Name: LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Erfahren Sie die LipidUNet-basierte Quantifizierung von Lipidablagerungen in iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel zur Erforschung der altersbedingten Makuladegeneration. Diese Methode unterstützt die Entwicklung neuer Therapieansätze.

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Wir danken dem Histologie-Kern des National Eye Institute (NEI) für den Einsatz des konfokalen Zeiss-Systems. Diese Arbeit wurde aus Mitteln des NEI IRP (Förderkennzeichen ZIA EY000533-04) unterstützt.

Modellierung und Analyse der Netzhautdegeneration

<ol><li>Kanow, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, e28899(2017).</li>
<li>Adijanto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+utilizes+fatty+acids+for+ketogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium utilizes fatty acids for ketogenesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20570-20582 (2014).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Curcio, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+Biology+and+targeting+via+the+oil+spill+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Soft drusen in age-related macular degeneration: Biology and targeting via the oil spill strategies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (4), AMD160-AMD181 (2018).</li>
<li>Cankova, Z., Huang, J. D., Kruth, H. S., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+low-density+lipoproteins+through+Bruch%27s+membrane+and+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Passage of low-density lipoproteins through Bruch's membrane and choroid.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 947-955 (2011).</li>
<li>Curcio, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esterified+and+unesterified+cholesterol+in+drusen+and+basal+deposits+of+eyes+with+age-related+maculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Esterified and unesterified cholesterol in drusen and basal deposits of eyes with age-related maculopathy.</a> Experimental Eye Research. 81 (6), 731-741 (2005).</li>
<li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360(2021).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+restoring+drugs+suppress+macular+degeneration+phenotypes+in+an+iPSC+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype restoring drugs suppress macular degeneration phenotypes in an iPSC model.</a> Nature Communications. 12 (1), 7293(2021).</li>
<li>Farnoodian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+lipid-handling+defects+in+Stargardt+iPSC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells.</a> Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).</li>
<li>Hallam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+induced+pluripotent+stem+cell+patient+specific+model+of+complement+factor+H+%28Y402H%29+polymorphism+displays+characteristic+features+of+age-related+macular+degeneration+and+indicates+a+beneficial+role+for+UV+light+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+%28Dayton%2C+Ohio%29%22%5BJournal%5D)">An induced pluripotent stem cell patient specific model of complement factor H (Y402H) polymorphism displays characteristic features of age-related macular degeneration and indicates a beneficial role for UV light exposure.</a> Stem Cells (Dayton, Ohio). 35 (11), 2305-2320 (2017).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Issa, P. C., Barnard, A. R., Herrmann, P., Washington, I., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+Stargardt+phenotype+in+Abca4+knockout+mice+through+inhibition+of+vitamin+A+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rescue of the Stargardt phenotype in Abca4 knockout mice through inhibition of vitamin A dimerization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8415-8420 (2015).</li>
<li>GBD 2019 Blindness and Vision Impairment Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blindness+and+Vision+Impairment+Collaborators.+Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years%2C+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020%3A+the+Right+to+Sight%3A+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Blindness and Vision Impairment Collaborators. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Global Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li>
</ol>

Keine Offenlegungen.

