Name: Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie hochauflösende Respirometrie zur Bewertung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien. Diese Methode ermöglicht die Messung der Sauerstoffverbrauchsrate und hilft bei der Unterscheidung von Spermienqualität.

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Wir danken der Klinik Fertilab Andrology, insbesondere José María Montes und Andrea Torrents, für den Zugang zu Spendern. Finanzierung: A.C. wird durch Stipendien der Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021) unterstützt. Zusätzliche Mittel wurden vom Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay) eingeworben. P.I. und R.S. werden unterstützt von der Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 und FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. wird von POS_FMV_2018_1_1007814 und CAP-UDELAR 2020 unterstützt. Die Figuren wurden mit Biorender.com illustriert.

Die Experimente wurden von der Ethikkommission der Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay, genehmigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig01.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsablauf für hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion in intakten und permeabilisierten menschlichen Spermien. Das Protokoll wurde in vier verschiedene Schritte unterteilt: 1) Vorbereitung der Probe, 2) Sauerstoffkalibrierung im Oroboros-Instrument, 3) Messung des Sauerstoffverbrauchs für intakte und permeabilisierte Zellen und 4) Datenextraktion aus dem Gerät und Analyse. Abkürzungen: CASA = computergestützte Spermienanalyse; BWW = Biggers Whitten Whittingham mittel; MRM = mitochondriales Atmungsmedium; ADP = Adenosindiphosphat; FCCP = Carbonylcyanid -p-Trifluormethoxyphenylhydrazon; AA = Antimycin A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65493/65493fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
HINWEIS: Der Arbeitsablauf zur Messung des Sauerstoffverbrauchs in Spermien mit HRR ist in Abbildung 1 dargestellt. Informationen zu den Materialien, Geräten und Reagenzien, die im Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Probe
<ol><li>Musterkollektion<ol><li>Sammeln Sie frisch ejakuliertes menschliches Sperma durch Masturbation nach einer empfohlenen 3-tägigen Abstinenz in einem sterilen Kunststoffbehälter. Transportieren Sie die Proben sofort ins Labor.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur (RT), um sie vollständig zu verflüssigen24.</li>
		<li>Lagern Sie die Proben nach der Verflüssigung bei 37 °C, bis das Experiment beginnt.</li>
	</ol></li>
	<li>Spermienauswertung mit computergestützter Spermienanalyse (CASA)<ol><li>Mischen Sie die Probe und geben Sie 7 μl in eine vorgewärmte Spermienzählkammer.</li>
		<li>Stellen Sie die Kammer auf den vorgewärmten (37 °C) Tisch eines Direktlichtmikroskops.</li>
		<li>Öffnen Sie die computergestützte Spermienanalyse-Software und geben Sie das Modul Beweglichkeit und Konzentration auf (klicken Sie auf Mot).</li>
		<li>Wählen Sie die Konfiguration aus, die den Bedingungen für menschliche Spermien entspricht. HINWEIS: Die Konfiguration muss an die Art und Tiefe der Kammer sowie an die Probenart und das System CASA angepasst werden.</li>
		<li>Analysieren Sie nach dem Zufallsprinzip 10 verschiedene Felder pro Kammer, indem Sie auf die Schaltfläche Analysieren klicken.</li>
		<li>Klicken Sie auf Ergebnisse , um die Probenkonzentration und -motilität zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Zellen HINWEIS: Wenn der HRR nicht kalibriert ist, beginnen Sie mit den Schritten 2.1-2.2, bevor Sie die Zellen vorbereiten (Schritt 1.3). Es ist wichtig, den Sauerstoffverbrauch sofort zu messen, wenn die Samenzellen im Medium resuspendiert werden.<ol><li>Die Proben werden bei 400 x g für 10 min bei RT zentrifugiert.</li>
