Name: Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Hühnerhautexplantaten zur Analyse molekularer und zellulärer Prozesse bei der Gewebeentwicklung. Diese Methode ermöglicht 4D-Bildgebung und Untersuchungen zur Organogenese für die regenerative Medizin.

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Diese Arbeit wird durch die NIH-NIAMS-Zuschüsse R37 AR 060306, R01 AR 047364 und RO1 AR078050 unterstützt. Die Arbeit wird auch durch einen gemeinsamen Forschungsvertrag zwischen der USC und der China Medical University in Taiwan unterstützt. Wir danken der Klasse USC BISC 480 Developmental Biology 2023 für die erfolgreiche Erprobung dieses Vogelhautkulturprotokolls in mehreren Labormodulen.

1. Explantatkultur aus Hühnerhaut (Abbildung 1)
<ol><li>Befruchtete Hühnereier in einem befeuchteten Brutkasten bei 38 °C inkubieren und nach Hamburger und Hamilton14 inszenieren.<ol><li>Im Stadium 28 (~E5.5) sind der zweite Zeh und die dritte Zehe der Gliedmaße länger als die anderen; Drei Zehen und vier Zehen sind unterschiedlich.</li>
		<li>Bei Stufe 29 (~E6) ist der Flügel am Ellbogen gebeugt; Die zweite Ziffer ist deutlich länger als die anderen.</li>
		<li>Im Stadium 30 (~E6.5) sind zwei Reihen der dorsalen Federknospen zu beiden Seiten des Rückenmarks auf der Höhe des Armes und drei Reihen auf Höhe der Beine sichtbar.</li>
		<li>Auf Stufe 31 (~E7) gibt es ~7 Reihen von Federn auf der Jumbo-Sakral-Ebene.</li>
		<li>Im Stadium 32 sind elf oder mehr Reihen von Federknospen auf Höhe der Beine vorhanden.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie einen Hühnerembryo im Stadium 28-32 in eine 60-mm-Petrischale, die Hanks-gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.<ol><li>Präparieren Sie die Rückenhaut des Embryos zwischen dem unteren Hals und der Schwanzregion. Verwenden Sie eine Schere, um den Kopf vom Hals zu entfernen. Ziehe vorsichtig an den Knospen der Gliedmaßen, um die Bauchseite des Körpers nach unten zu positionieren, wobei sich die Gliedmaßen nach außen spreizen.</li>
		<li>Machen Sie einen vorderen bis hinteren Schnitt in der Haut entlang der beiden flankierenden Seiten des Embryokörpers mit einer Uhrmacherzange oder einer scharfen Federschere. Achte darauf, den Körper mit einer Pinzette zu stabilisieren, indem du die Knospen der Gliedmaßen in Längsrichtung einklemmst. Schälen Sie die Haut vorsichtig vom Hals bis zum Schweif oder vom Schwanz bis zum Hals mit einer Uhrmacherzange.</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das Unterhautgewebe, das an der geschälten Haut haftet, und glätten Sie die Hautränder mit der scharfen Federschere.</li>
	<li>Geben Sie 2 ml/Vertiefung des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin-Lösung (verdünnt 1:100), in eine Vertiefung in einer 6-Well-Schale. Nachdem das Medium und die Antibiotika hinzugefügt wurden, legen Sie einen sterilen Gewebekultureinsatz so in die Vertiefung, dass sich das Medium an der Außenseite des Kultureinsatzes befindet.</li>
	<li>Übertragen Sie die Haut mit einem Spatel auf den Kultureinsatz, wobei die Epidermis nach oben und das Mesenchym nach unten auf die Einlegemembran zeigt. Um sicherzustellen, dass die Haut flach und ohne Falten aufliegt, ziehen Sie die Haut auf den Spatel in HBSS. Schieben Sie die Haut mit der Flüssigkeit vom Spatel ab, um die Übertragung der Haut ohne Falten zu erleichtern.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges HBSS mit einer 200-μl-Pipette aus dem Kultureinsatz. Lassen Sie eine dünne Schicht HBSS im Kultureinsatz, um das Explantat halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Hautexplantatkulturen bei 37 °C mit 5 % CO2 und 95 % Luft. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht4. Dieses Kultursystem kann auch mit der Haut anderer Vögel wie Explantatkulturen aus Wachtel- oder Finkenhaut verwendet werden.</li>
</ol>2. Epithel-mesenchymale Rekombination von Hühnerhaut (Abbildung 2)
