Name: Optimierter intravitaler Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Dynamik des Epithelgewebes auf einem inversen konfokalen Mikroskop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Erfahren Sie einen optimierten intravitalen Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Epitheldynamik bei lebenden Mäusen mit inverser konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht stabile Z-Stack-Aufnahmen über mehrere Stunden.

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Wir danken Valentina Greco für die K14-mCherry-H2B Mäuse. Wir danken der Maschinenwerkstatt des Emory University Physics Department für die Herstellung der Deckglasscheiben. Diese Arbeit wurde finanziert durch den Career Development Award #IK2 BX005370 des US Department of Veterans Affairs BLRD Service an LS, die NIH Awards RF1-AG079269 und R56-AG072473 an MJMR und den I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award an MJMR.

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Emory University und des Atlanta Veterans Affairs Medical Center für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.
1. Einbau des Live-Imaging-Einsatzes auf den inversen Mikroskoptisch
<ol><li>Erstellen Sie die Einfügung mithilfe von STL-Dateien (Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2 und Ergänzungsdatei 3), die die 3D-Abmessungen und das Design angeben (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2A), einen 3D-Drucker und Polymilchsäure (PLA).</li>
	<li>Setzen Sie den Einsatz (Abbildung 2B,C) vorsichtig in die große Nut des Mikroskoptisches ein (Abbildung 2C und Abbildung 3A). Befestigen Sie den Einsatz mit Schrauben über vier Schraubenlöcher in jeder Ecke des Einsatzes (Abbildung 2B-C). HINWEIS: Der Einsatz ist bidirektional und kann je nach Ausrichtung des Mikroskoptisches und des Anästhesiegeräts um 180° gedreht werden.</li>
	<li>Schieben Sie die Heizplatte mit der Seite nach unten in den Einsatzstopfen (Abbildung 2D), sodass das Gerät auf den unteren Einsatznuten liegt und der Steckeranschluss unter dem Tisch verläuft (Abbildung 3B).</li>
	<li>Richten Sie die gerillte kreisförmige Öffnung im Einsatz mit einem 40-fachen Silikonöl-Tauchobjektiv aus (Abbildung 3C) und tragen Sie Silikonöl auf die Mitte des Objektivs auf.<ol><li>Wenn Sie über einen längeren Zeitraum (>1 h) fotografieren, tragen Sie einen großzügigen Klecks Öl auf, der während der gesamten Bildgebung an der Schnittstelle zwischen Deckglas und Objektiv verbleibt. Achten Sie darauf, dass kein Öl über die Ränder des Objektivs läuft.</li>
	</ol></li>
	<li>Tragen Sie mit einer Spritze eine kleine Menge Vakuumfett entlang der gerillten kreisförmigen Öffnung auf und legen Sie die Deckglasscheibe darauf, um den Einsatz zu versiegeln (Abbildung 3D). HINWEIS: Die Deckglasscheibe wird hergestellt, indem die Wände einer 35 mm x 10 mm großen Zellkulturschale mit Glasboden entfernt werden (durchgeführt von einer Maschinenwerkstatt).</li>
	<li>Heben Sie das 40-fache Objektiv an, bis das Öl die Unterseite des Deckglases küsst.</li>
</ol>2. Isofluran-Konfiguration und Mausvorbereitung
<ol><li>Positionieren Sie die Komponenten des elektronischen Verdampfers mit geringem Durchfluss (Anästhesiekammer, Schlauch, Verdampfer, Aktivkohlekanister) so, dass der Nasenkonus und der angeschlossene Schlauch den Einsatz erreichen können (Abbildung 3A). VORSICHT: Isofluran ist ein Inhalationsanästhetikum und sollte mit Vorsicht gehandhabt werden, um ein Verschütten zu vermeiden und die Exposition des Menschen zu minimieren.</li>
