrere Jahre persistieren4. Der IFA-Test kann ein nützliches Instrument sein, um dies zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung oder Exposition nachzuweisen.

<table><tbody><tr><td>25x55mm Glasdeckel Slips</td><td>Beliebiges</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Beliebiges</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IgG-markiertes Konjugat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9512</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-IgM-markiertes Konjugat</td><td>SeraCare</td><td>5230-0286</td><td></td></tr><tr><td>Aspirierende Pipettenspitze</td><td>Alle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHK-21-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>BION IFA Verdünnungsmittel</td><td>MBL BION</td><td>DIL-9993</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturwasser</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Coplin Tiegel</td><td>Jedes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fötale Rinderserum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit FITC-Filter</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td>Eindeckmittel</td></tr><tr><td>Gullsorb IgM Inaktivierungsreagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-043-158</td><td>IgG Inaktivierungsreagenz</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7513</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Mindestanzahl an essentiellen Media Eagle &ndash; mit Earle' Salze, L-Glutamin und nicht-essentielle Aminosäuren ohne Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0643</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Maus Neuroblastomzellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Well-PTFE-Beschichtung Glasobjektträger</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Beliebig</td><td></td><td>pH 7,6&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma</td><td>P-3032</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Tollwut Direkt fluoreszierendes Antikörper-Konjugat</td><td>Millipore Sigma</td><td>5100, 5500, 6500, RU5100 oder RU5500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5761</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Natriumchlorid-Kristalle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>Eindeckmittel</td></tr><tr><td>Sterile Pipette</td><td>Beliebig</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfatsalz</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Trizma voreingestellte Kristalle pH 9,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9693</td><td>Eindeckmittel</td></tr><tr><td>Tryptosephosphat Bouillon</td><td>BD</td><td>260300</td><td>EGM</td></tr><tr><td>Vitaminmischung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td>EGM</td></tr></tbody></table>

nachweis von tollwut-igg- und igm-antikörpern mit dem tollwut-test mit indirekten fluoreszierenden tollwut-antikörpern

Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test

Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) wurde entwickelt, um verschiedene tollwutspezifische Antikörper-Isotypen in Seren oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit nachzuweisen. Dieser Test liefert schnelle Ergebnisse und kann zum Nachweis von Tollwut-Antikörpern in verschiedenen Szenarien verwendet werden. Der Tollwut-IFA-Test ist besonders nützlich für den schnellen und frühen Nachweis von Antikörpern, um die Immunantwort bei einem Patienten, der an Tollwut erkrankt ist, zu bewerten. Obwohl andere Methoden zur antemortalen Tollwutdiagnostik Vorrang haben, kann dieser Test verwendet werden, um eine kürzliche Exposition gegenüber dem Tollwutvirus durch Antikörpernachweis nachzuweisen. Der IFA-Test liefert keinen virusneutralisierenden Antikörpertiter (VNA), aber die Reaktion auf die Präexpositionsprophylaxe (PrEP) kann durch positives oder negatives Antikörpervorhandensein bewertet werden. Dieser Test kann in verschiedenen Situationen eingesetzt werden und Ergebnisse für eine Reihe verschiedener Ziele liefern. In dieser Studie verwendeten wir mehrere gepaarte Serumproben von Personen, die PrEP erhielten und ihre Tollwut-Antikörperpräsenz im Laufe der Zeit mit dem IFA-Test nachweisen konnten.