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur effizienten Markierung, Abbildung und Quantifizierung von Lipidablagerungen in monogenen und polygenen In-vitro-Krankheitsmodellen für degenerative Augenerkrankungen. Die KI-basierte Software LipidUNet kann auf drei gängige Lipidmarker, APOE, Nile Red und BODIPY, angewendet werden und bietet eine schnelle, automatische Analysemethode, die eine standardisierte und unvoreingenommene Quantifizierung ermöglicht.
Die Haupteinschränkung von LipidUNet ist die Tatsache, dass der Trainingsdatensatz für die KI auf Bilder mit 40-facher Vergrößerung von Zellen beschränkt war, die in einer 96-Well-Platte kultiviert wurden. Aufgrund des Trainingsbildsatzes ist LipidUNet in seiner jetzigen Form auf die Analyse von Bildern mit 40-facher Vergrößerung beschränkt. Die Software kann verwendet werden, um 40-fache Bilder von Zellen zu analysieren, die auf anderen Kulturoberflächen als einer 96-Well-Platte kultiviert wurden, aber es sollte darauf geachtet werden, die generierten Ausgabemasken zu untersuchen, um die genaue Schwellenwertbildung durch die Software zu überprüfen. Es werden mehr Bildsätze (bei unterschiedlichen Vergrößerungen) benötigt, um den Umfang der zu analysierenden Proben/Bilder zu erweitern.
Das Protokoll besteht aus mehreren kritischen Schritten. Im Schritt des Lipidmarkers sollte der Benutzer bestätigen, dass die von ihm gewählte Markierungsverbindung (BODIPY, APOE, Nilrot) seine Probe effektiv markiert hat. Reife RPE-Zellen sind oft stark pigmentiert, was das Fluoreszenzsignal der Antikörper-Immunfärbung beeinträchtigen kann. Wenn das Fluoreszenzsignal schwach ist oder wenn die Hintergrundfärbung zu stark ist, kann LipidUNet Lipidtröpfchen nicht genau erkennen. Aus einem ähnlichen Grund müssen ordnungsgemäß ausgewählte Erfassungseinstellungen für den automatischen Bildgebungsschritt des Protokolls verwendet werden. Wenn die aufgenommenen Bilder von schlechter Qualität sind, hat LipidUNet Schwierigkeiten, die Bilder richtig zu maskieren, und daher ist die Quantifizierung ungenau (Abbildung 6A-L). Schließlich ist die Nachbearbeitung der Bilder ein wichtiger Schritt, da LipidUNet spezifische Anforderungen an die Software stellt, um zu funktionieren.
Im Vergleich zu Workflows für die Lipidanalyse, die manuelle Schwellenwerte verwenden, oder Techniken, die eine automatische Schwellenwertbildung in Software wie Fiji beinhalten, bietet LipidUNet eine unverzerrte und zuverlässige Segmentierung über Bilder mit variabler Lipidablagerung, was sich in einer geringen Fehlerrate bei der Identifizierung von Lipidpartikeln widerspiegelt (Abbildung 7). Die Software ermöglicht dem Benutzer die Eingabe zusätzlicher Trainingsbilder, was die Analyse von Bildsätzen ermöglicht, die über diejenigen hinausgehen, die ein 40-faches Vergrößerungsobjektiv verwenden, oder sogar solche, die einen anderen Lipidmarker verwenden, wie im Protokoll beschrieben. In Zukunft soll die Software darauf trainiert werden, 3D-Bilder zu analysieren, so dass die Quantifizierung des Lipidablagerungsvolumens möglich ist. Degenerative Augenerkrankungen, die die Ablagerung von Lipiden als Hauptursache für die Pathologie implizieren, sind weit verbreitet, und es wird prognostiziert, dass die Fälle mit zunehmender älterer Bevölkerung zunehmenwerden 13. Genaue Krankheitsmodelle und effiziente Analyseinstrumente, wie wir sie in diesem Protokoll skizziert haben, werden die Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen ermöglichen.