	<li>Messen Sie das Gewicht der Isofluranflasche vor Gebrauch und protokollieren Sie. Befestigen Sie die Kappe des elektronischen Vaporizers an der Isofluranflasche.</li>
	<li>Schließen Sie das Netzkabel an den elektronischen Vaporizer an. Schließen Sie die blauen Nasenkonus-Clips und öffnen Sie die weißen Induktionskammer-Clips, um einen Luftstrom durch die Kammer in den Aktivkohlekanister zu ermöglichen. Entfernen Sie die rote Umgebungsluftkappe von der linken Seite des Geräts, um den Luftstrom zu ermöglichen.</li>
	<li>Lassen Sie das System 5 Minuten lang bei 200 ml/min (geringer Durchfluss) und 2 % Isofluran aufwärmen. HINWEIS: Obwohl die Nasenkonuseinstellung ausgewählt ist, sollte die blaue Nasenkonusleitung geschlossen bleiben und die weiße Induktionskammerleitung offen bleiben.</li>
	<li>Sobald das System richtig ausbalanciert ist, spülen Sie die Leitungen, um das verbleibende Isofluran aus der Kammer zu entfernen.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer und wählen Sie High Flow. Schließen Sie alle Vorbereitungen für die Maus ab (d. h. Haarentfernung, topische Verabreichung von Medikamenten, Auftragen von Augensalbe usw.), bevor Sie den Körper des Tieres auf den Einsatz legen. Vergewissern Sie sich, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie die Zehenkneifreflexmethode anwenden.<ol><li>Verwenden Sie mit gestrecktem Bein einen Fingernagel, um den Zeh fest einzuklemmen, ohne körperliche Schäden zu verursachen. Wenn die Maus eine positive Reaktion auf den Reiz zeigt (z. B. Zurückziehen des Beins, Zucken des Fußes usw.), setzen Sie die Verabreichung des Anästhetikums in der Kammer fort, bis keine Reaktion mehr beobachtet wird. Nach entsprechender Betäubung sollte sich die Atemfrequenz der Maus auf ~55-65 Atemzüge pro Minute verlangsamen18.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn die Maus vollständig betäubt ist, wählen Sie erneut High Flow, um die Isofluran-Verabreichung zu stoppen. Spülen Sie die Kammer vor dem Öffnen und stellen Sie die Clips (blau: offen; weiß: geschlossen) so ein, dass Isofluran durch den Nasenkonus abgegeben wird. Wählen Sie Low Flow, während der Nasenkonus an der Maus befestigt ist, um die Verabreichung von Isofluran fortzusetzen.</li>
	<li>Isofluran-Schlauch mit dem aufgesetzten Nasenkonus durch die Eckrohrhalterung am Einsatz führen (Abbildung 3A und Abbildung 5).</li>
</ol>3. Platzierung der Maus auf dem Einsatz für die intravitale Bildgebung
<ol><li>Schließen Sie die Heizplatte an den Controller an (mit angeschlossener Analsonde), schalten Sie sie ein und lassen Sie die Platte 36 °C erreichen (Abbildung 4A).</li>
	<li>Nehmen Sie die betäubte Maus aus der Induktionskammer und legen Sie sie quer über die Heizplatte (Abbildung 4B und Abbildung 5A). Führen Sie den Transfer von der Kammer zum Einsetzen schnell durch, um die Zeit zu minimieren, in der die Maus ohne Inhalationsanästhesie aktiv ist.</li>
	<li>Befestigen Sie den Nasenkonus an der Maus (Abbildung 4B, C und Abbildung 5). Verwenden Sie bei Bedarf Klebeband, um den Winkel und die Positionierung des Nasenkonus weiter zu sichern.</li>
	<li>Führen Sie die Analsonde ein und stellen Sie die Temperatur des Reglers ein, bis die Körpertemperatur der Maus stabil bei ~36 °C liegt (Abbildung 4A,B). Nachdem die Maus richtig positioniert ist, verwenden Sie bei Bedarf eine Frischhaltefolie, um die Wärme einzufangen und die entsprechende Körpertemperatur weiter zu unterstützen (Abbildung 4C).</li>