<ol><li>Befruchtete Hühnereier werden in einem befeuchteten Inkubator bei 38 °C inkubiert und die Embryonen nach Hamburger und Hamilton14 (Abschnitt 1.1) in die Stadien gesetzt.</li>
	<li>Bereiten Sie 2x calcium-magnesiumfreie (CMF) Kochsalzlösung mit 0,25% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer vor.<ol><li>Stellen Sie 10x CMF-Puffer (NaCl (1,37 M) 80 g, KCl (0,04 M) 3 g, NaH2PO4 (0,004 M) 0,5 g, KH2PO4 (2 M) 0,25 g, NaHCO3 (0,12 M) 10 g, Glukose (0,1 M) 20 g in 1.000 mL destilliertem Wasser her. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein. Um 100 mL 2x CMF mit 0,25% EDTA-Puffer herzustellen, sollte das EDTA zuerst in 80 mL destilliertem Wasser aufgelöst werden, dann 20 mL 10x CMF-Puffer hinzufügen, um 2x CMF mit 0,25% EDTA-Arbeitslösung herzustellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Rückenhaut von Hühnerembryonen im Stadium 30-32 wird wie oben beschrieben (Abschnitt 1.2) in HBSS präpariert und in 2x CMF-Kochsalzlösung mit 0,25% EDTA auf Eis für 15-20 min inkubiert.</li>
	<li>Trennen Sie Epithel und Mesenchym vorsichtig mit einer Uhrmacherzange. Übertragen Sie das getrennte Epithel und Mesenchym in eine saubere Schüssel, die HBSS enthält.</li>
	<li>Kombinieren Sie das Epithel mit dem Mesenchym, indem Sie zuerst das Mesenchym auf eine Petrischale mit HBSS legen und dann das Epithel auf das Mesenchym legen. Platzieren Sie das Epithel entlang der gleichen anterior-posterioren Achse wie das Mesenchym oder drehen Sie das Epithel um 90° von der anterior-posterioren Achse des Mesenchyms, um zu bestimmen, welche Komponente verschiedene Aspekte der Hautmorphogenese reguliert.</li>
	<li>Übertragen Sie die rekombinierten Häute zum Wachstum in Kultureinsätze in 6-Well-Kulturschalen und entfernen Sie überschüssiges HBSS um die rekombinierte Haut.</li>
	<li>Geben Sie 2 ml DMEM-Kulturmedium mit 10 % FBS in die Vertiefung außerhalb des Einsatzes. Platzieren Sie eine dünne Schicht DMEM in der Einsatzkammer, um das Explantat halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen.</li>
	<li>Die Hautrekombinanten werden bei 37 °C in einem Gemisch aus 5 % CO2 und 95 % Luft inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. Dokumentieren Sie phänotypische Veränderungen in den ersten Hautphasen der Hautentwicklung mittels Zeitrafferfotografie mit einer Kamera, die an einem Präpariermikroskop montiert ist. HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht11.</li>
</ol>3. Rekonstitution der Hühnerhaut (Abbildung 3)
<ol><li>Befruchtete Hühnereier werden in einem befeuchteten Inkubator bei 38 °C inkubiert und die Embryonen nach Hamburger und Hamilton14 (Abschnitt 1.1) in die Stadien gesetzt.</li>
	<li>Präparieren Sie die Rückenhaut von Hühnerembryonen im Stadium 30-33 bei HBSS. Inkubieren Sie die Häute in 2x CMF-Kochsalzlösung mit 0,25% EDTA auf Eis für 15-20 min wie oben beschrieben (Abschnitt 2.3).</li>
	<li>Trennen Sie Epithel und Mesenchym vorsichtig mit einer Uhrmacherzange. Übertragen Sie das getrennte Epithel und Mesenchym auf Eis auf HBSS. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Basalschicht des Epithels nicht zu beschädigen, wenn Sie das Epithel vom Mesenchym trennen.</li>
	<li>Das abgetrennte Mesenchym in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen auffangen und mit 0,1%iger Kollagenase/Trypsin-Lösung aus PBS in einem 37 °C warmen Wasserbad für 10-15 min inkubieren.</li>
	<li>Dissoziieren Sie das Hautmesenchym mit einer Pasteurpipette, um eine einzellige Suspension herzustellen. Fügen Sie DMEM mit 10% FBS hinzu, um die Verdauung zu stoppen.</li>
	<li>Pelletieren und zentrifugieren Sie die Zellen bei 233 × g für 5 min. Die Zellen wurden mit Kulturmedium in einer Konzentration von 2 × 107 Zellen/ml resuspendiert. HINWEIS: In diesem Schritt können die mesenchymalen Zellen auch in virushaltigem Medium für 2-3 h auf Eis zur Gentransduktion resuspendiert werden.</li>