		<li>Entfernen Sie das Samenplasma und resuspendieren Sie die Spermien in 2 ml Biggers Whitten Whittingham (BWW) für Experimente mit intakten Zellen oder mitochondriales Atmungsmedium (MRM) für Studien mit permeabilisierten Zellen. Die Zusammensetzung der Medien ist in Tabelle 1 dargestellt.</li>
		<li>Wiederholen Sie die in Schritt 1.2 beschriebenen Schritte für Spermienkonzentrationsuntersuchungen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hochauflösende Respirometrie: OXPHOS-Analyse
HINWEIS: HRR integriert hochempfindliche Oxygraphen (Oxygraph-2 K; Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Österreich) mit Software (DatLab, Version 4.2; Oroboros Instruments GmbH). Die experimentellen Daten werden als Sauerstoffkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit (als pmol von O2/106 Zellen·min−1) und als Echtzeittransformationen dieser Daten angezeigt, so dass der Experimentator die Atmung (Sauerstoffverbrauch, Sauerstofffluss) biologischer und biochemischer Proben verfolgen kann, während das Experiment noch läuft. Die HRR kann verwendet werden, um die Atmung lebender und beweglicher Zellen zu verfolgen, was besonders für Spermien nützlich ist, deren Beweglichkeit mit der Spermienqualität und dem Fruchtbarkeitspotenzial verbunden ist. Das Labor verwendet einen HRR Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros Instruments, mit zwei Kammern. Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte müssen für beide 2-ml-Kammern unabhängig voneinander durchgeführt werden.
<ol><li>Vorbereitung der Ausrüstung<ol><li>Schalten Sie den HRR ein und verbinden Sie ihn mit der Respirometrie-Software (DatLab) zur Datenerfassung und -analyse.</li>
		<li>Ersetzen Sie das 70%ige Ethanol in der Oxygraphenkammer durch ddH2O. Rühren Sie es kontinuierlich mit dem magnetischen Rührstab in der Kammer bei 750 U/min um. 10 min stehen lassen und anschließend das doppelt destillierte (dd)H2Oabsaugen.</li>
		<li>Waschen Sie die Kammer dreimal mit ddH2O für jeweils 5 Minuten. HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um das verbleibende Ethanol aus den Kammern zu entfernen. Samenzellen reagieren sehr empfindlich auf Ethanol. Die Aufzeichnung könnte beeinträchtigt werden, wenn dieser Schritt weggelassen wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibrierung der Sauerstoffsensoren HINWEIS: Das Kalibrierungsverfahren variiert je nach Gerät leicht. Eine Luftkalibrierung des polarographischen Sauerstoffsensors durchführen, wie vom Hersteller25 beschrieben. In diesem Abschnitt wird das Kalibrierungsprotokoll kurz erläutert.<ol><li>Entfernen Sie dasddH2O und pipettieren Sie 2 ml desselben Mediums, das für die Zellvorbereitung verwendet wurde, in die Kammer. Setzen Sie die Stopfen auf und lassen Sie eine Luftaustauschblase erhalten. HINWEIS: Es ist wichtig, das Volumen der Kammer zu kennen, um das genaue Volumen des benötigten Mediums zu bestimmen.</li>
		<li>Notieren Sie die Sauerstoffkalibrierwerte (klicken Sie auf Layout &gt; 01 Calibration Exp. Gr3-Temp), um die Leistung der Sensormembran zu überwachen, indem Sie das Medium mit dem Rührstab bei 750 U/min für mindestens 30 min bei 37 °C rühren. Verwenden Sie die anderen Einstellungen wie erwähnt: Verstärkung für Sensor: 2; Polarisationsspannung: 800 mV; Datenaufzeichnungsintervall: 2,0 s. ANMERKUNG: Es wird erwartet, dass eine unkorrigierteO2-Steigung (rote Linie) innerhalb von ±2 pmol∙s−1∙mL−1 mit einem stabilen Signal des polarographischen Sensors erzielt wird.</li>
		<li>Ziehen Sie die Maus bei gedrückter linker Maustaste und Umschalttaste, um einen Bereich auszuwählen, in dem die Änderung der Sauerstoffkonzentration (Y1 O2-Konzentration, blaue Linie) stabil ist.</li>
		<li>Öffnen Sie das Fenster O2-Kalibrierung (klicken Sie auf Oxygraph &gt; O2-Kalibrierung). Ändern Sie in der Luftkalibrierung die ausgewählte Markierung in den in Schritt 2.2.3 ausgewählten Bereich. Klicken Sie abschließend auf Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren.</li>
