Zellbasiertes Wirkstoff-Screening auf Inhibitoren der Autophagie-verwandten 4B-Cystein-Peptidase
June 30th, 2023
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Luciferase-basierten Reporter-Assays in einem halbautomatischen Hochdurchsatz-Screening-Format.
Das Hauptziel der Forschung in meinem Labor ist es, die Regulation der Autophagie und insbesondere des ATG4-Cystein-Proteans zu verstehen und dieses Wissen zu nutzen, um niedermolekulare Inhibitoren zu entwickeln, die auf diesen Signalweg insbesondere bei Krankheiten wie Bauchspeicheldrüsenkrebs abzielen. Wir verwenden High-Content-Hochdurchsatz-Screening-Technologien, um Wirkstoffziele sowie Wirkstoffkandidaten zu identifizieren, und wir konzentrieren uns auf die ATG4-Cystein-Protease-Familie, weil wir glauben, dass sie ein sehr gutes Ziel für verschiedene Krebsarten ist. Wir beschäftigen uns schon seit geraumer Zeit mit den Mitgliedern der ATG4-Familie.
Wir haben bedeutende Entdeckungen über die Dysfunktion dieser Proteinfamilie und der Zellen gemacht. Wir haben auch neue posttranslationale Mechanismen der Regulation der Mitglieder der ATG4-Familie identifiziert und entwickeln derzeit niedermolekulare Inhibitoren und auch Aktivatoren der ATG4-Familien für Krankheiten wie Krebs und Neurodegeneration. Es gibt nicht viele Assays, um die ATG4-Proteaseaktivität in Zellen zu überwachen.
Daher waren wir einer der ersten, der einen Luziferase-basierten Assay entwickelte, um diese Aktivität zu überwachen. Und unser Assay ist ziemlich ungewöhnlich, weil er sezernierte, sagen wir Phrasen, verwendet, daher müssen wir die Zellen nicht lizenzieren und wir können dieses Protokoll leicht an Hochdurchsatz-Screening-Methoden und Laborautomatisierung anpassen. Wir beschäftigen uns seit geraumer Zeit mit der ATG4-B-Proteinprotease.
Wir haben Knockout-Zelllinien der ATG4-Familie erzeugt. Wir haben neue posttranslationale Regulationsmechanismen von ATG4 identifiziert, und letztendlich haben wir auch mehrere neuartige niedermolekulare Verbindungen identifiziert, die die ATG4-B-Protease hemmen und sogar aktivieren könnten. In Zukunft möchten wir unsere Arbeit an den Mitgliedern der ATG4-Familie fortsetzen.
Wir denken, dass das eine ganze Menge ist, was derzeit unbekannt ist und noch aufgedeckt werden muss. Wie diese Proteine beispielsweise die Autophagie in Nervenzellen regulieren, ist derzeit noch völlig unklar. Wir möchten unsere Arbeit auch auf die Validierung dieser von uns identifizierten niedermolekularen Verbindungen konzentrieren und möglicherweise Aktivatoren bei neurodegenerativen Erkrankungen einsetzen.
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Überblick
Diese Studie konzentriert sich auf die Regulation der Autophagie, insbesondere die Rolle der ATG4 Cystein-Protease-Familie bei Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen. Die Forscher entwickelten einen luciferase-basierten Test zur Überwachung der ATG4-Aktivität und passten ihn für Hochdurchsatz-Screening an, was bei der Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren hilft.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Regulation der Autophagie
- Krebsforschung
- Neurodegenerative Erkrankungen
Hintergrund
- Die ATG4 Protease-Familie gilt als vielversprechendes Ziel für verschiedene Krebsarten.
- Es gibt begrenzte Tests zur Überwachung der ATG4 Protease-Aktivität in Zellen.
- Das Verständnis der post-translationalen Regulation von ATG4 ist entscheidend für die therapeutische Entwicklung.
Verwendete Methoden
- Luciferase-basierte Reporter-Assays
- Zelllinien mit Knockout-Mutationen der ATG4-Familienmitglieder
- Hochinhaltliche Hochdurchsatz-Screening-Technologien
Hauptergebnisse
- Erhebliche Entdeckungen bezüglich der Dysfunktion von ATG4-Familie-Proteinen in Zellen.
- Identifizierung neuartiger niedermolekularer Verbindungen, die die ATG4 B Protease hemmen oder aktivieren.
- Validierte post-translationale Regulatormechanismen von ATG4.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet eine Grundlage für weitere Untersuchungen von ATG4 bei der Regulierung der Autophagie.
- Die Ergebnisse könnten zu neuen therapeutischen Ansätzen für Krankheiten führen, die mit einer Autophagie-Dysfunktion verbunden sind.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-throughput, cell-based screening for ATG4B inhibitors addresses a critical need in oncology drug discovery by enabling functional target validation of autophagy modulation. The luciferase-based assay provides a scalable, quantitative platform for identifying and triaging small molecule modulators of ATG4B, directly impacting early-stage portfolio decisions. This approach supports predictive confidence in target engagement and mechanistic de-risking for cancer and neurodegeneration pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of ATG4B function in live-cell systems for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying protease activity in disease-relevant models.
- Facilitates prioritization of autophagy-related targets based on functional readouts.
Screening & Assay Development
- Delivers a robust, luciferase-based assay adaptable to high-throughput screening platforms.
- Provides quantitative, reproducible outputs for compound triage and hit validation.
- Streamlines assay standardization and scalability for large-scale screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant autophagy pathways implicated in cancer and neurodegeneration.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation of ATG4B modulators.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates with validated mechanism of action.
Pipeline & Workflow Integration
This luciferase-based assay integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification and preclinical evaluation of autophagy modulators.
- Discovery Biology: Quantifies ATG4B activity to support hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative readouts for comparative analysis of inhibitor efficacy.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by enabling functional validation in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for screening both inhibitors and activators across autophagy-related targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in ATG4B as a therapeutic target and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of screening workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of autophagy-targeted candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell-based assay development and autophagy biology.
- Needs access to high-throughput screening instrumentation and luciferase detection systems.
- Demands cross-team standardization for assay protocols and data analysis.
- May require adaptation for different cell types or disease models.
- Dependent on robust controls to ensure specificity for ATG4B activity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
3:18
Autophagy Protease Tag‐Compound Addition and Cellular Supernatant Harvest for Drug Screening
5:01
Luciferase Assay for the Detection of Autophagy Protease ATG4B
7:12
Image Acquisition and Analysis for the Detection of Autophagy Protease ATG4B Using Luciferase Assay