	<li>Positionieren Sie die Maus so, dass der Kopf mit der Deckglasscheibe ausgerichtet ist, und fixieren Sie das Ohr mit einem Ohrclip aus Metall (Abbildung 5A,B) oder Klebeband (Abbildung 5C) in der Mitte des Deckglases. HINWEIS: Der Druck des Ohrclips aus Metall auf das Ohr kann durch Lösen der Schraube, mit der der Clip am Einsatz befestigt ist, eingestellt werden. Eine Metallfeder kann hinzugefügt werden, um die Flexibilität beim Anziehen des Clips zu erhöhen.<ol><li>Um die Position des Ohrclips zu ändern, lösen Sie die Schraube mit einem 2,5-mm-Inbusschlüssel und übertragen Sie sie an die sekundäre Stelle (Abbildung 2B,C). Wenn Sie den Ohrclip wieder zusammenbauen, legen Sie den Clip an den Einsatz, gefolgt von der Unterlegscheibe darauf. Befestigen Sie den Clip mit einer Schraube mit leichtem Kraftaufwand, um den Clip zu schwenken.</li>
	</ol></li>
	<li>Passen Sie die Z-Positionierung des Objektivs an, bis sich die Zellen innerhalb der Fokusposition befinden (Abbildung 6A,D). Stellen Sie den Z-Stapel und die Zeitrafferparameter entsprechend den experimentellen Zielen ein und beginnen Sie mit der Bildaufnahme. HINWEIS: Wenn die richtige Einstellung erreicht ist, kann das Mausohr für mindestens 3 aufeinanderfolgende Stunden abgebildet werden (Abbildung 6A',D').<ol><li>Sobald die Z-Stack-Grenzen festgelegt sind, passen Sie die Laserleistung und -verstärkung an, um sicherzustellen, dass keine Z-Ebene übersättigt ist, um das Photobleaching zu minimieren. Bestimmen Sie die Zeitrafferparameter anhand der Gesamtdicke des Z-Stapels, der Schrittnummern (Nyquist-Abtastung empfohlen) und der Zeitintervalle.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Bildgebungsparameter (Zeitintervalle, Gesamtbildgebungszeit usw.) anhand mehrerer Faktoren, einschließlich der Lebensfähigkeit des Tieres unter Narkose, laserinduzierter Photobleichung/Phototoxizität und des Ziels der Live-Bildgebung (d. h. Zellteilungsdynamik, Zell-Zell-Interaktionen usw.).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Beendigung der Bildgebung
<ol><li>Schalten Sie das wasserumwälzende Heizkissen ein und stellen Sie es mindestens 30 Minuten lang auf Dauerzyklus und 35 °C ein, bevor die Bildaufnahme beendet wird.</li>
	<li>Wählen Sie nach Abschluss der Bildgebung Low Flow auf dem elektronischen Vaporizer, um die Isofluran-Abgabe zu stoppen, und bewegen Sie die Maus auf ein Wärmekissen, bis sie gehfähig ist.</li>
	<li>Sobald Sie wach sind, bewegen Sie die Maus zurück zum Transferbehälter, während Sie sie weiterhin auf einem Wärmekissen halten, bis Sie vollständig gehfähig sind. Überwachen Sie die Maus konsequent, während sie sich auf dem Wärmekissen befindet, bis sie reagiert.</li>
	<li>Klicken Sie auf dem elektronischen Vaporizer auf Menü auswählen > Anästhesiesteuerung > leer. Nehmen Sie die Isofluranflasche aus dem System und setzen Sie die Kappe des Herstellers wieder auf die Flasche.</li>
	<li>Messen Sie das Gewicht der Isofluranflasche und des Aktivkohlekanisters und tragen Sie die Gewichte in das Protokoll ein. Sobald der Aktivkohlekanister 50 g über dem Ausgangswert wiegt, entsorgen Sie den Kanister und ersetzen Sie ihn durch ein neues Gerät. Lege das Isofluran zurück in den Tresorkasten.</li>
	<li>Entfernen Sie das Deckglas und wischen Sie es mit Linsenpapier und Linsenlösung ab. Richtig lagern, um Kratzer bei der Wiederverwendung zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Anästhesieschlauch aus der Einsatzhalterung und schrauben Sie den Einsatz vom Mikroskoptisch ab.</li>
</ol>

