Name: In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung endothelialer Zellen aus humanen iPS-Zellen und deren mechanische Stimulation in einem Fluid-Chip. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Mechanobiologie in einer kontrollierten Umgebung.

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Diese Arbeit wurde durch den Research Advanced Grant 2021 der European Hematology Association, den Global Research Award 2021 der American Society of Hematology und den Internal Strategy Support Fund ISSF3 unterstützt, der vom Welcome Trust und der University of Edinburgh finanziert wird. Wir danken Fiona Rossi von der Flow Cytometry Facility für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie-Analyse. Zum Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die aus dieser Einreichung hervorgeht.

Differenzierung und mechanische Stimulation von hiPSC-abgeleiteten Endothelzellen

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Das Protokoll, das wir hier beschreiben, ermöglicht die Generierung mechanosensitiver Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen und die Untersuchung ihrer Reaktion auf mechanische Stimulation, die durch kontrollierten Scherstress vermittelt wird. Dieses Protokoll basiert vollständig auf Zytokinen und ist vollständig kompatibel mit GMP-Reagenzien für eine mögliche Translation in die Produktion von Zellen für die Zelltherapie.
Die Ableitung von hiPS-Zellen bietet Wissenschaftlern ein instrumentelles Modell für die frühen Stadien der Embryonalentwicklung, das es ermöglicht, Prozesse zu untersuchen, die sonst in vivo nur schwer zu untersuchen sind 24. Tatsächlich werden menschliche embryonale Gewebe, die für die Forschung zur Verfügung stehen, von Embryonen gesammelt, denen die Durchblutung fehlt, und dies könnte einen erheblichen Einfluss auf die molekulare Signatur haben, die durch mechanische Signale gesteuert wird. Der hier beschriebene Ansatz ermöglicht Live-Bildgebung und Echtzeit-Untersuchung der Zellantwort auf Scherspannung. Die Kombination von hiPS-Zellen mit Fluidik bietet ein Studienmodell, das die begrenzte Verfügbarkeit und Unzugänglichkeit des sich entwickelnden fetalen Gewebes überwindet, wenn die Initiierung der Zirkulation die Etablierung des Herz-Kreislauf- und Blutsystems umgestaltet und steuert 3,9,10,25.
Eine Einschränkung des Protokolls besteht darin, dass die aus diesem Protokoll abgeleiteten Endothelzellen möglicherweise nicht die verschiedenen Identitäten verschiedener Endothelzellen widerspiegeln, die in den sich entwickelnden Geweben vorhanden sind. Um diese Einschränkung zu überwinden, könnte eine spezifische Kombination von Zytokinen während des Differenzierungsprozesses vor der fluidischen Stimulation erforderlich sein, um die gewünschte Identität oder den gewebespezifischen Phänotyp zu erhalten26. Die Isolierung von endothelialen Untergruppen kann mit einem verfeinerten Immunphänotyp während des Isolierungsschritts erreicht werden. Dieses Protokoll isoliert Endothelzellen nur auf der Grundlage der Expression von CD34 und ermöglicht so eine Säulenisolierung anstelle der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS). Dadurch werden der Zelltod und das Risiko einer Kontamination reduziert. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll speziell entwickelt, um die Rolle der Scherspannung zu untersuchen, die durch laminare Strömung vermittelt wird. Alternative strömungstechnische Ansätze müssen eingesetzt werden, um die Auswirkungen anderer mechanischer Signale wie Dehnung oder Kompression oder anderer Arten von Strömungen wie gestörter oder gestörter Strömung zu untersuchen.
Wir haben bereits gezeigt, dass iPSC-abgeleitete Endothelzellen die heterogenen arteriovenösen zellulären Identitäten27 nachahmen, ähnlich denen, die in der fetalen dorsalen Aorta beobachtet wurden28,29,30. Dies ist von besonderer Bedeutung im Zusammenhang mit der Gefäßentwicklung und der zellulären Spezifizierung, von der bekannt ist, dass sie durch den Blutkreislauf gesteuert wird. Studien in verschiedenen Modellen zeigten, dass mangelnde Durchblutung zu einer veränderten arteriovenösen Spezifikation führt11,14,31. Die Mechanismen, die mechanische Signale mit der Zellspezifikation verbinden, sind noch unbekannt, und die hier beschriebene Pipeline ermöglicht verfeinerte funktionelle Studien, die in vivo nicht getestet werden konnten.
Diese Pipeline beschreibt die Produktion und Stimulation von Endothelzellen, die aus hiPSCs gewonnen werden, unter Verwendung kommerziell erhältlicher fluidischer Kanäle, wodurch die Notwendigkeit eines Gießens der Bauelemente wie bei den weit verbreiteten Polydimethylsiloxan-Bauelementen (PDMS) vermieden wird12. Darüber hinaus macht die Verwendung von PDMS-Chips die Entnahme der stimulierten Zellen besonders schwierig, während mit diesem Protokoll die Zellen leicht aus dem Kanal entnommen werden können. Dies verbessert die analytische Aussagekraft erheblich und ermöglicht nachfolgende Analysen wie Proteom- und Transkriptomanalysen, Durchflusszytometrie und funktionelle Assays, die möglicherweise weitere Kultur- oder In-vivo-Assays erfordern.