	<li>Legen Sie einen Zellkultureinsatz in eine Vertiefung einer 6-Well-Schale. 10 μl von 2 × 107 Zellen/ml mesenchymale Zellen auf den Gewebekultureinsatz geben. Geben Sie 2 ml DMEM-Kulturmedium mit 10 % FBS in die Vertiefung außerhalb des Einsatzes. Inkubieren Sie die plattierten mesenchymalen Zellen bei 37 °C mit einem Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Luft für 1 h, damit sich die Zellen auf der Einlegemembran absetzen können.</li>
	<li>Übertragen Sie das intakte Epithel mit einer 1-ml-Pipette auf das plattierte mesenchymale Tröpfchen, wobei die Epithel-Basalzellschicht den mesenchymalen Zellen zugewandt ist. HINWEIS: Bei der Übertragung von Epithel auf das mesenchymale Tröpfchen sollten die mesenchymalen Zellen nicht gestört werden.</li>
	<li>Glätten Sie das intakte Epithel über dem Mesenchym, um die rekonstituierte Haut explantieren zu lassen. Lassen Sie eine dünne Schicht des Mediums auf dem Einsatz, um die rekonstituierte Haut halbnass zu halten und eine Luft-Flüssig-Grenzfläche zu schaffen. Das rekonstituierte Hautexplantat wird bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Luft inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. HINWEIS: Dieses Verfahren wurde veröffentlicht13.</li>
</ol>

Ein umfassender Überblick über die Protokolle für embryonale Hautexplantatkulturen von Vögeln

<ol><li>Lucas, A. M., Stettenheim, P. R. Avian anatomy: Integument part I and part II. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLucas%2C+AM+%22Agriculture+Handbook%22">Agriculture Handbook</a>. 362, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C.. (1972).</li>
<li>Sengel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSengel%2C+P+%22In+Morphogenesis+of+Skin%2C+l-277%22">In Morphogenesis of Skin, l-277</a>. , Cambridge Univ. Press. New York. (1976).</li>
<li>Dhouailly, D., Wilehm Roux, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+cutaneous+appendages+in+dermo-epidermal+recombinations+between+reptiles%2C+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of cutaneous appendages in dermo-epidermal recombinations between reptiles, birds and mammals.</a> Archives of Developmental Biology. 177 (4), 323-340 (1975).</li>
<li>Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+feather+morphogenesis%3A+I.+Analyses+with+antibodies+to+Adhesion+Molecules+Tenascin%2C+N-CAM+and+Integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of feather morphogenesis: I. Analyses with antibodies to Adhesion Molecules Tenascin, N-CAM and Integrin.</a> Developmental Biology. 150 (1), 82-98 (1992).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+organs+by+a+Wnt+%2F+Notch+%2F+non-muscle+myosin+module+which+orients+feather+bud+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Shaping organs by a Wnt / Notch / non-muscle myosin module which orients feather bud elongation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110 (16), E1452-E1461 (2013).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+coordinate+feather+mesenchymal+cell+movement+by+SHH+dependent+modulation+of+gap+junction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations coordinate feather mesenchymal cell movement by SHH dependent modulation of gap junction networks.</a> Nature Communications. 9 (1), 5377(2018).</li>
<li>Ting-Berreth, S. A., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+delivery+of+TGF+beta2+can+restore+epithelium+dependent+organization+of+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Local delivery of TGF beta2 can restore epithelium dependent organization of mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 179 (2), 347-359 (1996).</li>
<li>Widelitz, R. B., Jiang, T. -X., Noveen, A., Chen, C. -W. J., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+induces+new+feather+buds+from+developing+avian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigation+Dermatology%22%5BJournal%5D)">FGF induces new feather buds from developing avian skin.</a> Journal of Investigation Dermatology. 107 (6), 797-803 (1996).</li>