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht von Zellen, die sich im hinteren Teil des Auges neben retinalen Photorezeptoren befindet. RPE spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des richtigen Sehvermögens, indem es die Photorezeptoren metabolisch und strukturell unterstützt. Gesunde RPE-Zellen zeichnen sich durch eine ausgeprägte hexagonale Morphologie aus. Sie sind durch Tight Junctions verbunden, die es dem RPE ermöglichen, als Barriere zwischen der auf der Basalseite befindlichen Choriokapillaris und den apikal gelegenen Photorezeptoren zu fungieren. Um das Ökosystem der Netzhaut zu erhalten, transportiert RPE wichtige Metaboliten, z. B. Glukose, so zu den Photorezeptoren, dass der Glukoseverbrauch im RPEminimiert wird 1. Aufgrund dieser Einschränkung ist RPE auf andere Metaboliten angewiesen, um seinen Stoffwechselbedarf aufrechtzuerhalten, einschließlich Fettsäuren, die RPE durch β-Oxidation in Ketone umwandelt2. Angesichts der Neigung von RPE, Fettsäuren, die wahrscheinlich aus der Verdauung des äußeren Photorezeptorsegments (POS) recycelt werden, als Energiequelle zu nutzen, führen nachteilige Veränderungen der Lipidverarbeitungswege bei RPE häufig zu monogenen und polygenen degenerativen Netzhauterkrankungen oder sind daran beteiligt3.
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD), eine polygene degenerative Augenerkrankung, die eine RPE-Degeneration verursacht, wurde ebenfalls mit einer fehlerhaften Autophagie und einem abweichenden Fettstoffwechsel in der RPE-Monoschicht in Verbindung gebracht. Das Versagen einer dysfunktionalen RPE-Monoschicht, POS zu verarbeiten und andere kritische Funktionen auszuführen, führt zu extrazellulären (sub-RPE) Ablagerungen, die als basale lineare Ablagerungen (BLinD) bezeichnet werden und sich zwischen dem RPE und der Bruchschen Membran befinden - ein Kennzeichen von AMD-Pathologien. Zu den Hauptbestandteilen von BLinD gehören Lipoproteine, von denen das Apolipoprotein E (APOE)4 am häufigsten vorkommt. Die Anhäufung dünner BLinD-Schichten kann zu weichen Drusen führen, die als klinisches Symptom der AMD 5,6 anerkannt sind.
Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass aus Stammzellen gewonnene In-vitro-Krankheitsmodelle, die eine RPE-Dysfunktion verursachen, eine Sub-RPE-Lipidakkumulation aufweisen 7,8,9. Hallam et al. (2017) generierten induziertes pluripotentes Stammzell-abgeleitetes RPE (iRPE) von Patienten mit einem hohen Risiko für AMD aufgrund eines Polymorphismus des CFH-Gens. Das iRPE zeigte eine Drusenakkumulation, wie sie durch APOE gekennzeichnet war, und das Hochrisiko-RPE akkumulierte größere Ablagerungen als das iRPE, das von Patienten mit niedrigem Risiko generiert wurde10.
Um ein In-vitro-Modell zu erstellen, das zelluläre Merkmale der AMD, wie z. B. Lipidtröpfchen und Drusenablagerungen, rekapituliert, wurden iRPE-Linien, die aus Blutproben von Patienten generiert wurden, unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten entwicklungsgesteuerten Protokolls etabliert11. Die iRPE wurden komplementkompetentem humanem Serum (CC-HS) unterzogen, einer Lösung, die Anaphylatoxine enthält, die eine mögliche Ursache der AMD nachahmen: eine erhöhte Signalübertragung durch alternative Komplemente8. Die daraus resultierende zelluläre und subzelluläre Ablagerung von Lipidablagerungen wurde mit den gängigen Lipid- und Lipoproteinmarkern APOE, Nile Red und BODIPY gemessen. Anhand dieser Marker konnte gezeigt werden, dass die aktivierte Komplement-Signaltransduktion über CC-HS die Lipidakkumulation in iRPE-Zellen verstärkte8.
Um ein Krankheitsmodell für eine monogene degenerative Erkrankung der Netzhaut zu entwickeln, wurden iRPE-Linien von Patienten mit Morbus Stargardt entwickelt, einer Erkrankung, die durch Mutationen des ABCA4-Gens in RPE verursacht wird. Es wurde bereits gezeigt, dass sich A2E-Lipofuscin, eine intrazelluläre Ablagerung, von der bekannt ist, dass sie hohe Mengen an Phospholipiden und lichtabhängigen Lipidperoxidationsprodukten enthält, im RPE12 ansammelt, wenn ABCA4 ausgeschaltet wird. ABCA4-Knockout-Linien wurden parallel zu den Patientenlinien entwickelt, und beide wurden einer POS-Fütterung unterzogen. Das Stargardt iRPE zeigte eine POS-Phagozytose-induzierte Pathologie mit erhöhter Lipidakkumulation, die durch BODIPY-Färbung quantifiziert wurde. RPE, die aus ABCA4 KO iPSCs gewonnen wurden, wurden einer CC-HS-Behandlung unterzogen; Die Quantifizierung des BODIPY-Signals zeigte auch im Stargardt-Modell einen Defekt im Lipidhandling9.