		<li>Stoppen Sie die Aufnahme und speichern Sie, indem Sie auf Oxygraph &gt; Ok Control &gt; Save and Disconnect klicken. HINWEIS: Dieses Dataset muss gespeichert werden, damit es in allen Experimenten des Tages verwendet werden kann. Die Kalibrierung wird nur einmal pro Tag für jedes Medium durchgeführt.</li>
	</ol></li>
	<li>Digitonin-Permeabilisierungs-Titration<ol><li>Öffnen Sie die Kammer und saugen Sie das Medium im Inneren an.</li>
		<li>In die Kammer werden mindestens 24 x 10 6 und nicht mehr als 70 x 106 Samenzellen in einem Endvolumen von 2 ml MRM geladen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Anzahl der Zellen in der Kammer zu messen, um den Sauerstoffverbrauch am Ende des Experiments anzupassen. Eine geringere Anzahl von Zellen als empfohlen kann nicht gemessen werden.</li>
		<li>Schließen Sie die Kammer, indem Sie die Stopfen ganz hineindrücken und saugen Sie die restliche Flüssigkeit oben an. Starten Sie das Experiment mit den gleichen Einstellungen wie bei der Kalibrierung: Rührgeschwindigkeit: 750 U/min; Temperatur: 37 °C; Verstärkung für Sensor: 2; Polarisationsspannung: 800 mV; und Datenaufzeichnungsintervall: 2,0 s.</li>
		<li>Um die Kalibrierung zu laden, doppelklicken Sie auf das Feld Pos Calib in der unteren Ecke. Öffnen Sie die in Schritt 2.2 durchgeführte Kalibrierung (klicken Sie auf Oxygraph &gt; O2-Kalibrierung &gt; Aus Datei kopieren) und klicken Sie auf Kalibrieren und in Zwischenablage kopieren. HINWEIS: Die POS-Calib-Box wechselt von gelb zu grün. Die Daten werden in Diagrammen mit Sauerstoffdurchfluss pro Volumen korrigiert angezeigt (Layout 05 Fluss pro Volumen unkorrigiert). In Oxygraph &gt; Layout stehen verschiedene Layouts zur Verfügung.</li>
		<li>Fügen Sie 5 μl 0,5 M Adenosindiphosphat (ADP), 10 μl 2 M Glutamat und 2,5 μl 0,4 M Malat hinzu (Endkonzentrationen: 1,25 mM, 10 mM und 0,5 mM). Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis sich das Signal stabilisiert hat. HINWEIS: Präzisions-Mikrospritzen von Hamilton werden für die Injektion durch die Ladeöffnung im Stopfen verwendet. Verwenden Sie eine Spritze pro Medikament, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Klicken Sie auf F4 , um sich zu registrieren, und markieren Sie im Sauerstoffregister, wenn eine Behandlung hinzugefügt wird. HINWEIS: Die Substrate werden in Reinstwasser vorbereitet und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.</li>
		<li>Tritatieren Sie durch Zugabe von 1 μl 10 mM Digitonin in aufeinanderfolgenden Schritten, bis der Sauerstoffverbrauch ein maximales Niveau erreicht. HINWEIS: Eine gründliche Reinigung mit Wasser, 70 % Ethanol und 100 % Ethanol ist unerlässlich, wenn dieselbe Kammer für zwei Experimente am selben Tag verwendet wird. HINWEIS: Digitonin wird in Reinstwasser hergestellt und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.</li>
	</ol></li>
	<li>Routinemäßiges Protokoll zur Beurteilung der Atemwege für intakte und permeabilisierte Samenzellen (Komplex I oder Komplex II)<ol><li>Öffnen Sie die Kammer und saugen Sie das Medium im Inneren an.</li>
		<li>Mindestens 24 x 10 6 und nicht mehr als 70 x 106 Samenzellen in einem Endvolumen von 2 ml BWW (intakte Zellanalyse) oder MRM (permeabilisierte Zellanalyse) in die Kammer geben.</li>
		<li>Starten Sie das Experiment mit den gleichen Einstellungen wie bei der Kalibrierung (dies ist in Schritt 2.3.3 beschrieben).</li>
		<li>Laden Sie die in Schritt 2.2 durchgeführte Kalibrierung wie in Schritt 2.3.4 beschrieben.</li>
		<li>Zeichnen Sie die Atmung der Zellen mindestens 5 Minuten lang auf, bis ein stabiles Signal erhalten wird. Diese Messung entspricht der basalen Atmung in intakten Zellen.</li>
		<li>Wenn das Experiment mit intakten Zellen durchgeführt wird, fahren Sie mit Schritt 2.4.9 fort. Bei permeabilisierten Zellen werden 4,5 μl 10 mM Digitonin (Endkonzentration: 22,5 μM) injiziert. Permeabilisieren Sie die Zellen für 5 Minuten.</li>