<li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+interactions+in+scale+and+feather+development+as+studies+in+dermal-epidermal+recombinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Tissue interactions in scale and feather development as studies in dermal-epidermal recombinations.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 11, 765-789 (1963).</li>
<li>McAleese, S. R., Sawyer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+the+phenotype+of+the+epidermis+from+chick+embryos+homozygous+for+the+gene+scaleless+%28sc%2Fsc%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correcting the phenotype of the epidermis from chick embryos homozygous for the gene scaleless (sc/sc).</a> Science. 214 (4524), 1033-1034 (1981).</li>
<li>Chuong, C. M., Widelitz, R. B., Ting-Berreth, S., Jiang, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+during+avian+skin+appendage+regeneration%3A+dependence+on+epithelial-mesenchymal+interaction+and+order+of+molecular+reappearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Early events during avian skin appendage regeneration: dependence on epithelial-mesenchymal interaction and order of molecular reappearance.</a> J Invest Dermatol. 107 (4), 639-646 (1996).</li>
<li>Jiang, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+feather+orientations+changed+by+electric+current%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Global feather orientations changed by electric current.</a> iScience. 24 (6), 102671(2021).</li>
<li>Jiang, T. X., Jung, H. S., Widelitz, R. B., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+periodic+patterns+by+dissociated+feather+mesenchymal+cells+and+the+regulation+of+size%2C+number+and+spacing+of+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Self-organization of periodic patterns by dissociated feather mesenchymal cells and the regulation of size, number and spacing of primordia.</a> Development. 126 (22), 4997-5009 (1999).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 188, 49-92 (1951).</li>
<li>Chen, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+early+odontogenic+signaling+pathway+in+Aves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Conservation of early odontogenic signaling pathway in Aves.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 97 (18), 10044-10049 (2000).</li>
<li>Chuong, C. -M., Ting, S. A., Widelitz, R. B., Lee, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Skin+Morphogenesis%3A+II.+Retinoic+acid+gradient+modulates+axis+orientation+and+phenotypes+of+skin+appendages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Skin Morphogenesis: II. Retinoic acid gradient modulates axis orientation and phenotypes of skin appendages.</a> Development. 115 (3), 839-852 (1992).</li>
<li>Noveen, A., Jiang, T. -X., Chuong, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+A+and+protein+kinase+C+modulators+have+reciprocal+effects+on+mesenchymal+condensation+during+skin+appendage+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase A and protein kinase C modulators have reciprocal effects on mesenchymal condensation during skin appendage morphogenesis.</a> Developmental Biology. 171 (2), 677-693 (1995).</li>
<li>Wu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+biological+networks+via+adaptive+patterning+revealed+by+avian+intradermal+muscle+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of biological networks via adaptive patterning revealed by avian intradermal muscle network formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 116 (22), 10858-10867 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Die Geweberekombination bietet einen Assay, um die einzigartigen Beiträge des Epithels und des Mesenchyms zu untersuchen. Bei Hühnern beginnen sich die Federn am Embryonaltag 7 (E7) zu entwickeln, während die Schuppen am E9 beginnen. Wenn das Mesenchym der E9-Schuppe mit dem Federepithel E7 rekombiniert wird, bildet das rekombinierte Gewebe Schuppen, und wenn das Mesenchym der E7-Feder mit dem Epithelfeder der E9-Schuppen rekombiniert wird, werden Federn gebildet11. Diese Studien haben gezeigt, da...