Angesichts der Prävalenz dieser Krankheiten und des Bedarfs an wirksamen Therapeutika sowie den oben beschriebenen relevanten Krankheitsmodellen besteht die Notwendigkeit, robuste Methoden zur Quantifizierung der Wirksamkeit potenzieller Behandlungen zu etablieren. Um Lipidablagerungen objektiv, automatisiert und standardisiert zu quantifizieren, wurde eine auf maschinellem Lernen basierende Software, LipidUNet, entwickelt, so dass in Kombination mit Maskenanalysewerkzeugen die Lipidablagerung mithilfe der gängigen Marker Nile Red, BODIPY und APOE schnell und effektiv identifiziert werden kann. Die mit dieser Analysepipeline erhaltenen zusammenfassenden Statistiken können dann analysiert und grafisch dargestellt werden, was einen einfachen Vergleich der Behandlungsbedingungen ermöglicht. Der Schaltplan des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls: RPE-Zellen werden auf einer 96-Well-Platte gezüchtet und mit aktivem humanem Serum oder gereinigten Rinderaußensegmenten herausgefordert, um verschiedene Arten von Netzhautdegenerationen in vitro zu modellieren. RPE-Zellen werden fixiert und für Lipoproteinablagerungen mit Nilrot, BODIPY und APOE gefärbt. Ein konfokales Mikroskop wird verwendet, um Z-Stapel von fluoreszenzmarkierten Lipidpartikeln zu erfassen, die anschließend zu 2D-Projektionen mit maximaler Intensität verarbeitet werden. Ein Machine-Learning-Algorithmus wurde darauf trainiert, Lipoproteinpartikel zu erkennen und korrekt zu segmentieren. Zusammenfassende Tabellen mit Partikelanzahl und verschiedenen Formmetriken werden generiert und können für nachfolgende Diagramme und statistische Analysen verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Steriflip Filtersystem</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphat Buffered Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-Triiod-L-thyronin</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Rind, Fraktion V</td><td>MP Biomedical</td><td>160069</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Kaninchen Anti-Ziegen IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21431</td><td>APOE Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>APOE Primärantikörper</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB947</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>Schutz vor Licht</td></tr><tr><td>Komplementär kompetentes Humanserum</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1-LITER</td><td></td></tr><tr><td>CTS N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A13707-01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hyklon</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Dia-Montagemedien</td></tr><tr><td>Glas Deckgläser #1 1/2 22 mm x 22 mm</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72204-01</td><td></td></tr><tr><td>Glasmikroskop Objektträger 25 mm x 75 mm- 1,2 mm dick</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71870-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha</td><td>Life Technologies</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Life</td> Technologies <td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Nilrot</td><td>Sigma</td><td>72485-100MG</td><td>Vor Licht schützen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% Lösung, EM-Qualität</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10x</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Stab Außensegmente (OS)</td><td>InVision Bioresources</td><td>98740</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725274</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14701SA</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>R& D Systeme</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