Intravitale Bildgebung mit einem inversen Mikroskop zur Verfolgung der Dynamik von Hautzellen

<ol><li>Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+metastatic+pulmonary+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment.</a> Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).</li>
<li>Nal Chen,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+promote+glioblastoma+tumor+cell+migration+after+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after biopsy.</a> Cells. 11 (14), 2196(2022).</li>
<li>Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+study+platelet-leukocyte-endothelial+interactions+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver.</a> Journal of Visualized Experiments. 188 (188), (2022).</li>
<li>Rios, A. C., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+imaging+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidimensional imaging of breast cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 13 (5), (2022).</li>
<li>Fischer, M., Edelblum, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+to+visualize+murine+small+intestinal+intraepithelial+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy to visualize murine small intestinal intraepithelial lymphocyte migration.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li>
<li>Pineda, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+hair+follicle+regeneration+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse.</a> Nature Protocols. 10 (7), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Turk, M., Biernaskie, J., Mahoney, D. J., Jenne, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+techniques+to+image+wound+healing+in+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy techniques to image wound healing in mouse skin.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-180 (2022).</li>
<li>Pal Arndt,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+3D+intravital+look+at+the+juxtaglomerular+renin-cell-niche+reveals+an+individual+intra%2Fextraglomerular+feedback+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A quantitative 3D intravital look at the juxtaglomerular renin-cell-niche reveals an individual intra/extraglomerular feedback system.</a> Frontiers in Physiology. 13, 980787(2022).</li>
<li>Oal Yam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+conversion+to+a+tumor-killing+phenotype+underpins+effective+microbial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil conversion to a tumor-killing phenotype underpins effective microbial therapy.</a> Cancer Research. 83 (8), 1315-1328 (2023).</li>
<li>Huang, S., Rompolas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+for+intracutaneous+imaging+of+stem+cell+activity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice.</a> Experimental Dermatology. 26 (5), 379-383 (2017).</li>
<li>Durr, N. J., Weisspfennig, C. T., Holfeld, B. A., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+imaging+depth+of+two-photon+autofluorescence+microscopy+in+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Maximum imaging depth of two-photon autofluorescence microscopy in epithelial tissues.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (2), 026008(2011).</li>
<li>Tauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+risks+of+multiphoton+microscopy+in+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advantages and risks of multiphoton microscopy in physiology.</a> Experimental Physiology. 87 (6), 709-714 (2002).</li>
<li>Yoshitake, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+between+confocal+and+multiphoton+microscopy+for+rapid+histopathological+evaluation+of+unfixed+human+breast+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Direct comparison between confocal and multiphoton microscopy for rapid histopathological evaluation of unfixed human breast tissue.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (12), 126021(2016).</li>
<li>Mesa, K., Rompolas, P., Zito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-induced+cell+death+and+epithelial+phagocytosis+regulate+hair+follicle+stem+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Niche-induced cell death and epithelial phagocytosis regulate hair follicle stem cell pool.</a> Nature. 522, 94-97 (2015).</li>
<li>Ral Li,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+marks+a+cellular+lineage+with+distinct+contributions+to+myofibroblasts+in+lung+maturation+and+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Pdgfra marks a cellular lineage with distinct contributions to myofibroblasts in lung maturation and injury response.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Tal Tumbar,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303 (5656), 359-363 (2004).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), 5563(2011).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung von intakten Hautepithelien der Maus auf inversen konfokalen Mikroskopen ermöglicht. Diese Erfindung besteht aus PLA, dem gebräuchlichsten und kostengünstigsten 3D-druckbaren Material; Alle internen 3D-Druckkosten für diesen Einsatz belaufen sich auf 5 <$. Die beiden separaten Einlegeteile (Abbildung 1, Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2) lassen si...