Die Entwicklung der Haut von Vogelembryonen ist aufgrund der unterschiedlichen Muster und des Zugangs zu Mikrochirurgie und -manipulation ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Morphogenese 1,2. Die Bewertung zellulärer und molekularer Ereignisse in intaktem Gewebe kann jedoch schwierig sein, da das Vorhandensein von Fremdgewebe mikroskopische Beobachtungen erschweren kann. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren, um ihre Rolle bei der Morphogenese der Haut zu testen, nicht immer eine einfache Aufgabe. Wir stellen fest, dass wir Genfunktionen mittels retroviraler Transduktion mit einer höheren Erfolgsrate unter Verwendung von Hautexplantatmodellen testen können. Hier gehen wir auf die Vorteile von drei Hautexplantatmodellen ein, die entwickelt wurden.
Die embryonale Hautkultur von Vögeln ist ein leistungsfähiges System zur Beurteilung des Zellverhaltens, der Genregulation und der Funktion während der Entwicklung von Hautfederknospen 3,4,5,6. Es ermöglicht die Bewertung der molekularen Mechanismen der Entwicklung von Federknospen durch die globale Zugabe von Wachstumsfaktoren, die in das Kulturmedium eingebracht werden, oder deren lokale Freisetzung aus Wachstumsfaktor-beschichteten Kügelchen. Entwicklungsregulatorische Gene können auch durch virale Gentransduktion intakter oder dominanter negativer Formen für funktionelle Studien manipuliert werden, um ihre Rolle bei spezifischen morphogenetischen Ereignissen zu bewerten 7,8.
Die epithelial-mesenchymale Rekombinationskultur von Vögeln ermöglicht es den Forschern, die Beiträge der einzelnen Hautkomponenten in den frühen Stadien der Hautmorphogenese zu bestimmen. Rawles' Anwendung dieses Ansatzes zeigte, dass Wechselwirkungen zwischen dem Mesenchym und dem Epithel für die Bildung von Hautanhängen unerlässlich sind9. Das Mesenchym kann Kondensationen bilden, und das Epithel wird benötigt, um mesenchymale Kondensationsbildungen zu induzieren und aufrechtzuerhalten2. Später wurde dieser Ansatz verwendet, um zu beurteilen, warum schuppenlose Hühner keine Federn bilden. Es wurde festgestellt, dass der Defekt im Mesenchym10 liegt. Dhouailly führte Studien zur epithelial-mesenchymalen Rekombination von Gewebe an Embryonen verschiedener Spezies durch. Diese Studien lieferten entwicklungs- und evolutionäre Einblicke in die epithelial-mesenchymale Kommunikation, die die Morphogenese der Haut fördert3.