lipidunet-machine-learning-basierte methode zur charakterisierung und quantifizierung von lipidablagerungen unter verwendung von ipsc-abgeleitetem retinalem pigmentepithel

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht aus hexagonalen Zellen, die sich im hinteren Teil des Auges befindet. Es nährt und unterstützt Photorezeptoren und Aderhautkapillaren, führt eine Phagozytose der äußeren Photorezeptorsegmente (POS) durch und sezerniert Zytokine auf polarisierte Weise, um die Homöostase der äußeren Netzhaut aufrechtzuerhalten. Dysfunktionales RPE, das durch Mutationen, Alterung und Umweltfaktoren verursacht wird, führt zur Degeneration anderer Netzhautschichten und zum Verlust des Sehvermögens. Ein charakteristisches phänotypisches Merkmal degenerierender RPE sind intra- und subzelluläre lipidreiche Ablagerungen. Diese Ablagerungen sind ein häufiger Phänotyp bei verschiedenen degenerativen Erkrankungen der Netzhaut. Um den Lipiddepot-Phänotyp monogener Netzhautdegenerationen in vitro zu reproduzieren, wurde induziertes pluripotentes Stammzell-abgeleitetes RPE (iRPE) aus den Fibroblasten der Patienten erzeugt. Zelllinien, die von Patienten mit Stargardt und spät einsetzender Netzhautdegeneration (L-ORD) generiert wurden, wurden 7 Tage lang mit POS gefüttert, um die physiologische Funktion von RPE zu replizieren, die bei diesen Erkrankungen eine durch POS-Phagozytose induzierte Pathologie verursachte. Um ein Modell für die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) zu entwickeln, eine polygene Erkrankung, die mit alternativer Komplementaktivierung assoziiert ist, wurde iRPE mit alternativen Komplement-Anaphylatoxinen konfrontiert. Die intra- und subzellulären Lipiddepots wurden mit Nilrot, Bor-Dipyrromethen (BODIPY) und Apolipoprotein E (APOE) charakterisiert. Um die Dichte von Lipidablagerungen zu quantifizieren, wurde eine auf maschinellem Lernen basierende Software, LipidUNet, entwickelt. Die Software wurde mit Projektionsbildern von iRPE auf Kulturoberflächen mit maximaler Intensität trainiert. In Zukunft soll es darauf trainiert werden, dreidimensionale (3D) Bilder zu analysieren und das Volumen von Lipidtröpfchen zu quantifizieren. Die LipidUNet-Software wird eine wertvolle Ressource für die Entdeckung von Medikamenten sein, die die Lipidakkumulation in Krankheitsmodellen verringern.