Alle Serumproben wurden den Patienten in etwa gleichen Zeiträumen nach der PrEP entnommen. Die Proben wurden von fünf verschiedenen Patienten zu folgenden Zeitpunkten getestet: 2 Wochen nach der letzten Tollwutimpfung, 6 Monate nach der Tollwutimpfserie und 18 Monate nach der Tollwutimpfserie. Jede Serumprobe wurde nacheinander verdünnt und sowohl für das Vorhandensein von IgM als auch für IgG eingestuft, wie in den Protokollschritten 5.2 und 5.3 beschrieben. Der zugewiesene Antikörperwert stellt den Verdünnungsfaktor dar, bei dem die Probe eine Endpunktnote von 1-2+ erreicht hat.
Die Ergebnisse der Tests zu jedem Zeitpunkt nach der PrEP zeigen, dass der Assay in der Lage ist, unterschiedliche Mengen an Antikörpern nachzuweisen. Kurz nach der Erstimpfung waren in den Patientenproben hohe Konzentrationen sowohl von IgM als auch von IgG vorhanden, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Bereiche mit hellgrün fluoreszierender Zellfärbung weisen auf ein positives Vorhandensein von Antikörpern hin; Erythrozyten sind tollwutnegative Zellen, an die kein Antikörper binden konnte. Etwa 6 Monate nach der Impfung waren in den Patientenproben signifikant niedrigere IgM- und IgG-Spiegel vorhanden, aber IgM war fast vollständig ausgefallen. Zum letzten Zeitpunkt, 18 Monate nach der Impfung, wurden keine IgM-Antikörper in Patientenproben nachgewiesen, wie in Abbildung 2 gezeigt, in der keine grün fluoreszierende Zellfärbung beobachtet wird. Die IgG-Spiegel blieben jedoch bestehen und blieben ähnlich wie die Werte, die zum 6-Monats-Zeitpunkt nach dem anfänglichen Rückgang ab dem 2-Wochen-Zeitpunkt festgestellt wurden. Die Ergebnisse für den IgG- und IgM-Nachweis in Proben 2 Wochen nach der Impfung, 6 Monate nach der Impfung und 18 Monate nach der Impfung sind in Tabelle 1, Tabelle 2 bzw. Tabelle 3 aufgeführt. Abbildung 3 zeigt das Flussdiagramm der Ausführungsphasen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig01.jpg"> Abbildung 1: Tollwut-IgM-IFA-positive Färbung. Das Patientenserum in einer Verdünnung von 1:8 zeigte kurz nach Abschluss der PrEP-Impfserie ein positives Färbemuster. Der Maßstabsbalken auf dem Bild stellt 100 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig02.jpg"> Abbildung 2: Tollwut-IgM-IFA-Negativfärbung. Patientenserum in einer Verdünnung von 1:2 zeigte etwa 18 Monate nach Abschluss der PrEP-Impfserie keine positive Färbung. Der Maßstabsbalken auf dem Bild stellt 100 μm dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65459/65459fig03.jpg"> Abbildung 3: Tollwut-IFA-Flussdiagramm. Flussdiagramm mit den Ausführungsphasen der wichtigsten Schritte des IFA-Verfahrens zur Unterstützung der Prozessvisualisierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65459/65459fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Patienten-Probe</td>
			<td>Igm</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-1</td>
			<td>1:32</td>
			<td>1:512</td>
		</tr><tr><td>PS2-1</td>
			<td>1:8</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-1</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:256</td>
		</tr><tr><td>PS4-1</td>
			<td>1:64</td>
			<td>1:512</td>
		</tr><tr><td>PS5-1</td>
			<td>1:16</td>
			<td>1:128</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Ergebnisse 2 Wochen nach der Impfung. Die Ergebnisse der Patientenproben stammen aus Serumproben, die etwa 2 Wochen nach Abschluss der PrEP-Impfserie entnommen wurden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Patienten-Probe</td>
			<td>Igm</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-2</td>
			<td>1:2</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS2-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS4-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:256</td>
		</tr><tr><td>PS5-2</td>
			<td>1:1</td>
			<td>1:32</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Ergebnisse 6 Monate nach der Impfung. Die Ergebnisse der Patientenproben stammen aus Serumproben, die etwa 6 Monate nach Abschluss der PrEP-Impfserie entnommen wurden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Patienten-Probe</td>
			<td>Igm</td>
			<td>IgG</td>
		</tr><tr><td>PS1-3</td>
			<td>Nicht erkannt</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS2-3</td>
			<td>Nicht erkannt</td>
			<td>1:128</td>
		</tr><tr><td>PS3-3</td>
			<td>Nicht erkannt</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS4-3</td>
			<td>Nicht erkannt</td>
			<td>1:64</td>
		</tr><tr><td>PS5-3</td>
			<td>Nicht erkannt</td>
			<td>1:32</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Ergebnisse 18 Monate nach der Impfung. Die Ergebnisse der Patientenproben stammen aus Serumproben, die etwa 18 Monate nach Abschluss der PrEP-Impfserie entnommen wurden.

Ziel dieses Manuskripts ist es, den Einsatz des indirekten Fluoreszenz-Antikörpertests für Tollwut zum Nachweis von tollwutspezifischen IgG- und IgM-Antikörpern zu untersuchen.

Nachweis von Tollwut-IgG- und IgM-Antikörpern mit dem Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Tollwut-Antikörpern

The rabies indirect fluorescent antibody (IFA) test was developed to detect various rabies-specific antibody isotypes in sera or cerebral spinal fluid. ...

