Name: Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Erfahren Sie, wie ein Luciferase-basierter Assay zur Hochdurchsatz-Screening-Identifizierung von ATG4-Inhibitoren für Krebs und neurodegenerative Erkrankungen entwickelt wird. Diese Methode ermöglicht die Überwachung der Protease-Aktivität in Zellen.

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Diese Arbeit wurde durch die Kernfinanzierung des UK Medical Research Council für den MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, den MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (Grant Reference 2018RIF_15) und das UCL Therapeutic Acceleration Support Scheme unterstützt, das durch Mittel aus dem MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054 unterstützt wird. Das Plasmid, das für ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) kodiert, wurde von Dr. Robin Ketteler (Klinik für Humanmedizin, Medizinische Fakultät Berlin) gewonnen.

Hochdurchsatz-Screening-Analyse für 4B-Cystein-Peptidase-Autophagie-Inhibitoren

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt einen zellbasierten Reportergen-Assay zur Identifizierung von ATG4B-Inhibitoren. Die Identifizierung von primären Treffern basiert auf der Luciferase-Aktivität bei der Behandlung von Zellen, die den offenen Leserahmen von LC3B in voller Länge zwischen β-Aktin und dNGLUC exprimieren. Einige Vorteile dieses Assays sind, dass er empfindlich, hochquantitativ und nicht-invasiv ist, da er dNGLUC nachweisen kann, ohne die Zellen zu lysieren. In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll zur Gener...