Während der Embryonalentwicklung ist das Herz das erste Organ, das die Funktionalität1 entwickelt, mit nachweisbaren Kontraktionen ab dem frühesten Stadium der Endokardtubenbildung2. Die Durchblutung steuert zusammen mit den mechanischen Reizen, die durch den Blutfluss innerhalb des Gefäßes vermittelt werden, viele entscheidende Aspekte der frühen Entwicklung. Vor der Etablierung des fetalen Kreislaufs ist das Gefäßsystem in einem primären Kapillarplexus organisiert; Bei der Herzfunktion reorganisiert sich dieser Plexus in venöse und arterielle Gefäße3. Die Rolle mechanischer Signale bei der arteriovenösen Spezifizierung spiegelt sich in der pan-endothelialen Expression von arteriellen und venösen Markern vor der Initiierung des Blutflusses wider4.
Hämodynamische Kräfte steuern nicht nur die Entwicklung des Gefäßsystems selbst, sondern spielen auch eine grundlegende Rolle bei der Steuerung der Blutzellbildung. Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) entstehen aus spezialisierten Endothelzellen, die als hämogenes Endothel 5,6,7,8 bezeichnet werden und in verschiedenen anatomischen Regionen der Embryonen ausschließlich im frühen Entwicklungsstadium vorhanden sind. Herzdefiziente Modelle haben zusammen mit In-vitro-Modellen gezeigt, dass mechanische Signale die HSPC-Produktion aus dem hämogeren Endothel instruieren und erhöhen 9,10,11,12,13,14.
Es wurde gezeigt, dass verschiedene Arten der Flussdynamik den Zellzyklus15 differentiell steuern, von dem bekannt ist, dass er sowohl für das hämogene Endothel 16,17 als auch für die arterielle Zellspezifikation18 wichtig ist. Insgesamt sind mechanische Signale entscheidende Determinanten der Zellidentität und -funktion während der Entwicklung. Neuartige In-vitro-Fluidik-Geräte ermöglichen es uns, die Einschränkungen zu überwinden, die mit der Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie während der menschlichen Blutentwicklung in vivo verbunden sind.
Das übergeordnete Ziel des Protokolls in diesem Manuskript ist es, Schritt für Schritt die experimentelle Pipeline zu beschreiben, um die Wirkung von Scherstress auf menschliche Endothelzellen zu untersuchen, die in vitro aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gewonnen werden. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Endothelzellen und deren anschließender Aussaat in fluidische Chips für das Stimulationsprotokoll. Damit können verschiedene in vitro gewonnene Endothelzellen auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Scherspannung zu spüren, indem ihre Orientierung als Reaktion auf die Strömung analysiert wird. Dies wird es anderen Laboren ermöglichen, Fragen über die Reaktion auf Scherspannung und deren funktionelle Auswirkungen auf verschiedene Endothelzellidentitäten zu beantworten.