		<li>Fügen Sie die Substrate hinzu: 10 μl 2 M Glutamat und 2,5 μl 0,4 M Malat (Endkonzentrationen: 10 mM bzw. 0,5 mM) für Komplex I oder 20 μL 1 M Succinat (Endkonzentration: 10 mM) für Komplex II. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert. Dies ist Zustand 4, was bedeutet, dass der Basalkomplex I oder der Basalkomplex II die Atmung in Abwesenheit von ADP unterstützt. HINWEIS: Die Substrate werden in Reinstwasser vorbereitet und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.</li>
		<li>Injizieren Sie 5 μl 0,5 M ADP (Endkonzentration: 1,25 mM). Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert. Die Zugabe von ADP erhöht das Signal, das dem maximalen Sauerstoffverbrauch durch Komplex I oder Komplex II entspricht (Zustand 3, in permeabilisierten Zellen).</li>
		<li>Fügen Sie 1 μl 4 mg/ml Oligomycin (Endkonzentration: 2 μg/ml), einen ATP-Synthetase-Inhibitor, hinzu. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal abnimmt und sich stabilisiert. HINWEIS: Oligomycin wird in Ethanol hergestellt und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.</li>
		<li>Titrieren durch Zugabe von 1 μl 0,1 mM zu 1 mM Carbonylcyanid-P-trifluormethoxy-phenylhydrazon (FCCP) in aufeinanderfolgenden Schritten, bis eine maximale entkoppelte Atmungsrate erreicht ist. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal ansteigt und sich stabilisiert. HINWEIS: FCCP wird in Ethanol hergestellt und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.</li>
		<li>Die Endkonzentration von FCCP ist probenabhängig. Hören Sie auf, das Medikament zu injizieren, wenn der Sauerstoffverbrauch zu sinken beginnt.</li>
		<li>Zum Schluss injizieren Sie 1 μl 5 mM Antimycin A (2,5 μM Endkonzentration). Dabei handelt es sich um einen Komplex-III-Inhibitor zur Unterscheidung zwischen dem mitochondrialen und dem Restsauerstoffverbrauch (nicht-mitochondriale Atmung). Für die Analyse von Komplex I wird anstelle von AA 1 μl 1 μl 1 mM Rotenon (0,5 μM Endkonzentration), ein Inhibitor dieses Komplexes, zugegeben. Messen Sie den Sauerstoffverbrauch, bis das Signal abnimmt und sich stabilisiert. HINWEIS: Die Arzneimittel werden in Ethanol zubereitet und 3 Monate lang bei −20 °C gelagert.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Datenextraktion und -analyse
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Erfassung von respiratorischen Parametern aus einem hochauflösenden Respirometrie-Experiment. (A,B) Schematische Darstellungen von Graphen, die wie in Abbildung 1 beschrieben für intakte bzw. permeabilisierte Zellen erhalten wurden. Diese Parameter wurden bereits beschrieben15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65493/65493fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol><li>Ziehen Sie die Maus, indem Sie die linke Maustaste und die Umschalttaste drücken, um Bereiche auszuwählen, in denen der Sauerstofffluss pro Volumen korreliert (Y2 O2 slope uncorr., rote Linie) nach der Injektion eines Substrats oder Inhibitors stabil ist. Figur 2 zeigt die verschiedenen Parameter, die aus dem zuvor beschriebenen Register15 gewonnen werden. HINWEIS: Die Parameter hängen vom Experiment ab. alle sind wie folgt: basale Atmung in intakten Zellen und Atmung in Gegenwart von Glutamat/Malat oder Succinat (Zustand 4), ADP (Zustand 3), Oligomycin (Protonenleck), FCCP (maximale Atemfrequenz), Rotenon/AA (nicht-mitochondriale Atmung). In permeabilisierten Zellen entspricht die basale Atmung dem Zustand 3.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Fenster Markierungen &gt; Statistiken , und exportieren Sie die Daten.</li>
	<li>Normalisieren Sie die erhaltenen Daten pro 1 Million Samenzellen. Die Einheiten der Steigungen sind pmolO2·s−1·mL−1·10−6 Zellen.</li>
	<li>Subtrahieren Sie den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch von allen Werten, bevor Sie die Indizes berechnen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Indizes mit den verschiedenen Gleichungen, die zuvor15 beschrieben wurden: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65493/65493eq01v3.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