Autophagie ist ein konservierter Stoffwechselprozess, der es den Zellen ermöglicht, die intrazelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten und auf Stress zu reagieren, indem sie gealterte, defekte oder unnötige Zellinhalte über die Lysosomen abbauen 1,2,3. Unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen fungiert dieser Prozess als entscheidende zelluläre Reaktion auf Nährstoff- und Sauerstoffmangel, was zu recycelten Nährstoffen und Lipiden führt, die es den Zellen ermöglichen, sich an ihre Stoffwechselbedürfnisse anzupassen 2,3,4. Autophagie wurde auch als zelluläre Stressreaktion im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten identifiziert, wie z. B. neurodegenerativen Erkrankungen, Infektionen mit Krankheitserregern und verschiedenen Krebsarten. Die Funktion der Autophagie bei Krebs ist komplex und hängt von der Art, dem Stadium und dem Status des Tumors ab. Es kann die Tumorentstehung durch autophagischen Abbau geschädigter Zellen unterdrücken, aber auch das Überleben fortgeschrittener Tumore fördern, indem es das Überleben der Zellen unter Stressbedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel und zytotoxischen Schäden verbessert 2,4,5,6.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Hemmung der Autophagie einen Nutzen als Antikrebsstrategie bietet. Daher könnte die Hemmung kritischer Schritte, wie z.B. der Autophagosomenbildung oder deren Fusion mit dem Lysosom, eine wirksame Methode zur Krebskontrolle sein 2,4,5,6. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass ATG4B an bestimmten pathologischen Zuständen beteiligt ist, und es hat als potenzielles Ziel gegen Krebs Aufmerksamkeit erregt 2,3,4. So wurde beispielsweise beobachtet, dass kolorektale Krebszellen und humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2)-positive Brustkrebszellen signifikant höhere ATG4B-Expressionsniveaus aufwiesen als benachbarte normale Zellen 2,4. In Prostatakarzinomzellen führte die Hemmung von ATG4B zu einer zelllinienspezifischen Empfindlichkeit gegenüber Chemo- und Strahlentherapie7. In jüngster Zeit gibt es starke Hinweise darauf, dass das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) besonders anfällig für eine ATG4B-Hemmung ist. In einem gentechnisch veränderten Mausmodell konnte beispielsweise gezeigt werden, dass ein intermittierender Verlust der ATG4B-Funktion das Wachstum von PDAC-Tumoren reduziert und das Überleben verlängert 3,4. Insgesamt ist ATG4B bei einigen Krebsarten stark überexprimiert, hängt mit dem Fortschreiten des Tumors zusammen und ist mit der Resistenz gegen Krebstherapien verbunden 2,4,8.
Die ATG4-Cystein-Proteasen in Säugetieren haben vier Familienmitglieder, ATG4A-ATG4D. Diese Proteine weisen eine gewisse Zielselektivität gegenüber der LC3/GABARAP (ATG8)-Proteinfamilie 9,10,11 auf und können zusätzliche Funktionen haben, die nicht mit ihrer Proteaseaktivität verbunden sind 12,13. Darüber hinaus reguliert ATG4 eine neuartige posttranslationale Modifikation, die ATG8-Ylierung von Proteinen11,12. Während ATG4B und sein Hauptsubstrat LC3B am besten untersucht sind, zeichnet sich ein Bild ab, das auf eine komplexe Rolle jedes Mitglieds der Unterfamilie bei der Regulation autophagischer und nicht-autophagischer Prozesse hindeutet. Dies wird durch ein komplexes Netzwerk von posttranslationalen Modifikationen bestätigt, die die ATG4B-Aktivität über Phosphorylierung, Acetylierung, Glykosylierung und Nitrosylierung regulieren 9,10,11,12,13.
Mehrere bekannte ATG4B-Inhibitoren wurden veröffentlicht 2,4,14,15. Diese eignen sich zwar als Forschungsinstrumente, aber ihr pharmakodynamisches Profil, ihre Selektivität oder ihre Wirksamkeit haben sie bisher von der Entwicklung als präklinische Kandidaten ausgeschlossen 4,16. Insgesamt besteht ein dringender Bedarf, wirksamere und selektivere Verbindungen zu identifizieren. Oft sind die Verbindungen gute biochemische Inhibitoren der Proteinfunktion, aber ihre Wirksamkeit in zellbasierten Assays ist schlecht. Es gibt mehrere Assays zur Überwachung der ATG4B-Aktivität, darunter biochemische Methoden und zellbasierte Assays4. Wir haben zuvor einen einfachen, Lumineszenz-basierten Hochdurchsatz-Assay zur Überwachung der ATG4B-Aktivität in Zellen entwickelt 8,17. Dieser Assay verwendet ein Luciferase-Protein aus Gaussia princeps (GLUC), das im extrazellulären Milieu stabil und aktiv ist und als Reaktion auf die proteolytische Aktivität von ATG4B induzierbar aus Zellen freigesetzt werden kann18,19.
In diesem Reporterkonstrukt ist dNGLUC mit dem Aktin-Zytoskelett von Zellen verbunden. Ein proteasespezifischer Linker kann zwischen dem β-Aktin-Anker und dNGLUC eingeführt werden, wodurch das Sekret von der Spaltung des Linkers abhängig wird. Wir haben den offenen Leserahmen von LC3B in voller Länge zwischen β-Aktin und dNGLUC verwendet, um die LC3B-Spaltung 17,18,19 überwachen zu können. Obwohl der Sekretionsmechanismus von dNGLUC nur unzureichend verstanden ist, ist er spezifisch für die Überwachung der ATG4B-Aktivität, hängt nicht von der allgemeinen Autophagie ab, wie sie in ATG5-Knockout-Zellen auftritt, und wird durch unkonventionelle Mechanismen vermittelt, die kein klassisches Signalpeptidbenötigen 4,18,19. Wir haben diesen Reporter erfolgreich verwendet, um kleine Moleküle und siRNA-Bibliotheken zu screenen und neue Regulatoren der ATG4B-Aktivität zu identifizieren, wie z.B. die Akt-Proteinkinasen8. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung dieses Luciferase-Reporters in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format beschrieben.