<table><tbody><tr><td></td><td>IB-80186</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>25% BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>als Dissoziationsreagenz</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Merck</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Aspirationspipette</td> zitiert<td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>B27 Beilage</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Zitiert als Neuronale Zellkulturergänzung (50x)</td></tr><tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>Version 8.0.1</td><td>Zitiert als Durchflusszytometrie-Software</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Mikrobead-Kit</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE-Klon 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 Klon 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar zellabweisende Oberfläche 6-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td>Zitiert als zellabweisende Platte</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10&nbsp; Zell-Kryokonservierung</td><td>Merck</td><td>C2874-100ML</td><td>Zitiert als Kryokonservierungslösung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>VWR</td><td>200-664-3</td><td>Zitiert als DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>EASY Sieb 40 &mu; m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagenz</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>Version 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>Version 10.7.1</td><td>Zitiert als Durchflusszytometrie Analyse vontware</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>Fluidische Einheit</td><td>ibidi</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>zitiert als L-Glutamin-Ergänzung</td></tr><tr><td>Schinken F-12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Holo-Transferrin</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Humanserum Albumin</td><td>Fujifilm UK LTD</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Pumpensystem</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>Zitiert als Pumpensystem</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>Zitiert als inverses Inkubatormikroskop</td></tr><tr><td>Lyophilisiertes BSA&nbsp;</td><td>Merck</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>Zitiert als Magnetabscheider</td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Zitiert als Magnetische Säule</td></tr><tr><td>MTG</td><td>Merck</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Notebook für Pumpensystem</td><td>ibidi</td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 37-41%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Pastette</td><td>Greiner Bio-one</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionsset GELB/GRÜN: 50 cm, ID 1,6 mm, 10 mL Reservoire</td><td>Ibidi</td><td>IB-10964</td><td>Zitiert als Perfusionsset</td></tr><tr><td>Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>Falke</td><td>352008</td><td>Zitiert als Durchflusszytometrie-Röhrchen</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td></td><td>Verison 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>Pumpensteuerungssoftware</td><td>ibidi</td><td>version 1.6.1</td><td>Zitiert als Pumpensoftware</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stammzell-Tecchonologien</td><td>5872</td><td>Zitiert als Ablöselösung</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R& D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R& D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life Technologies</td><td>A29248</td><td>Zitiert als Laminin</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td><td>R& D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>RLT Lysis Buffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Serieller Anschluss für &Mikro;-Objektträger: Steril, steril</td><td>ibidi</td><td>IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-CD34 SFM Medien</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>zitiert als serumfreie Medien für CD34+ Zellen (SFM-34)</td></tr><tr><td>StemPro-CD34 Nutrient Supplement&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>Zitiert als 34 Nahrungsergänzungsmittel</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>Zitiert als Kulturmedien&nbsp;</td></tr><tr><td>StemPro Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>A10006-01</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin (VTN-N) rekombinantes menschliches Protein, verkürzt</td><td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Zitiert als iRock</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro on-chip-modell eines fötalen menschlichen gefäßes zur untersuchung der entwicklungsmechanobiologie

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

Das Herz ist das erste Organ, das während der Entwicklung funktionell aufgebaut wird und so schon sehr früh in der Schwangerschaft den Blutkreislauf in Gang setzt. Neben dem Transport von Sauerstoff und Nährstoffen, um das Wachstum des Fötus zu gewährleisten, steuert die fetale Zirkulation viele wichtige Entwicklungsereignisse, die innerhalb der Endothelschicht stattfinden, durch mechanische Hinweise. Biomechanische Signale induzieren strukturelle Veränderungen der Blutgefäße, legen eine arteriovenöse Spezifizierung fest und steuern die Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen. Die Unzugänglichkeit der sich entwickelnden Gewebe schränkt das Verständnis der Rolle der Zirkulation in der frühen menschlichen Entwicklung ein. Daher sind In-vitro-Modelle zentrale Werkzeuge für die Untersuchung der Mechanobiologie von Gefäßen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Differenzierung von Endothelzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und deren anschließende Aussaat in ein fluidisches Gerät beschrieben, um ihre Reaktion auf mechanische Signale zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht die Langzeitkultur von Endothelzellen unter mechanischer Stimulation, gefolgt von der Entnahme der Endothelzellen zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung. Das hier etablierte In-vitro-Modell wird dazu beitragen, die intrazellulären molekularen Mechanismen aufzuklären, die die durch mechanische Signale vermittelte Signalübertragung übertragen, die letztendlich die Gefäßentwicklung während des menschlichen Fötuslebens orchestrieren.