Der IFA-Test beurteilt die Antikörperantwort während einer Tollwutinfektion oder bewertet die Immunantwort von Impfstoffen. Es kann verwendet werden, um das Vorhandensein von Antikörpern in einer Probe festzustellen und zu unterscheiden, welche Antikörper-Isotypen vorhanden sind. Neutralisierende Antikörper-Assays sind der Goldstandard für den Nachweis von Tollwut-Antikörpern zur Bestimmung des Antikörpertiters bei einer Person, die eine Prä- oder Postexpositionsprophylaxe erhalten hat.Obwohl ein IFA-Test andere Ergebnisse liefern kann als ein neutralisierender Antikörper-Assay, kann er dennoch wertvolle Informationen liefern, wenn er als Alternative verwendet wird. In der Regel bewerten Assays, die tollwutneutralisierende Antikörper messen, die Immunantwort. Diese Tests dauern jedoch mehrere Tage und erfordern eine Virus- und Lebendzellkultur.Der IFA-Test ermöglicht eine fortschrittliche Vorbereitung von Antigen-Objektträgern für den Test mit Ergebnissen in wenigen Stunden im Vergleich zu Tagen. Die Verwendung der IFA-Tests bei menschlichen Tollwutfällen kann zu weiteren Antworten darüber führen, wie das Immunsystem einer Person auf eine Tollwutinfektion reagiert. Es gibt große Unterschiede zwischen den Fällen, und dieser Test kann während der Krankheit Ergebnisse in Echtzeit liefern.

detection-rabies-igg-igm-antibodies-using-rabies-indirect-fluorescent

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die immunhistochemische Färbung für den Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen in infiziertem Hirngewebe von Mäusen. Der Prozess umfasst die Entparaffinisierung und Alkoholbehandlung, gefolgt von einer proteolytischen Behandlung, um die Antigenzugänglichkeit zu verbessern. Die immunhistochemische Färbung zeigt rote Ausfällungen, die das Vorhandensein von Tollwutantigenen im Gewebeschnitt bestätigen.

Eine immunhistochemische Färbung zum Nachweis von Tollwutvirus-Antigenen

Der direkte schnelle immunhistochemische Test (DRIT) bietet eine anerkannte Alternative zur direkten fluoreszierenden Antikörper-Diagnose (World Organization for Animal Health and World Health Organization(Who). Dieser Test ermöglicht feldbasierte Anwendungen, die bei Hirnabdrücken mit Hilfe der Lichtmikroskopie in ca. 1 h durchgeführt werden können.

Verbesserte Tollwutüberwachung mit einem direkten schnellen immunhistochemischen Test

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In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

Wir präsentieren ein vollständiges Protokoll zur postmortalen Diagnose von Tiertollwut unter Feldbedingungen mit Hilfe eines schnellen immunchromatographischen diagnostischen Tests (RIDT), von der Probenahme der Hirnbiopsie bis zur endgültigen Interpretation. Wir beschreiben auch weitere Anwendungen mit dem Gerät für molekulare Analyse und virale Genotypisierung.

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Die Synthese von humanen monoklonalen Antikörpern ist der erste Schritt in Studien, die darauf abzielen, die pathophysiologischen Mechanismen von Autoantikörper-vermittelten Immunantworten zu entschlüsseln. Wir haben ein Protokoll zur Erzeugung rekombinanter monoklonaler Immunglobulin G (IgG)-Antikörper aus blutsortierten B-Zellen entwickelt, einschließlich B-Zellisolierung, Antikörperklonierung und In-vitro-Synthese.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung von Proteineinheiten, die Antigene für IgM-Antikörper von Mensch und Maus mit spezifischen Kappa (Vκ) Leichtketten enthalten. Dieses Protokoll ist nicht auf Antikörper der IgM-Klasse beschränkt, sondern gilt für alle Immunglobulin-Isotypen, die bei Immunpräzipitationen mit ausreichend hoher Affinität auf ihr Antigen abzielen.

Antikörper Bindungsspezifität für Kappa (V &amp; kgr;) Leichte Kette enthaltende Human (IgM) Antikörper: Polysialinsäure (PSA) An NCAM als Fallstudie

Wir beschreiben hier eine Methode zur Erzeugung anpassbarer Antigen-Microarrays, die für den gleichzeitigen Nachweis von Serum-IgG- und IgM-Autoantikörpern von Menschen und Mäusen verwendet werden können. Diese Arrays ermöglichen den quantitativen Hochdurchsatznachweis von Antikörpern gegen beliebige Antigene oder Epitope von Interesse.

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Die on-bead-Verfahren zum Nachweis von Antikörpern mit kleinen Molekülen Kennzeichnung ermöglicht die Kennzeichnung von einer geringen Menge an Antikörper direkt aus Zellmedien. Dieses Verfahren ist kompatibel mit Amin und Thiolchemie und kann mehrere Proben parallel, manuell oder mit automatisierten Systemen verarbeiten.

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

Lernen Sie den indirekten fluoreszierenden Antikörpertest (IFA) zur Detektion von Tollwut-spezifischen IgG- und IgM-Antikörpern kennen. Diese Methode ermöglicht eine schnellere Alternative zu neutralisierenden Antikörpertests.

Nachweis von Tollwut-IgG- und IgM-Antikörpern mit dem Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Tollwut-Antikörpern

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