Bestimmung der Atmung in menschlichen Spermien durch hochauflösende Respirometrie

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<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Mitochondrial+Pathways+and+Respiratory+Control%22">Mitochondrial Pathways and Respiratory Control</a>. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck, Austria. (2012).</li>
<li>Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+dependence+of+respiration+in+coupled+and+uncoupled+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells.</a> The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).</li>
<li>Holt, W. V., Van Look, K. J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+in+sperm+heterogeneity%2C+sperm+selection+and+sperm+competition+as+biological+foundations+for+laboratory+tests+of+semen+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality.</a> Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).</li>
<li>Sousa, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+all+sperm+are+equal%3A+Functional+mitochondria+characterize+a+subpopulation+of+human+sperm+with+better+fertilization+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential.</a> PloS One. 6 (3), e18112(2011).</li>
<li>Moscatelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-based+evaluation+of+sperm+progressive+motility+via+fluorescent+assessment+of+mitochondria+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential.</a> Scientific Reports. 7, 17931(2017).</li>
<li>Ferreira, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mitochondrial+activity+upon+CatSper+channel+activation+is+required+for+mouse+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation.</a> Redox Biology. 48, 102176(2021).</li>
<li>Irigoyen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+determines+the+functional+status+of+human+sperm+and+correlates+with+semen+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684(2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die HRR hängt entscheidend von mehreren Schritten ab: (a) der Wartung der Geräte, (b) der genauen Kalibrierung der Sauerstoffsensoren, (c) der Entkopplertitration26 und schließlich (d) der angemessenen Verwendung von Indizes, die die mitochondriale Funktion darstellen. Die Wartung der Geräte ist von entscheidender Bedeutung. Es wird empfohlen, die Membranen des polarographischen Sauerstoffsensors regelmäßig auszutauschen und den instrumentellen Untergrund zu korrigieren. Ein ausgiebiges Waschen na...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/65493">High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa</a>. The Protocol and Representative Result sections were updated.
Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:
Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
to:
Finally, inject 1 µL of 5 mM antimycin A (2.5 µM final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 µL of 1 mM rotenone (0.5 µM final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
Figure 3 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Oxygen concentration analysis; graphs showing O₂ levels vs. time and digitonin effect; data chart." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig03.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65493/65493fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oxygen consumption analysis; graph shows O₂ concentration and flux (A) and rate vs. digitonin (B)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 °C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means ± standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65493/65493fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65493">High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa</a>. The Protocol and Representative Result&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Es wird geschätzt, dass männliche Unfruchtbarkeit 40%-50% aller Fälle von Unfruchtbarkeit bei Paaren ausmacht1. Die konventionelle Samenanalyse spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der männlichen Fruchtbarkeit. Etwa 15 % der unfruchtbaren Männer haben jedoch normale Spermienparameter2. Darüber hinaus liefert die routinemäßige Samenanalyse nur begrenzte Informationen über die Spermienfunktion und spiegelt keine subtilen Spermiendefekte wider3.