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Differenzierung und Mechanostimulation von Endothelzellen, die von hiPSCs abgeleitet sind, das es ermöglicht, ihre Reaktion auf mechanische Signale zu untersuchen (Abbildung 1). Dieses Protokoll führt zur Produktion von funktionell mechanosensitiven Endothelzellen. Wir liefern hier repräsentative Ergebnisse und beschreiben den erwarteten Phänotyp, um zu beurteilen, wie die Zellen während der Differenzierung auf die Zytokinstimulation reagieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Differenzierungs- und mechanischen Stimulationsprotokolls. Schematische Darstellung des Differenzierungsprotokolls mit dem Timing der verschiedenen Mischungen von Zytokinen, der CD34+ -Zellisolierung, dem fluidischen Chip-Seeding und der abschließenden Analyse der mechanisch stimulierten Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Kultur von hiPS-Zellen Es ist wichtig, das Protokoll von hiPSCs zu starten, die unter Selbsterneuerungsbedingungen korrekt wachsen. Ein guter Indikator für die Qualität der Kultur ist die Geschwindigkeit ihres Wachstums. Nach dem Auftauen benötigen die Zellen möglicherweise 2-3 Wochen, um die richtige Wachstumsphase zu erreichen, die eine gute Differenzierung gewährleistet. Wenn die Zellen zweimal pro Woche im Verhältnis 1:6 durchlaufen werden können, um fast vollständige Konfluenz zu erreichen, ist dies der Zeitpunkt, an dem sie bereit sind, am selben Tag differenziert zu werden, an dem sie durchlaufen werden müssen.
Differenzierung von hiPS-Zellen in Endothelzellen Der erste Schritt der Differenzierung, der in der Bildung von Embryoidkörpern (EBs) besteht, ist zelllinienabhängig und muss möglicherweise für die jeweilige Zelllinie optimiert werden. Die in den Protokollschritten 1.3.2.2 bis 1.3.2.4 beschriebene Dissoziation kann modifiziert werden, indem entweder die Inkubation mit dem Dissoziationsreagenz und die anschließende Dissoziation mit der Pasteurpipette reduziert oder verlängert werden. Des Weiteren können für diesen Schritt neben der physikalischen Dissoziation der Kolonien mit einem Schneidewerkzeug oder einer P100-Pipettenspitze auch andere Dissoziationsreagenzien verwendet werden. EBs von guter Qualität zeigen am 2. Tag der Differenzierung eine definierte Kante und erscheinen klar und hell, wenn sie mit einem Mikroskop beobachtet werden; Dunklere Bereiche können auf den Zelltod innerhalb der EBs hinweisen (Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> Abbildung 2: Morphologie der Embryoidkörper. (A) Tag 2 Embryoidkörper mit gut definierten äußeren Rändern und gleichbleibender Größe. (B) Tag 2 Embryoidkörper von schlechter Qualität, die einen ausgedehnten Zelltod aufweisen, der zu einer Disaggregation der Struktur führt. Maßstabsleiste = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
An Tag 2 hemmt die Zugabe von CHIR99021 zu den EBs das GSK-3-Protein, was zur Aktivierung des Wnt-Signalwegs führt. Verschiedene Zelllinien reagieren unterschiedlich auf die CHIR-Behandlung, und dies sollte durch Quantifizierung der Anzahl der CD34+ -Zellen, die an Tag 8 erhalten wurden, unter Verwendung verschiedener Konzentrationen getestet werden (Abbildung 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> Abbildung 3: Differenzierung von Endothelzellen mit verschiedenen CHIR-Behandlungen. Quantifizierung der Endothelzellbindung durch Durchflusszytometrie am Tag 8 der Differenzierung durch CD34-Membranexpression nach CHIR-Behandlung an Tag 2 bei (A) 3 μM, (B) 5 μM und (C) 7 μM. Die Durchflusszytometriedaten wurden mit Fünf-Laser-Zytometern und spezieller Software gewonnen (siehe Materialtabelle). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
CD34+ Zellisolierung Es ist wichtig zu validieren, dass die CD34+-Anreicherung mit den magnetischen Kügelchen nach der Elution der Säule mindestens 80% CD34+ liefert. Um eine ausreichende Reinheit zu gewährleisten, kann ein Aliquot von Zellen, die aus der magnetischen Isolierung gewonnen wurden, durch Durchflusszytometrie analysiert werden, wobei sichergestellt wird, dass ein anderer Antikörperklon als der für die magnetische Anreicherung verwendete verwendet wird. Hier wurde der 4H11-Klon verwendet und nach der Anreicherung wurde eine Reinheit von ~85% erreicht (Abbildung 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> Abbildung 4: Membranexpression von CD34 vor und nach Anreicherung durch magnetische Sortierung. Tag 8 dissoziierte Embryoidkörper (grau) und Zellen nach magnetischer Anreicherung (grün) wurden auf CD34-Expression gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, wobei eine erfolgreiche Anreicherung nach der Sortierung gezeigt wurde. Die Daten der Durchflusszytometrie wurden mit Hilfe von Fünf-Laser-Zytometern und spezieller Software gewonnen (siehe Materialtabelle). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Aussaat von Zellen in den fluidischen Kanal Bei der Aussaat der Zellen im fluidischen Kanal ist es entscheidend, die Adhäsion und Proliferation der Endothelzellen zu verfolgen. Nach der Aussaat benötigen die Zellen ~5 Stunden, um vollständig am Kanal zu haften (Abbildung 5A). In dieser Phase kann auch eine alternative Beschichtungslösung getestet werden, um die Haftung zu verbessern. Um zu bestätigen, dass die getesteten Zellen mechanosensitiv sind und somit in der Lage sind, auf mechanische Stimulation zu reagieren, kann die Zellorientierung über die Zeit getestet werden. Die Zellen vor der Stimulation zeigen eine zufällige Orientierung (Abbildung 5A und Abbildung 5C) und orientieren sich parallel zur Richtung des Flusses (Abbildung 5B, C). Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Entnahme der Zellen aus dem Kanal, um eine nachgeschaltete Analyse, z. B. Durchflusszytometrie, zur Untersuchung ihres Membranimmunphänotyps durchzuführen und die endotheliale Identität der stimulierten Zellen bereitzustellen (Abbildung 5D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> Abbildung 5: Mechanoreaktionsfähigkeit von hiPSCs-abgeleiteten Endothelzellen. (A) Konfluente Schicht isolierter CD34+ -Zellen 48 h nach der Aussaat. (B) Reorientierte Schicht von Endothelzellen 3 Tage unter dynamischer Kultur. (C) Orientierungsanalyse der Endothelzellen nach 5 Tagen dynamischer Kultur. (D) CD34-Expressionsprofil von Zellen, die 5 Tage lang unter Fluss kultiviert wurden. (E) Prozentsatz der CD34+ -Zellen der Zellpopulation, die aus dem fluidischen Kanal gewonnen wurden. Die Bilder wurden mit einem inversen Inkubatormikroskop aufgenommen; Die Daten der Durchflusszytometrie wurden mit Fünf-Laser-Zytometern und einer speziellen Software gewonnen (siehe Materialtabelle). Maßstabsbalken = 100 μm (A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenzien</td>