Dieses Protokoll bietet einen Arbeitsablauf zur Identifizierung von Lipidablagerungen, die mit Nilrot, BODIPY und APOE gefärbt wurden. Die entwickelte Software kann Lipidablagerungen automatisch identifizieren und quantifizieren und funktioniert am besten, wenn das skizzierte Protokoll optimiert ist. Enthalten sind Beispiele für erfolgreich differenzierte RPE (Abbildung 3A) und schlecht differenzierte RPE (Abbildung 3B), da die Qualität des Zellmodells einen großen Einfluss auf die Qualität der korrekten Bildsegmentierung hat.
Zwei der drei im Protokoll beschriebenen Marker, Nile Red und BODIPY, werden als kleine kreisförmige Punkte identifiziert, die in fluoreszierenden Bildern deutlich hell sind (Abbildung 5 und Abbildung 6). Ein "positives" Bild aus dem Protokoll wäre eine geeignete Identifizierung dieser unterschiedlichen Lagerstätten (Abbildung 5A-D und Abbildung 5E-H). Ein "negatives" Ergebnis würde eine falsche Segmentierung des Bildes zeigen, indem die Hintergrundfluoreszenz als Ablagerung verwechselt wird, entweder aufgrund einer schwachen Färbung (Abbildung 6A-C und Abbildung 6D-F) oder aufgrund einer hohen Hintergrundintensität (Abbildung 6G-I).
APOE-Ablagerungen haben eine Vielzahl von Größen und Formen und erscheinen eher oval oder unregelmäßig als die kreisförmigen Ablagerungen von Nilrot und BODIPY. Diese Ablagerungen sind auch weniger punktförmig, und die Signalintensität kann zwischen den Ablagerungen aufgrund von Schwankungen in der Permeabilisierung der Probe variieren. Eine korrekte Identifizierung identifiziert jede Lagerstätte, einschließlich derjenigen, die weniger gesättigt sind (Abbildung 5I-L), während eine falsche Segmentierung diese Lagerstätten nicht erfasst (Abbildung 6J-L). Daher ist es wichtig, die Färbe- und Bildgebungsmethoden zu optimieren, um drastische Abweichungen zu vermeiden. Eine Möglichkeit, dies zu tun, besteht darin, bei der Immunfärbung sorgfältig auf die Schritte der Probenpermeabilisierung zu achten. Um das Fluoreszenzsignal zu optimieren, können die Zellen vor der Fixierung und Immunfärbung für APOE lysiert werden, was zu einer gleichmäßigen Sättigung und besseren Segmentierung der APOE-Ablagerungen führt.
Bereitgestellt werden auch segmentierte Bilder von Zellen, die auf einer anderen Kulturplattform als einer 96-Well-Platte gereift sind. Die LipidUNet-Software wurde mit Bildern von Zellen ausgeführt, die auf einem Transwell kultiviert wurden, und während die Lipidablagerungen einen Schwellenwert aufweisen, sind dies auch die Poren in der Transwell-Membran (Abbildung 6M-O). Aufgrund der Ähnlichkeit in Form und Größe maskiert die LipidUNet-Software in ihrer jetzigen Form wahllos sowohl die Lipidablagerungen als auch die Transwellporen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse. (A,E,I) 96-Well-plattierte RPE werden mit Hoechst-Kernfärbung (blau) und entweder Nilrot (Magenta), BODIPY (grün) oder APOE (orange) gefärbt und sind die Projektionen der maximalen Intensität eines Z-Stapels. (B,F,J) Die Graustufen-Eingabebilder für die LipidUNet-Software nach der Bildverarbeitung. (C,G,K) Von LipidUNet generierte Masken, bei denen alle Ablagerungen korrekt identifiziert werden. (D,H,L) Die Umrisse der einzelnen maskierten Partikel sind nummeriert. Diese Beschriftungen ermöglichen es, jedes Partikel im Bild mit einem Eintrag im Spreadheet mit den Rohdaten zu verbinden. (A-D) zeigt eine Nilrot-Färbung, und die Software ist in der Lage, die Ablagerungen vor dem Hintergrund trotz eines schwächeren Signals genau zu erkennen. (E-H) zeigt einen starken Kontrast zwischen dem BODIPY-Signal und dem Hintergrund, was ideal ist. LipidUNet identifiziert jede Ablagerung im Bild korrekt. (I-L) zeigt ein starkes APOE-Signal und repräsentiert die Variabilität der Signalsättigung, die bei dieser Färbung häufig zu beobachten ist. Nichtsdestotrotz ist die Bildsegmentierung in der Lage, die Grenzen jeder APOE-Lagerstätte zu identifizieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig06.jpg"> Abbildung 6: Suboptimale Ergebnisse. (A,D,G,J,M) 96-gut plattierte RPE werden mit Hoechst-Kernfärbung (blau) und entweder Nilrot (Magenta), BODIPY (grün) oder APOE (orange) gefärbt und sind