Die intravitale Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Überwachung des Zellverhaltens in ihrer ungestörten In-vivo-Umgebung ermöglicht. Diese einzigartige Methode hat wichtige Einblicke in das Innenleben komplexer Organsysteme von Säugetieren geliefert, darunter Lunge1, Gehirn2, Leber3, Brustdrüse4, Darm5 und Haut6. Darüber hinaus hat dieser Ansatz Zellverhaltensänderungen während der Tumorentwicklung7, der Wundheilung8,9, der Entzündung10 und anderer verschiedener Pathologien in situ aufgedeckt. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Verbesserung der Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie zur Abbildung von Live-Epithel- und Stromadynamik in intakter Maushaut. Das Verständnis des Zellverhaltens in der Haut von Säugetieren ist aufgrund der bemerkenswerten regenerativen und tumorigenen Fähigkeit dieses Gewebes von großer klinischer Bedeutung.
Die intravitale Bildgebung bei Mäusen wurde hauptsächlich mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen durchgeführt, da diese eine hochauflösende Bildgebung in Gewebetiefen >100 μm ermöglichen11,12. Nichtsdestotrotz fehlt diesen Instrumenten die Vielseitigkeit und allgemeinere Zugänglichkeit von inversen konfokalen Mikroskopen, die benutzerfreundlicher und kostengünstiger sind, die Möglichkeit bieten, kultivierte Zellen abzubilden, bei der Bildaufnahme keine völlige Dunkelheit erfordern und im Allgemeinen sicherer sind, neben anderen bemerkenswerten Vorteilen13,14. In dieser Studie stellen wir ein neues Werkzeug vor, das die Zugänglichkeit der intravitalen Bildgebung erheblich verbessert, indem es diesen Ansatz für inverse konfokale Mikroskope adaptiert.
Hier präsentieren wir ein 3D-gedrucktes, kundenspezifisches Tischeinsatzdesign, das mehrere Schlüsselfunktionen enthält, um eine stabile, langfristige intravitale Bildgebung der Ohrhaut von Mäusen auf einem inversen konfokalen Mikroskop zu ermöglichen (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5). Zu diesen speziellen Merkmalen gehört ein versetztes Objektivloch, das es ermöglicht, dass der gesamte Körper einer erwachsenen Maus während der Bildgebung völlig flach liegt. Dies minimiert die Vibrationsstörung der Körperbewegungen von Mäusen bei der Bildgebung und eliminiert die Notwendigkeit, Ketamin und Xylazin zu verabreichen, um die Atmung zu dämpfen, eine Praxis, die oft mit intravitaler Bildgebung gekoppelt ist6. Darüber hinaus positionieren Eckklammern am Einsatz einen Isofluran-Nasenkonus korrekt, um sich an der Vorderseite der Maus auszurichten, ein Ohrclip aus Metall immobilisiert das Mausohr an einer speziell angefertigten Deckglasscheibe, und eine optionale abnehmbare Biofeedback-Heizplatte mit geschlossenem Regelkreis liegt bündig im Einsatz, um die Körpertemperatur der Maus bei langen Bildgebungssitzungen zu unterstützen. Die maßgeschneiderte Deckglasscheibe, die eine flache Oberfläche bietet, die für das flache Liegen des Mauskopfes und des Ohrs unerlässlich ist, wurde in einer Maschinenwerkstatt hergestellt, indem die Wände einer generischen Deckglasschale mit Zellkulturschalen entfernt wurden. Die Verwendung einer 40-fachen Silikonöl-Immersionslinse (1,25 numerische Apertur [N.A.], 0,3 mm Arbeitsabstand) in Verbindung mit der Deckglasscheibe und dem benutzerdefinierten Tischeinsatz liefert hochauflösende Bilder >50 μm tief in die Ohrdermis.
Um die Funktionalität dieses neuen inversen Mikroskoptischeinsatzes zu testen, haben wir Z-Stapel, die alle epidermalen Epithelschichten umfassen, über einen Zeitverlauf von 3 Stunden im Ohr einer lebenden transgenen K14-H2B-mCherry15 adulten Maus aufgenommen (Epithelkerne in dieser Mauslinie enthalten eine rot fluoreszierende Markierung) (Abbildung 6A-A'). Wir haben auch Z-Stapel aufgenommen, die sich über mehrere Fibroblastenschichten innerhalb der Hautdermis erstrecken, über einen Zeitverlauf von 3 Stunden im Ohr eines lebenden transgenen Pdgfra-rtTA16; pTRE-H2B-GFP17 adulte Maus (Fibroblastenkerne in dieser Mauslinie enthalten nach Doxycyclin-Induktion eine grün fluoreszierende Markierung) (Abbildung 6B-D'). Unsere hochauflösenden Daten zeigen eine gleichbleibende Stabilität durch keine Drift in der x-, y- und z-Ebene und belegen damit die Wirksamkeit dieses neuen intravitalen Bildgebungswerkzeugs für den Einsatz an inversen Mikroskopen. Wichtig ist, dass die Abmessungen dieses 3D-gedruckten Tischeinsatzes angepasst werden können, wie in Zusatzdatei 1, Zusatzdatei 2 und Zusatzdatei 3 beschrieben, um in jedes inverse Mikroskop zu passen, und die Positionierung der Objektivöffnung kann an alternative Stellen innerhalb des Einsatzes verschoben werden, um der Abbildung eines bestimmten Gewebe- und/oder Tiermodells von Interesse besser gerecht zu werden. Diese Erfindung kann somit einzelne Laboratorien oder Forscher mit konfokalem Zugang zu Kerneinrichtungen in die Lage versetzen, dieses Werkzeug an ihre einzigartigen intravitalen Bildgebungsanforderungen anzupassen und dadurch die Bewertung verschiedener In-vivo-Zellbiologie zu rationalisieren.