Spermienmitochondrien haben eine besondere Struktur, da sie als spiralförmige Hülle um die Geißeln angeordnet sind. Die mitochondriale Hülle enthält eine variable Anzahl von Mitochondrien, die durch intermitochondriale Linker verbunden und durch geordnete Proteinanordnungen auf der äußeren Mitochondrienmembran mit dem Zytoskelett verankert sind 4,5. Diese Struktur macht es besonders schwierig, die Mitochondrien der Spermien zu isolieren. Daher werden in den meisten Studien zur mitochondrialen Funktion von Spermien In-situ-Analysen oder demembranierte Spermien verwendet6.
Die mitochondriale Struktur und Funktion der Spermien wurde konsistent mit männlicher Unfruchtbarkeit in Verbindung gebracht 7,8,9,10,11, was darauf hindeutet, dass die Analyse der Struktur und Funktion dieser Organellen ein guter Kandidat für die Einbeziehung in die Spermienanalyse sein könnte.
Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle im zellulären Energiestoffwechsel, insbesondere durch die Verwendung von Sauerstoff zur Herstellung von Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS). Insbesondere bei Spermien ist die Quelle von ATP (Glykolyse vs. OXPHOS) umstritten, und viele der Daten bleiben umstritten und hängen von verschiedenen experimentellen Ansätzen ab 4,12,13. Messungen der Atmung mittels Oximetrie bieten signifikante Einblicke in die mitochondriale Atmungskapazität, die mitochondriale Integrität und den Energiestoffwechsel der Zelle14,15,16. Traditionell wurde diese Technik mit der Clark-Sauerstoffelektrode durchgeführt - einem Instrument, das seit mehr als 50 Jahren zur Messung der mitochondrialen Atmung verwendet wird17,18. Darüber hinaus wurde der mitochondriale Sauerstoffverbrauch der Spermien mit der klassischen Clark-Sauerstoffelektrode 19,20,21 analysiert. Die hochauflösende Respirometrie (HRR) mit Oxygraphen (Oroboros) bietet eine höhere Sensitivität als die Verwendung klassischer Respirometriegeräte22. Die Oxygraphen bestehen aus zwei Kammern mit Injektionsanschlüssen, und jede Kammer verfügt über einen polarographischen Sauerstoffsensor. Mit dieser Technik ist es möglich, Gewebeobjektträger, Zellen und isolierte mitochondriale Suspensionen zu analysieren. Die Probe wird in der Kammer kontinuierlich gerührt, und während des Experiments wird der Sauerstoffverbrauch gemessen und die Sauerstoffraten mit einer speziellen Software berechnet. Die Kammern weisen eine reduzierte Sauerstoffleckage auf, was ein Vorteil gegenüber den herkömmlichen Sauerstoffelektrodenvorrichtungen14,23 ist.
Wie bei anderen Zellen ist auch bei Spermien die Empfindlichkeit der HRR-Geräte höher als bei der herkömmlichen Respirometrie, was bedeutet, dass HRR-Geräte für die Analyse einer begrenzten Anzahl intakter oder permeabilisierter Samenzellen verwendet werden können. Es gibt zwei Hauptstrategien zur Beurteilung der mitochondrialen Funktion von Spermien mittels HRR: (a) Messung des Sauerstoffverbrauchs in intakten Zellen, bei der die Atmungsfunktion in einem Medium, das Substrate wie Glukose enthält, reproduziert wird, oder (b) Messung des Sauerstoffverbrauchs in permeabilisierten Zellen unter Verwendung eines der OXPHOS-Komplexe, wobei spezifische Substrate hinzugefügt werden, um jede Funktion separat zu überwachen.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir den Einsatz von HRR zur Bestimmung der mitochondrialen Atmung in menschlichen Samenzellen.