die maximalen Intensitätsprojektionen eines Z-Stapels. (B,E,H,K,N) Die Graustufen-Eingabebilder für die LipidUNet-Software nach der Bildverarbeitung. (C,F,I,L,O) Die falschen Masken, die von LipidUNet generiert wurden. Rote Kreise zeigen an, wo die Software eine Lipidablagerung falsch erkannt hat. (A-C) Die Verarbeitung von Nile Red ist fehlerhaft, da die Software die Hintergrundfärbung als Ablagerung identifiziert hat. Dies kann häufiger passieren, wenn ein hoher Hintergrund, aber nur wenige Lipidablagerungen im Bild vorhanden sind. Es werden zwei Beispiele für BODIPY-Färbung gezeigt: eine schlechte Bildqualität aufgrund einer (D-F) schwachen BODIPY-Färbung und (G - I) ein starkes BODIPY-Signal mit hohem Hintergrund. In beiden Fällen ist die Software nicht in der Lage, kleine, kreisförmige Lipidablagerungen von dem kreisförmigen Ring im Hintergrund zu unterscheiden, der den Zellkern umgibt. Während die Färbung und Bildgebung optimiert werden sollten, um diese Fehler zu vermeiden, ist die neueste Version von LipidUNet für diese Bilder weitgehend verbessert. (J-L) Falsche APOE-Segmentierung. Da die Ablagerungen in Größe und Signalsättigung variabler sind, hat die Software Schwierigkeiten, einige Ablagerungen zu erkennen. (M-O) RPE auf ein Transwell gesät und mit Nilrot gefärbt. Hier ist ein Ausschnitt des Z-Stapels mit Nilrot-Lipidablagerungen und Transwell-Poren dargestellt. Die Software ist nicht in der Lage, zwischen den beiden zu unterscheiden, wie der rote Kreis mit den Transwell-Poren und der grüne Pfeil, der auf die Ablagerungen von Nil Red zeigt, zeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65503/65503fig07.jpg"> Abbildung 7: Vergleich des Maskenwerkzeugs. (A,B,C) 96-Well-plattierte RPE mit unterschiedlichen Mengen an Lipidablagerungen werden mit Nilrot (rot) identifiziert. Die Bilder werden mit drei verschiedenen gängigen Maskierungsmethoden maskiert: Find Maxima, Max Entropy und Renyi Entropy, und mit der von LipidUNet generierten Maske verglichen. Das Originalbild wird von einer manuellen Zählung der Lipidablagerungen begleitet, während die Masken die vorhergesagten Zahlen für jede Segmentierungsmethode anzeigen. Die durchschnittliche Fehlerquote wurde für jede Segmentierungsmethode mit folgender Formel berechnet: Mittelwert[(|Prognostizierte Anzahl - Manuelle Zählung|/Manuelle Zählung) x 100]. Die von LipidUNet generierte Maske identifiziert im Vergleich zu anderen Maskierungsmethoden Lipidablagerungen in Bildern mit variabler Ablagerung genauer (durchschnittliche Fehlerraten: 23 % LipidUnet, 1164 % Find Maxima, 851 % Max Entropy, 203 % Renyi Entropy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65503/65503fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestandteil</td>
			<td>Kat-Nummer</td>
			<td>Aktien-Konz.</td>
			<td>Finale Konz.</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>MEM alpha</td>
			<td>12571-063</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
			<td>500</td>
		</tr><tr><td>N2-Ergänzung</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>NA</td>
			<td>1%</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes FBS</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>NA</td>
			<td>5%</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>NMEM NEAA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>10mM</td>
			<td>0,01 Mio.</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Natriumpyruvat</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>100mM</td>
			<td>1mM</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10000u/ml</td>
			<td>100U/ml</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Taurin</td>
			<td>T4571</td>
			<td>50mg/ml</td>
			<td>250ug/ml</td>
			<td>2.5</td>
		</tr><tr><td>Hydrocortison</td>
			<td>H6909</td>
			<td>18,1 mg/l</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0.553</td>
		</tr><tr><td>T3</td>
			<td>T5516</td>
			<td>20ug/L</td>
			<td>0,013 ug/L</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Gesamtvolumen, ml</td>
			<td>548.383</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammensetzung der RPE-MM-Reagenzien. Eine Liste der Reagenzien und optimalen Konzentrationen für RPE-MM.