<table><tbody><tr><td>3D-Drucker</td><td>Qudi Tech</td><td>i-Fast</td><td>3D-Drucke mit PLA-Material</td></tr><tr><td>40x 1,25NA Silikon-Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxR Laser-Scanning-Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>VWR</td><td>76337-046</td><td>Creme-/Salbenapplikation</td></tr><tr><td>Doxycyclin-Hyclat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>Induziert die GFP-Markierung von Fibroblastenkernen in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP</td></tr><tr><td>Schlitzschraubendreher für Mäuse (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Affiix-Einsatz für Mikroskoptisch</td></tr><tr><td>Flachkopfschrauben x 4 (#6-32)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Schraubeinsatz in Mikroskoptisch</td></tr><tr><td>Glasboden-Kulturschale</td><td>chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1811-002</td><td>Modifiziert durch Entfernen der Wände der Schale zur Verwendung als Deckglasscheibe kompatibel mit Live-Einsatz; 35 mm breite Scheibe enthält 20 mm breites Glasdeckglas; von der Werkstatt entfernt</td></tr><tr><td>Heizplattenregler</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td>Tiertemperaturregler - Niederspannung; Analaufsatz zur Überwachung der Körpertemperatur der Maus</td></tr><tr><td>Sechskantschlüssel (1,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Für die Einstellung der M3-Stellschraube</td></tr><tr><td>Sechskantschlüssel (2,5 mm)</td><td></td><td></td><td>Einstellen der Spannung am Metallohrclip</td></tr><tr><td>Intravital Imaging Insert</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Med-Vet International</td><td>HPA030782-100uL</td><td>Maus-Anästhesie-Beschriftungsband</td></tr><tr><td>(oder Scotch-Band)</td><td>VWR</td><td>10127-458</td><td>Alternative zum Metall-Ohrclip zum Immobilisieren des Ohrs zum Deckglas</td></tr><tr><td>Metallverschluss,</td><td></td><td></td><td>der als Ohrclip verwendet wird</td></tr><tr><td>Maus: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:034459</td><td>Fibrroblasten-spezifischer Promotor, der die Doxycyclin-induzierbare rtTA-Expression antreibt</td></tr><tr><td>Maus: K14-H2BPAmCherry</td><td>Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Valentina Greco von der Yale University</td><td></td><td>Markierung epidermaler Epithelzellkerne mit mCherry; im Text als "K14-H2B-mCherry" bezeichnetMaus</td></tr><tr><td>: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:005104</td><td>&nbsp; Markiert Fibroblastenkerne mit GFP in Kombination mit Pdgfra-rtTA und induziert mit Doxycyclin</td></tr><tr><td>Mehrzweck-Siegelfolie</td><td>Glad</td><td></td><td>Enhance Mauswärme</td></tr><tr><td>Optixcare</td><td>VWR</td><td>MSPP-078932779</td><td>Augenschmiermittel</td></tr><tr><td>Stellschrauben x 3 (M3; 6 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SS3M6</td><td>Aufsatz für Heizplattenmodul</td></tr><tr><td>Silikon Immersionsöl</td><td></td><td></td><td>aufgetragen auf 40x Silikon objective</td></tr><tr><td>Small Animal Heating Plate</td><td>Physitemp</td><td>HP-4M</td><td>Versorgt Tiere mit Wärme</td></tr><tr><td>Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td>Mausanästhesie</td></tr><tr><td>Vakuumfett</td><td>Flinn</td><td>Scientific AP1095</td><td>versiegelt Deckglasscheibe zum Einsetzen der</td></tr><tr><td>Veet-Haarentfernung</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wasserzirkulierendes Wärmekissen</td><td>Stryker Medical</td><td>TP700</td><td>für die Wiederbelebung von Mäusen nach der Bildgebung</td></tr></tbody></table>