<table><tbody><tr><td>50 & Mikro; L Einwegspitzen - ungefiltert, rein, verschachtelt 8 Stapel (passiver Stapel)</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>Einweg-Rack mit 96 Spitzen</td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek Bulk</td><td>Dispenser</td>Coelenterazin Santa Cruz <td></td></tr><tr><td></td><td>Biotechnologie</td><td>sc-205904</td><td>Substrat</td></tr><tr><td>Columbus Bildanalysesoftware</td><td>Perkin Elmer</td><td>Version 2.9.1</td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Echo-qualifizierte 384-Well-Mikroplatte aus Polypropylen, klar, unsteril</td><td>Beckman Coulter</td><td>001-14555</td><td>384PP</td></tr><tr><td>Platte EnVision II</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Lumineszenzplattenleser</td></tr><tr><td>Express Pick Library (96 Well)-L3600-Z369949-100 & Mikro; L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 384 Well Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>solid-black 384 Well</td></tr><tr><td>Platten Harmony Imaging Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Version 5.1</td><td>Imaging Software</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat - 10 mg/mL Lösung in Wasser</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo 550 Serie mit Echo Cherry Pick-Software</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td><td>nanoskaliger akustischer Flüssigkeitsspender</td></tr><tr><td>Milli-Q Wasser</td><td></td><td></td><td>deionisiertes Wasser</td></tr><tr><td>Opera Phenix High-Content Screening System</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>automatisiertes Mikroskop</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Lösung 4% in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384-well, schwarz, optisch klarer Flachboden, mit Gewebekultur behandelt, Deckel</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>Gewonnen von Dr. Robin Ketteler (Klinik für Humanmedizin, Medizinische Fakultät Berlin)</td></tr><tr><td>Polybrene Infektion / Transfektion Reagenz</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>Polybren</td></tr><tr><td>Puromycin-Dihydrochlorid, 98%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Puromycin</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 Roboter</td><td>Tecan</td><td></td><td>Liquid-Handling-Roboterplattform</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA-Transfektionsreagenz Roche</td><td>Merck</td> 6366244001 <td>DNA-Transfektionsreagenz</td><td></td></tr></tbody></table>

zellbasiertes wirkstoff-screening auf inhibitoren der autophagie-verwandten 4b-cystein-peptidase

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass ein hoher autophagischer Fluss mit dem Fortschreiten des Tumors und der Resistenz gegen die Krebstherapie zusammenhängt. Der Nachweis einzelner Autophagie-Proteine ist eine Voraussetzung für therapeutische Strategien, die auf diesen Signalweg abzielen. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der Autophagie-Protease ATG4B das Gesamtüberleben erhöht, was darauf hindeutet, dass ATG4B ein potenzielles Angriffsziel für die Krebstherapie sein könnte. Unser Labor hat einen selektiven Luciferase-basierten Assay zur Überwachung der ATG4B-Aktivität in Zellen entwickelt. Für diesen Assay wird das Substrat von ATG4B, LC3B, am C-Terminus mit einer sekretierbaren Luciferase aus dem marinen Ruderfußkrebs Gaussia princeps (GLUC) markiert. Dieser Reporter ist mit dem Aktin-Zytoskelett verbunden, so dass es im Zytoplasma der Zellen verbleibt, wenn es unverschlossen ist. Die ATG4B-vermittelte Spaltung führt zur Freisetzung von GLUC durch unkonventionelle Sekretion, die dann durch die Ernte von Überständen aus Zellkulturen als Korrelat der zellulären ATG4B-Aktivität überwacht werden kann. In diesem Artikel wird die Anpassung dieses Luciferase-basierten Assays an das automatisierte Hochdurchsatz-Screening vorgestellt. Wir beschreiben den Workflow und die Optimierung für eine beispielhafte Hochdurchsatzanalyse der zellulären ATG4B-Aktivität.

In einer früheren Veröffentlichung8 haben wir diesen Assay erfolgreich zum Screening von niedermolekularen und siRNA-Bibliotheken eingesetzt und neue Regulatoren von ATG4B identifiziert. Hier beschreiben wir das Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse dieses Luciferase-Reporters in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format. Abbildung 8 zeigt ein Beispiel für die Rohdatenanalyse sowohl für Zellkerne als auch für Lumineszenz. Ein typisches Ergebnis ein...

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Luciferase-basierten Reporter-Assays in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format.

Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

Das Hauptziel der Forschung in meinem Labor ist es, die Regulation der Autophagie und insbesondere des ATG4-Cystein-Proteans zu verstehen und dieses Wissen zu nutzen, um niedermolekulare Inhibitoren zu entwickeln, die auf diesen Signalweg insbesondere bei Krankheiten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs abzielen. Wir verwenden High-Content-Hochdurchsatz-Screening-Technologien, um Wirkstoffziele sowie Wirkstoffkandidaten zu identifizieren, und wir konzentrieren uns auf die ATG4-Cystein-Protease-Familie, weil wir glauben, dass sie ein sehr gutes Ziel für verschiedene Krebsarten ist. Wir beschäftigen uns schon seit geraumer Zeit mit den Mitgliedern der ATG4-Familie.Wir haben bedeutende Entdeckungen über die Dysfunktion dieser Proteinfamilie und der Zellen gemacht. Wir haben auch neue posttranslationale Mechanismen der Regulation der Mitglieder der ATG4-Familie identifiziert und entwickeln derzeit niedermolekulare Inhibitoren und auch Aktivatoren der ATG4-Familien für Krankheiten wie Krebs und Neurodegeneration. Es gibt nicht viele Assays, um die ATG4-Proteaseaktivität in Zellen zu überwachen.Daher waren wir einer der ersten, der einen Luziferase-basierten Assay entwickelte, um diese Aktivität zu überwachen. Und unser Assay ist ziemlich ungewöhnlich, weil er sezernierte, sagen wir Phrasen, verwendet, daher müssen wir die Zellen nicht lizenzieren und wir können dieses Protokoll leicht an Hochdurchsatz-Screening-Methoden und Laborautomatisierung anpassen. Wir beschäftigen uns seit geraumer Zeit mit der ATG4-B-Proteinprotease.Wir haben Knockout-Zelllinien der ATG4-Familie erzeugt. Wir haben neue posttranslationale Regulationsmechanismen von ATG4 identifiziert, und letztendlich haben wir auch mehrere neuartige niedermolekulare Verbindungen identifiziert, die die ATG4-B-Protease hemmen und sogar aktivieren könnten. In Zukunft möchten wir unsere Arbeit an den Mitgliedern der ATG4-Familie fortsetzen.Wir denken, dass das eine ganze Menge ist, was derzeit unbekannt ist und noch aufgedeckt werden muss. Wie diese Proteine beispielsweise die Autophagie in Nervenzellen regulieren, ist derzeit noch völlig unklar. Wir möchten unsere Arbeit auch auf die Validierung dieser von uns identifizierten niedermolekularen Verbindungen konzentrieren und möglicherweise Aktivatoren bei neurodegenerativen Erkrankungen einsetzen.

cell-based-drug-screening-for-inhibitors-autophagy-related-4b

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Forschung

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Biologie

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Um Krankheitserreger Verbreitung entgegenzuwirken, Wirtszellen neu zu organisieren, um Bakterien ihre Zellskelett compartmentalize und induzieren Autophagie. Verwendung Shigella Infektion von Gewebekulturzellen, Wirt und Pathogen Determinanten dieses Verfahren zugrunde liegen, werden identifiziert und charakterisiert. Mit Zebrafisch-Modelle von Shigella-Infektion, sind die Rolle der entdeckten Moleküle und Mechanismen in vivo untersucht.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Präsentiert hier sind zwei Antikörper-basierten Proteinprotein Interaktion Forschungstechniken: Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation. Diese Techniken eignen sich für das Studium der physikalischer Wechselwirkungen zwischen Proteinen für die Entdeckung der neuartige Komponenten der zelluläre Signalwege und Proteindynamik Verständnis.<br...

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

Mitophagy, den Prozess der Clearing beschädigt Mitochondrien ist für mitochondriale Homöostase und Gesundheit Wartung notwendig. Dieser Artikel stellt einige der neuesten Mitophagy Nachweismethoden in menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegansund Mäuse.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Dieses Papier verwendet ein Flow-Zytometrie-based Assays auf Bildschirm Bibliotheken chemische Inhibitoren für die Identifizierung von Inhibitoren und ihre Ziele, die T-Zell-Rezeptor Signalisierung beeinflussen. Die hier beschriebenen Methoden können auch für Hochdurchsatz-Screenings erweitert werden.

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

Ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von selbstzusammengesetzten menschlichen Proteinmikroarrays zum Screening von Kinase-Inhibitoren wird vorgestellt.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

In dieser Studie präsentieren wir inhibitor- und siRNA-basierte Strategien, um den autophagischen Fluss in Herpes simplex Virus Typ-1 (HSV-1)-infizierten monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen zu stören.

siRNA Elektroporation zur Modulation der Autophagie bei Herpes Simplex Virus Typ 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.

Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz

Erfahren Sie, wie ein Luciferase-basierter Assay zur Hochdurchsatz-Screening-Identifizierung von ATG4-Inhibitoren für Krebs und neurodegenerative Erkrankungen entwickelt wird. Diese Methode ermöglicht die Überwachung der Protease-Aktivität in Zellen.

Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase

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