			<td>Bestandskonzentration</td>
			<td>Hinzugefügtes Volumen</td>
			<td>Endkonzentration</td>
		</tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Schinken F-12 Nährstoffmischung (F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>N-2 Zuschlag (100x)</td>
			<td>100 x</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>1-fach</td>
		</tr><tr><td>B-27 Zuschlag (50x)</td>
			<td>50 x</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>1-fach</td>
		</tr><tr><td>Ascorbinsäure</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>1,25 ml</td>
			<td>25 μg/ml</td>
		</tr><tr><td>α-Monothioglycerin (MTG)</td>
			<td>11,5 Mio.</td>
			<td>19,5 μl</td>
			<td>448,5 μM</td>
		</tr><tr><td>Humanes Serumalbumin</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>2,5 ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td>Holo-Transferrin</td>
			<td>100 mg/ml</td>
			<td>0,75 ml</td>
			<td>150 μg/ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung und Rezeptur für 500 ml serumfreies Differenzierungsmedium (SFD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tage der Differenzierung</td>
			<td>Zytokin-Mischung</td>
			<td>Zytokin</td>
			<td>Endkonzentration</td>
		</tr><tr><td>Tag 0 - 2</td>
			<td>Mischung 1</td>
			<td>BMP4-KARTON</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr><tr><td>Tag 2</td>
			<td>Mischung 2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr><tr><td>Ab Tag 3</td>
			<td rowspan="2">3 und 4 mischen</td>
			<td>VEGF</td>
			<td>15 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGF</td>
			<td>5 ng/ml</td>
		</tr><tr><td>Ab dem 6. Tag</td>
			<td rowspan="8">Mischung 4</td>
			<td>IL6-KARTON</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1-KARTON</td>
			<td>25 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11-KARTON</td>
			<td>5 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>EPO</td>
			<td>3 U/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPO</td>
			<td>30 ng/ml</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3-KARTON</td>
			<td>30 ng/ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Mischungen von Zytokinen, die für die Differenzierung von Endothelzellen verwendet werden, Tage, an denen sie dem SFD-Medium zugesetzt werden, und Endkonzentration.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Schubspannung (dyn/cm2)</td>
			<td>Zeit (h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Bis zum Ende des Experiments</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Schubspannungswerte für die dynamische Kultur und die Dauer ihrer Anwendung.
Ergänzende Abbildung S1: Geometrie und Abmessungen des Chips und der Schläuche, die für dieses Protokoll verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S2: Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Software zur Steuerung der Luftpumpe mit einer Beschreibung der einzelnen Schritte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S3: Leitfaden für die Orientierungsanalyse mit FIJI mit der Zeichnung der Zellform, der elliptischen Anpassung und der endgültigen Messung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle S1: Einheitsgröße, Resuspensionsvolumen und Stammkonzentrationen für Zytokine, die im Differenzierungsprotokoll verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Hier wird ein einfacher Arbeitsablauf zur Unterscheidung von Endothelzellen von humanen pluripotenten Stammzellen beschrieben, gefolgt von einem detaillierten Protokoll für ihre mechanische Stimulation. Dies ermöglicht die Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie von Endothelzellen. Dieser Ansatz ist kompatibel mit nachgeschalteten Assays von lebenden Zellen, die nach mechanischer Stimulation aus dem Kulturchip entnommen wurden.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Unsere Forschung untersucht, wie mechanische Signale das Schicksal von Endothelzellen während der Entwicklung beeinflussen, wofür wir die humane induzierte pluripotente Stammzelldifferenzierung mit fluidisch vermittelter mechanischer Stimulation kombinieren. Endothelzellen sind ständig der Bewegung des Blutes ausgesetzt, so dass wichtige Signale in der statischen Kultur übersehen werden, was dies zur größten Herausforderung bei der Untersuchung der Endothelzellbiologie mit herkömmlichen Kultursystemen macht. Mechanische Signale aktivieren in der Tat viele wichtige Signalwege, die in Zellen, die unter statischen Bedingungen kultiviert werden, möglicherweise übersehen werden.Unser Protokoll bietet eine einfache Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Differenzierung und mechanischen Stimulation von induzierten pluripotenten Stammzell-Endothelzellen. Dies wird vielen Laboren bei der Einführung einer thermischen Kultur helfen, um Fragen zum Verhalten von Endothelzellen unter Strömung leicht zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir eine Methode zur menschlichen Nabelschnurblut-derived endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) und Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Kollagen / Fibronektin Gel eingebettet, subkutan in immundefizienten Mäusen. Liefern Diese Zelle / Gel-Kombination erzeugt eine humane vaskuläre Netzwerk, das mit der Maus Gefäßsystem verbindet.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Protokolle für das Studium der embryonalen und perinatalen murinen Aorta mit in Vivo klonalen Analyse und Schicksal Mapping, Aorten-Explantaten und isolierten glatte Muskulatur, die Zellen detailliert sind hier. Diese unterschiedlichen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Morphogenese der embryonalen und perinatale Aorta in normale Entwicklung und die Pathogenese in Krankheit.

Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Hier haben wir ein Organ-on-a-Chip-Modell für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta entwickelt, um die in vivo biomechanische Belastung von glatten Muskelzellen in der menschlichen Aortenwand zu replizieren.

Konstruktion eines Organ-on-A-Chip-Modells für glatte Muskelzellen der menschlichen Aorta zur Rekapitulation biomechanischer Dehnungen in der Aortenwand

Hier stellen wir ein Protokoll für die Konstruktion eines Organ-on-Chip (OOC)-Systems vor, das die Pneumonektomie nachahmen soll. Dieses System untersucht den möglichen Zusammenhang zwischen einer Beeinträchtigung der Glykokalyx und Komplikationen nach Pneumonektomie.

Modellierung der endothelialen Glykokalyx nach der Pneumonektomie in einem 3D-Fluidik-Chip - Ein Ansatz zur Herstellung eines vaskulär basierten Organ-on-Chip-Systems

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen. Dieses Verletzungsmodell bietet eine Plattform für die Untersuchung von Blutstillung, verletzungsbedingten Entzündungen und Wundheilung in einem Organismus, der sich ideal für die Echtzeitmikroskopie eignet.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Erfahren Sie die Differenzierung endothelialer Zellen aus humanen iPS-Zellen und deren mechanische Stimulation in einem Fluid-Chip. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Mechanobiologie in einer kontrollierten Umgebung.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

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