Duale Immunfluoreszenz von γH2AX und 53BP1 in humanen peripheren Lymphozyten
14. Juli 2023
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch den gleichzeitigen Nachweis von γH2AX- und 53BP1-Foci in Interphasenkernen von Bleomycin-behandelten humanen peripheren Lymphozyten dar.
Das Ziel dieses Manuskripts war es, die Eignung der simultanen Quantifizierung von Gamma H2AX und 53BP1 Foci zu evaluieren, um die genomische Schädigung zu beurteilen, die in humanen peripheren Lymphozyten durch Bleomycin induziert wird. Mehrere Faktoren können Doppelstrangbrüche verursachen. Die Zellen verfügen somit über mehrere Reparaturmechanismen, an denen sowohl Gamma H2AX als auch das 53 Binding Protein 1 beteiligt sind, die in der Nähe des Doppelstrangbruchs kolokalisieren können.
Nach der Entnahme von Vollblutproben werden 300 Mikroliter der Probe in ein Röhrchen mit 4,7 Millilitern Komplettmedium gegeben. Fügen Sie dann fünf Mikrogramm pro Milliliter Bleomycinsulfat-Endkonzentration hinzu. Richten Sie für jede Probe eine Negativkontrolle ein.
Stecken Sie das Röhrchen für zwei Stunden in einen Thermostat bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben bei 540 G für fünf Minuten. Fügen Sie dann fünf Milliliter hypotone Lösung zum Pellet hinzu.
Fügen Sie dann 400 Mikroliter präfixative Lösung hinzu, um eine Hämolyse zu bewirken. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 540 g und resuspendieren Sie dann das Pellet in fünf Millilitern Methanol bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten, um die Zellen zu fixieren. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 540 g und resuspendieren Sie das Pellet dann in fünf Millilitern Fixierlösung.
Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Zentrifugieren Sie erneut fünf Minuten lang bei 540 g und saugen Sie dann den Überstand an, so dass genügend Lösung übrig bleibt, um das Pellet zu resuspendieren. Lassen Sie das resuspendierte Zellpellet auf die Objektträger fallen.
Bereiten Sie die beiden Lösungen vor, die die in Blockierlösung gelösten Anti-Gamma-H2AX- und Anti-53BP1-Primärantikörper enthalten. Waschen Sie dann die Objektträger zweimal in PBS 1X. Bewahren Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang in Blockierlösung auf.
Fügen Sie jedem Objektträger 10 Mikroliter jeder der beiden Lösungen hinzu, die die in der Blockierungslösung gelösten Primärantikörper enthalten. Decken Sie die Dias mit Parafilm ab. Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.
Führen Sie nach der Inkubation drei Waschgänge in PBS 1X für fünf Minuten durch. Bereiten Sie die beiden Lösungen vor, die die in Blockierlösung gelösten Sekundärantikörper DyLight 488 und Alexa Fluor 568 enthalten. Fügen Sie dann zu jedem Objektträger 10 Mikroliter jeder der beiden Lösungen hinzu, die die in Blockierlösung gelösten Sekundärantikörper enthalten.
Decken Sie die Objektträger mit Parafilm ab und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach dieser zweiten Inkubation führen Sie drei Waschgänge in PBS 1X für fünf Minuten durch. Fügen Sie vor dem Zusammenbau 2,5 Mikroliter Antifade-Lösung mit DAPI auf die Deckgläser hinzu, um der Verfärbung der Kerne entgegenzuwirken.
Um die Herdkinetik beurteilen zu können, ist die Vorgehensweise die gleiche wie jetzt beschrieben. Die letzte Phase ist die Beobachtung und Quantifizierung der Herde. Humane Lymphozyten ohne Gamma-H2AX- und 53BP1-Herd sind in A, in B und in C sind humane Lymphozyten mit unterschiedlichen Mengen an Gamma-H2AX- und 53BP1-Foci dargestellt.
Es wird eine geringe Kolokalisation der Herde beobachtet. Erwartungsgemäß wird eine sehr höhere Häufigkeit von Gamma H2AX- und 53BP1-Foci zwischen unbehandelten unbehandelten Zellen beobachtet. Auch in der Anzahl der Brennpunkte der beiden Marker ist ein großer Unterschied zu beobachten.
Der zeitliche Verlauf von Gamma H2AX und 53BP1 Foci über die Zeit zeigte ein unterschiedliches Verhalten, obwohl sie zur gleichen Funktion beitragen. Die Gamma-H2AX- und 53BP1-Foci-Analyse ist in der Lage, die zelluläre Reaktion entweder in Expositions- oder pathologischen Kontexten zu bewerten. Die duale Immunfluoreszenz von Gamma H2AX und 53BP1 kann jedoch dazu führen, dass die tatsächliche Häufigkeit des Ereignisses unterschätzt wird.