<table><tbody><tr><td>Säurefreies Rinderserumalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin-5'-Diphosphat-Monokaliumsalzdihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Animycin A aus Streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanid-P-trifluormethoxy-phenylhydrazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>DatLab Software Version 4,2</td><td>Oroboros Instruments GmbH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L Glutaminsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L Apfelsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mikroliterspritzen</td><td>Hamilton</td><td>87900 oder 80400</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopkamera</td><td>Basler</td><td>acA780-75gc</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Eclipse E200 mit Phasenkontrast 10X Ph+</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Monokaliumphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph-2 K</td><td>Oroboros Instruments GmbH</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Power O2k-Respirometer</td><td>Oroboros Intruments</td><td>10033-01</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumlactat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Spermienklassenanalysator 6.3.0.59 Evolution-SCA Research</td><td>Microptic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spermienzählkammer DRM-600</td><td>Millennium Sciences CELL-VU</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Succinat-Dinatriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W327700</td><td></td></tr></tbody></table>

hochauflösende respirometrie zur beurteilung der mitochondrienfunktion in menschlichen spermien

High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Die Samenqualität wird oft durch eine routinemäßige Samenanalyse untersucht, die beschreibend und oft nicht schlüssig ist. Männliche Unfruchtbarkeit ist mit einer veränderten mitochondrialen Aktivität der Spermien verbunden, so dass die Messung der mitochondrialen Funktion der Spermien ein Indikator für die Spermienqualität ist. Die hochauflösende Respirometrie ist eine Methode zur Messung des Sauerstoffverbrauchs von Zellen oder Geweben in einem geschlossenen Kammersystem. Diese Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden und liefert Informationen über die Qualität und Integrität der Spermienmitochondrien. Die hochauflösende Respirometrie ermöglicht es den Zellen, sich frei zu bewegen, was bei Spermien a priori von Vorteil ist. Diese Technik kann mit intakten oder permeabilisierten Spermien angewendet werden und ermöglicht die Untersuchung der intakten Mitochondrienfunktion der Spermien und der Aktivität einzelner Atmungskettenkomplexe. Das hochauflösende Oxygraph-Gerät verwendet Sensoren zur Messung der Sauerstoffkonzentration in Verbindung mit einer empfindlichen Software zur Berechnung des Sauerstoffverbrauchs. Die Daten werden verwendet, um Atmungsindizes auf der Grundlage der Sauerstoffverbrauchsverhältnisse zu berechnen. Folglich sind die Indizes die Anteile von zwei Sauerstoffverbrauchsraten und werden intern auf die Zellzahl oder Proteinmasse normiert. Die Atmungsindizes sind ein Indikator für die mitochondriale Funktion und Dysfunktion der Spermien.

Bestimmung der optimalen Konzentration von Digitonin in Samenzellen In diesem Protokoll stellen wir die Verwendung von HRR vor, um Veränderungen von OXPHOS in menschlichen Samenzellen in Echtzeit zu überwachen. Da die Methode zur Analyse von intakten oder Digitonin-permeabilisierten Spermien verwendet werden kann, stellen wir zunächst die Standardisierung der Digitoninkonzentration vor, die für die Permeabilisierung von Spermien erforderlich ist (Abbildung 3).
<p clas...

Die Analyse der Mitochondrienfunktion von Spermien mittels hochauflösender Respirometrie ermöglicht die Messung des Sauerstoffverbrauchs von frei beweglichen Spermien in einem geschlossenen Kammersystem. Die Technik kann zur Messung der Atmung in menschlichen Spermien eingesetzt werden, die Informationen über die mitochondrialen Eigenschaften und die Integrität der Spermien liefert.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