optimierter intravitaler bildgebungsansatz für die langzeitüberwachung der dynamik des epithelgewebes auf einem inversen konfokalen mikroskop

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Das Verständnis des normalen und aberranten Verhaltens von In-vivo-Zellen ist notwendig, um klinische Interventionen zu entwickeln, die den Ausbruch und das Fortschreiten der Krankheit vereiteln. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, bildgebende Verfahren zu optimieren, die die Beobachtung der Zelldynamik in situ ermöglichen, wo die Gewebestruktur und -zusammensetzung ungestört bleiben. Die Epidermis ist die äußerste Barriere des Körpers und die Quelle der häufigsten Krebserkrankungen des Menschen, nämlich des Hautkarzinoms. Die Zugänglichkeit von Hautgewebe bietet eine einzigartige Möglichkeit, das Verhalten von Epithel- und Hautzellen bei intakten Tieren mit nicht-invasiver intravitaler Mikroskopie zu überwachen. Nichtsdestotrotz wurde dieser ausgeklügelte Bildgebungsansatz in erster Linie mit aufrechten Multiphotonenmikroskopen erreicht, die für die meisten Forscher eine erhebliche Eintrittsbarriere darstellen. In dieser Studie wird ein speziell entwickelter, 3D-gedruckter Mikroskoptischeinsatz vorgestellt, der für die Verwendung mit inversen konfokalen Mikroskopen geeignet ist und die intravitale Langzeitbildgebung der Ohrhaut in lebenden transgenen Mäusen optimiert. Wir glauben, dass diese vielseitige Erfindung, die an die Marke und das Modell des inversen Mikroskops angepasst und an die Abbildung zusätzlicher Organsysteme angepasst werden kann, sich als unschätzbar wertvoll für die größere wissenschaftliche Forschungsgemeinschaft erweisen wird, indem sie die Zugänglichkeit der intravitalen Mikroskopie erheblich verbessert. Dieser technologische Fortschritt ist entscheidend für unser Verständnis der Dynamik lebender Zellen in normalen und krankheitsbedingten Kontexten.

Die korrekte Montage des Live-Imaging-Einsatzes auf einem inversen konfokalen Mikroskop und die geeignete Ausrichtung einer transgenen Maus auf dem Einsatz wird durch die Erfassung von Z-Stapeln von fluoreszenzmarkiertem, lebendem Ohrgewebe über einen Zeitverlauf von ≥1 h mit minimalen Anzeichen einer Drift in der x-, y- und z-Achse validiert. Die Bilder sollten in gleichmäßigen Intervallen aufgenommen werden (die Intervallzeit hängt von der biologischen Fragestellung, der Stärke des Fluoreszenzsignals usw. ab), damit di...

Das Protokoll stellt ein neues Werkzeug zur Vereinfachung der intravitalen Bildgebung mittels invertierter konfokaler Mikroskopie dar.