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Übersicht
Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch die simultane Detektion von γH2AX- und 53BP1-Foci in interphasenkern menschlicher peripherer Lymphozyten nach Behandlung mit Bleomycin vor.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Genomik
Hintergrund
- Doppelstrangbrüche können durch verschiedene Faktoren induziert werden.
- Zellen verfügen über mehrere Reparaturmechanismen für DNA-Schäden.
- γH2AX und 53BP1 sind Schlüsselproteine, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind.
- Die Ko-Lokalisation dieser Proteine erfolgt in der Nähe von Doppelstrangbrüchen.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Eignung zur simultanen Quantifizierung von γH2AX- und 53BP1-Foci.
- Bewertung des genomischen Schadens in humanen peripheren Lymphozyten.
- Verständnis der Wirkung von Bleomycin auf die DNA-Integrität.
Verwendete Methoden
- Ganze Blutproben werden von menschlichen Probanden entnommen.
- Die Proben werden mit Bleomycin-Sulfat behandelt.
- Negative Kontrollen werden zur Vergleichsberechnung eingerichtet.
- Die Detektion von γH2AX- und 53BP1-Foci erfolgt in Interphase-Kernen.
Hauptergebnisse
- Die gleichzeitige Detektion von γH2AX- und 53BP1-Foci ist möglich.
- Eine Behandlung mit Bleomycin führt zu messbarem DNS-Schaden.
- Die Quantifizierung der Foci korreliert mit dem Ausmaß des genomischen Schadens.
- Die Ergebnisse unterstützen die Anwendung dieser Methode zur Beurteilung von DNS-Reparaturmechanismen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bewertet effektiv die Bildung und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen.
- Die gleichzeitige Detektion von γH2AX und 53BP1 liefert wertvolle Erkenntnisse.
- Diese Methode kann auf verschiedene Studien zum DNA-Schaden und zur DNA-Reparatur angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Detektion der DNA-Doppelstrangbruch-(DSB-)Marker γH2AX und 53BP1 in humanen Lymphozyten ermöglicht eine präzise Beurteilung genomischer Schäden und der Reparaturkinetik. Dieser duale immunfluoreszenzbasierte Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der frühen genotoxikologischen Bildschirmung und der mechanistischen Risikominderung für Kandidatenverbindungen. Die Integration dieser Messgrößen im Entdeckungsstadium unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen und die translationale Kontinuität.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung von DNA-Schadensantwortwegen in menschlichen Zellen.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung durch Quantifizierung der DSB-Induktion und Reparaturkinetik.
- Erleichtert die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an der Genomstabilität beteiligt sind.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit bezüglich genotoxischer Risiken bei Leitverbindungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes System zur Quantifizierung von DNA-Schadensmarkern in primären humanen Zellen.
- Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Messungen von durch Verbindungen induzierten Doppelstrangbrüchen (DSBs).
- Unterstützt die Standardisierung von Assays für die hochinhaltsbasierte Bildanalyse von DNA-Schadensmodulatoren.
- Erleichtert eine zuverlässige Bewertung der Sicherheitsprofile von Verbindungen in frühen Screening-Phasen.
Translationale und präklinische Forschung
- Korrigiert die Quantifizierung von DNA-Schadensmarkern mit translationalen Biomarker-Strategien.
- Unterstützt die Kontinuität von der In-vitro-Entdeckung bis zur präklinischen Sicherheitsbewertung.
- Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Kandidaten mit günstigen DNA-Reparaturprofilen.
- Ermöglicht Einblicke in die zellulären Reaktionen, die für Krankheiten und Therapien von Bedeutung sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese duale Immunfluoreszenzmethode ist in den Bereich von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Phase einzuordnen und ermöglicht eine hypothesengetriebene Beurteilung von DNA-Schäden und deren Reparatur in humanen Lymphozyten.
- Entdeckungsbiochemie: Quantifiziert DSB-Marker-Foci, um die Beteiligung von DNA-Reparaturwegen und die biologische Risikominderung zu klären.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur genotoxischen Profilierung von Verbindungen.
- Analytik: Ermöglicht zeitliche Messungen von γH2AX- und 53BP1-Foci zur vergleichenden Analyse.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Biomarker-Strategien für die DNA-Schadensantwort.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Beurteilung von DNA-Schäden über verschiedene Entdeckungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Bewertung von DNA-Schäden.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Quantifizierung von DSB-Markern hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und reduziert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien hinsichtlich Genotoxizität.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf DNA-Reparaturprofilen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Immunfluoreszenzmikroskopie und der quantitativen Bildanalyse.
- Benötigt Zugang zu validierten Antikörpern und einer Infrastruktur für die Fluoreszenzbildgebung.
- Setzt eine standardisierte Probenpräparation und Quantifizierungsprotokolle über Teamgrenzen hinweg voraus.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Zelltypen oder Modellsysteme erforderlich.
- Die tatsächliche Häufigkeit von Doppelstrangbrüchen könnte aufgrund von Einschränkungen bei der Markerkokalisation unterschätzt werden.