Degenerative Augenerkrankungen, die die retinale Pigmentepithelschicht des Auges betreffen, sind monogenen und polygenen Ursprungs. Mehrere Krankheitsmodelle und eine Softwareanwendung, LipidUNet, wurden entwickelt, um Krankheitsmechanismen sowie mögliche therapeutische Interventionen zu untersuchen.

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to ...

In dieser Studie wollen wir die altersbedingte Pathogenese der Makrodegeneration verstehen und eine mögliche Behandlung dafür finden. Diese halbautomatische Pipeline für die Lipidtröpfchenanalyse bietet ein robustes System zur Untersuchung des Stoffwechsels und von Alterungskrankheiten. Unser Labor konzentriert sich auf die Suche nach Wirkstoffzielen für die Behandlung von AMD, entweder mit Hilfe von genetischen oder niedermolekularen Screenings, die darauf abzielen, die Ansammlung von Lipidablagerungen zu reduzieren.

lipidunet-machine-learning-based-method-characterization

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die microRNA (miRNA)-Profile der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (iPS-RPE) und fetale RPE abgeleitet, wurden verglichen.

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

Das retinale Pigmentepithel (RPE) unterstützt die sensorische Netzhaut durch das Recycling von Nebenprodukten des visuellen Zyklus, die sich als Lipofuszin ansammeln. Diese Produkte sind autofluoreszierend und können in vivo qualitativ abgebildet werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur quantitativen Abbildung von RPE-Lipofuszin mittels konfokaler Scanning-Laser-Ophthalmoskopie.

Quantitative Fundus-Autofluoreszenz für die Beurteilung von Netzhauterkrankungen

Wir beschreiben eine Methode, um retinales Pigmentepithel (RPE) effizient von der Netzhaut im menschlichen Auge zu trennen und ganze RPE/Aderhaut-Flatmounts für histologische und morphometrische Analysen des RPE zu generieren.

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Dieses Protokoll beschreibt ein Lipofuszin-Akkumulationsmodell in hochdifferenzierten und polarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) und einen verbesserten Phagozytose-Assay des äußeren Segments (OS), um die gesamte OS-Verbrauchs-/Abbaukapazität des RPE zu bestimmen. Diese Methoden überwinden die Einschränkungen bisheriger Lipofuszin-Modelle und klassischer Puls-Chase-Phagozytose-Assays im äußeren Segment.

Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen

Die vorliegende Studie beschreibt dezellularisierungsbasierte Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der Ablagerung von intramuskulärem Fettgewebe (IMAT) durch intaktes Muskelvolumen sowie zur Quantifizierung von Metriken einzelner Adipozyten, aus denen IMAT besteht.

Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

Nil rote Färbung der festen Caenorhabditis Elegans ist eine Methode zur quantitativen Messung der neutral Lipid Ablagerungen, während Öl rote Färbung O qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den Geweben ermöglicht.

Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung

Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

Die Bildung eines richtigen Sarcomere-Netzwerks ist wichtig für die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Wir präsentieren einen super Auflösungs-basierten Ansatz, der die quantitative Bewertung der strukturellen Reifung von Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten ermöglicht, um die Kulturbedingungen zu verbessern, die die Herzentwicklung fördern.

Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

Erfahren Sie die LipidUNet-basierte Quantifizierung von Lipidablagerungen in iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel zur Erforschung der altersbedingten Makuladegeneration. Diese Methode unterstützt die Entwicklung neuer Therapieansätze.

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel (Video) | JoVE Journal

LipidUNet-Machine-Learning-basierte Methode zur Charakterisierung und Quantifizierung von Lipidablagerungen unter Verwendung von iPSC-abgeleitetem retinalem Pigmentepithel

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