Unsere Arbeit konzentriert sich auf die männliche Unfruchtbarkeit, insbesondere auf die Mitochondrien der Spermien. Spermien verlieren während der Spermatogenese den größten Teil ihrer Zytoplasten und Organellen, aber sie behalten Mitochondrien. Neben ihrer Hauptrolle bei der ATP-Produktion sind Mitochondrien an der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, der Kalziumspeicherung und der Apoptose beteiligt.Die Rolle der Mitochondrien der Spermien ist noch nicht vollständig verstanden. Das Verständnis der Mitochondrienfunktion in Spermien ist der Schlüssel zur Aufklärung des Energiestoffwechsels der Spermien und der männlichen Unfruchtbarkeit. Wir haben gezeigt, dass die mitochondriale Funktion menschlicher Spermien mit den Spermiogrammparametern korreliert.Unsere Gruppe zeigt, dass Mitochondrien unter normalen und pathologischen Bedingungen die Hauptquelle für Superoxid sind. Darüber hinaus konnten wir mit Hilfe der hochauflösenden Respirometrie metabolische Cutoff-Werte ermitteln, die zwischen Männern mit abnormalem und normalem Spermiogramm unterscheiden können. Das Spermiogramm ist der Goldstandard im Labor zur Analyse der männlichen Unfruchtbarkeit.Es liefert viele Informatio

high-resolution-respirometry-to-assess-mitochondrial-function-human

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Hochauflösende Respirometrie verwendet mitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Dies ist eine einfache Technik mitochondrialen Atmungskette Komplexe '(I-IV) Atmungsraten, maximale mitochondrialen Elektronentransportsystemkapazität und mitochondrialen Außenmembran Integrität zu bestimmen.

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Hier wird eine Quadrizeps-Muskelprobe von einem anästhesierten Schwein entnommen und Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. Anschließend werden die Atemfrequenzen der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV mittels hochauflösender Respirometrie bestimmt.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Die Beurteilung der oxidativen Phosphorylierung mit hochauflösenden Respirometern ist zu einem integralen Bestandteil der Funktionsanalyse von Mitochondrien und zellulärem Energiestoffwechsel geworden. Hier stellen wir Protokolle für die Analyse des zellulären Energiestoffwechsels mit kammer- und mikroplattenbasierten hochauflösenden Respirometern vor und diskutieren die wichtigsten Vorteile jedes Geräts.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Bioenergetik in Zellen und Geweben mittels kammer- und plattenbasierter Respirometer

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Pferde verfügen über eine außergewöhnliche aerobe Trainingskapazität, was die Skelettmuskulatur von Pferden zu einem wichtigen Gewebe sowohl für die Untersuchung der Trainingsphysiologie von Pferden als auch für die mitochondriale Physiologie von Säugetieren macht. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur umfassenden Beurteilung der mitochondrialen Funktion in der Skelettmuskulatur von Pferden.

Hochauflösende Fluoro-Respirometrie der Skelettmuskulatur von Pferden

Hier beschreiben wir eine umfassende Methode zur Messung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung in frischen permeabilisierten Skelettmuskelfasern aus menschlichen oder Mausmuskeln. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung und die Beurteilung der Brennstoffpräferenz und der metabolischen Flexibilität unter Beibehaltung bestehender mitochondrialer Netzwerke und der Membranintegrität.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Die Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik unter physiologisch relevanten Substratkonzentrationen in Immunzellen sind begrenzt. Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das hochauflösende Fluorespirometrie verwendet, um Veränderungen in der Reaktion des mitochondrialen Membranpotentials auf den Energiebedarf in menschlichen T-Zellen, Monozyten und peripheren mononukleären Zellen zu bewerten.

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Dieses Video zeigt Modulation der Reflex-Aktivität, willentliche Kraft und Gehfähigkeit durch klinische und quantitative Beurteilung bei Personen mit motorischen unvollständige SCI als Folge der akuten oralen Verabreichung eines Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI).

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Wir beschreiben eine minimal-invasive und schmerzfreie Methode, Hunde Hinterlauf der Muskelkraft und der Reaktion auf wiederholte exzentrische Kontraktionen zu messen.

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Murine Spinotrapezius Modell, um die Auswirkungen der Arteriolen Ligation auf mikrovaskuläre Funktion und Remodeling beurteilen

Erfahren Sie hochauflösende Respirometrie zur Bewertung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien. Diese Methode ermöglicht die Messung der Sauerstoffverbrauchsrate und hilft bei der Unterscheidung von Spermienqualität.

Hochauflösende Respirometrie zur Beurteilung der Mitochondrienfunktion in menschlichen Spermien

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