Optimierter intravitaler Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Dynamik des Epithelgewebes auf einem inversen konfokalen Mikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Wir haben ein Werkzeug entwickelt, um intravitale Bildgebung an lebenden Mäusen mit einem inversen konfokalen Mikroskop durchzuführen. Dies ermöglicht es uns, die Dynamik der Hautzellen während der gesamten Homöostase zu verfolgen und das Zellverhalten während des Krankheitsbeginns und -fortschreitens zu vergleichen. Die Multiphotonenmikroskopie ist der primäre Ansatz, um eine intravitale Zellverfolgung zu erreichen.Zu den Nachteilen dieser Mikroskope gehören jedoch die begrenzte Vielseitigkeit der täglichen Bildgebung, die hohen Kosten und die technische Komplexität. Unser neues Tool ermöglicht den Einsatz vielseitiger inverser konfokaler Mikroskope für die In-vivo-Intravital-Bildgebung. Durch Modifikation der Designdatei können die Abmessungen des Tischeinsatzes an jedes inverse Mikroskop angepasst werden.Das Objektivloch kann in der Größe geändert und neu positioniert werden, um es an jedes Tiermodell und Gewebe Ihrer Wahl anzupassen.

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Biology

Biologie

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Dieses Video zeigt die Visualisierung von γδ intraepithelialen Lymphozyten (IELs) in transgenen Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie. Der chirurgische Eingriff besteht darin, eine Perforationslinie zu schaffen und einen Längsschnitt zu machen, um die Darmschleimhaut und die Zotten freizulegen. Die transgenen Mäuse exprimieren Reporterproteine ausschließlich in γδ IELs, was ihre Verfolgung ermöglicht. Die intravitale Bildgebung erfasst die dynamische Bewegung von grün fluoreszenzmarkierten γδ...

Intravitale Visualisierung von intraepithelialen Gamma-Delta-Lymphozyten

Ein neuer Ansatz, der intraokularen Transplantation und konfokale Mikroskopie ermöglicht Längs-, non-invasive Bildgebung in Echtzeit mit Single-Cell Auflösung innerhalb gepfropft...

Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit

Die extrazelluläre Matrix unterliegt erheblichen Umbau während der Wundheilung, Entzündung und Tumorgenese. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz Intravital-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die Dynamik der Fibrillen sowie netzartige Matrix-Komponenten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit Epi-Fluoreszenz-oder Zwei-Photonen-Mikroskopie visualisieren.

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Dieses Protokoll beschreibt die intravitalen Bildgebung von transgenen Mäusen zellspezifische fluoreszierenden Marker zum Ausdruck zu bringen. Intravitalen Bildgebung stellt eine nicht-invasive Methode für hochauflösende Beobachtungen an lebenden Tieren mit implantierbaren Windows durch die mikroskopische Visualisierung von Prozessen möglich ist. Diese Methode ist besonders nützlich, um längs Prozesse zu studieren.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Die Rekrutierung von Leukozyten und Blutplättchen stellt eine wesentliche Komponente dar, die für das effektive Wachstum von Kollateralarterien während der Arteriogenese notwendig ist. Die Multiphotonenmikroskopie ist ein effizientes Werkzeug zur Verfolgung der Zelldynamik mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo und geringerer Phototoxizität, um die Rekrutierung und Extravasation von Leukozyten während der Arteriogenese zu untersuchen.

Multiphotonen-Intravital-Bildgebung zur Überwachung der Leukozytenrekrutierung während der Arteriogenese in einem murinen Hintergliedmaßenmodell

Erfahren Sie einen optimierten intravitalen Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Epitheldynamik bei lebenden Mäusen mit inverser konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht stabile Z-Stack-Aufnahmen über mehrere Stunden.

Optimierter intravitaler Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Dynamik des Epithelgewebes auf einem inversen konfokalen Mikroskop (Video) | JoVE Journal

Optimierter intravitaler Bildgebungsansatz für die Langzeitüberwachung der Dynamik des Epithelgewebes auf einem inversen konfokalen Mikroskop

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