Diese Studie wurde verwendet, um Faktoren, die das Federwachstum steuern, besser zu verstehen. Die Methode verbessert auch die Visualisierung zellulärer und molekularer Ereignisse, die an der Hautmusterung beteiligt sind und während der Initiierung, Entwicklung und Verlängerung der Federn entlang der anterior-posterioren Achse stattfinden. Wenn das Epithel vom Mesenchym getrennt wird und die beiden Komponenten dann wieder kombiniert werden, stellen neue Wechselwirkungen die Hautmusterung wieder her. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, mesenchymale induzierende Signale und epitheliale Kompetenzmoleküle zu bewerten, die es der Epidermis ermöglichen, auf die mesenchymalen Signale zu reagieren11. Die anschließende nachgeschaltete molekulare Expression, die für die Entwicklung der Federknospen und die Musterbildung erforderlich ist, kann ebenfalls untersucht werden. Diese Studien haben gezeigt, dass die Position der Knospen durch das Mesenchym gesteuert wird. Die Rotation des Epithels um 90o vor der Rekombination mit dem Mesenchym zeigt, dass die Richtung der Federknospenverlängerung durch das Epithel gesteuert wird. Diese Methode war für uns unerlässlich, um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der die Ausrichtung der Federknospen reguliert12.
Die Rekonstitutionskultur der Vogelhaut, in der das Hautmesenchym in einzelne Zellen dissoziiert wird, bevor es mit hoher Zelldichte plattiert und mit intaktem Epithel überlagert wird, versetzt die Hautzellen in einen primordialen Zustand. Das Explantat organisiert sich dann selbst, um ein neues periodisches Muster zu bilden, das unabhängig von den vorherigen Hinweisen13 ist. Dieses Hautrekonstitutionsmodell kann verwendet werden, um die ersten Prozesse der periodischen Musterbildung von Federn zu untersuchen. Wir haben diesen Ansatz verwendet, um zu untersuchen, wie die Modulation des Verhältnisses von mesenchymalen Zellen zu einem einzelnen Stück Epithel die Größe oder Anzahl der Federknospen beeinflussen kann. Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der Knospen zunahm, aber nicht die Größe der Knospen, da das Verhältnis der mesenchymalen Zellen zunahm. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die mesenchymale zelluläre Virustransduktion eine höhere Effizienz aufweist als unter den beiden anderen Kulturbedingungen und offensichtlichere Phänotypen hervorbringen kann.

<table><tbody><tr><td>6-Well-Kulturschale&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>REF 353502</td><td>Kulturen mit Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) &nbsp;</td></tr><tr><td>Einsatz von Zellkulturen</td><td>Falke</td><td>REF 353090.</td><td>0,4 &Mikro; m Transparente PET-Membran-Kollagenase</td></tr><tr><td>Typ 1</td><td>Worthington Biochemisches</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>4,5 g/l Glukose</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Stränge s gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>Kein Calcium, kein Magnesium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Pogassiumphosphat (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (Nacl)</td><td>EMD&nbsp;</td><td>CAS 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>27250-042</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von vogelhautexplantaten zur untersuchung der gewebemusterung und organogenese

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

Die sich entwickelnde Vogelhaut während der Embryogenese ist ein einzigartiges Modell, das wertvolle Einblicke in die Gewebemusterung liefern kann. Im Folgenden werden drei Varianten von Hautexplantatkulturen beschrieben, um verschiedene Aspekte der Hautentwicklung zu untersuchen. Erstens bieten Ex-vivo-Organkulturen und -Manipulationen den Forschern die Möglichkeit, die Entwicklung von Federknospen direkt zu beobachten und zu untersuchen. Die Explantatkultur der Haut kann 7 Tage lang wachsen, was eine direkte Analyse des zellulären Verhaltens und 4D-Bildgebung in Intervallen während dieser Wachstumsperiode ermöglicht. Dies ermöglicht auch physikalische und molekulare Manipulationen der Kulturbedingungen, um die Gewebereaktion sichtbar zu machen. Zum Beispiel können mit Wachstumsfaktoren beschichtete Kügelchen lokal aufgetragen werden, um Veränderungen in der Federmusterung in einem begrenzten Bereich zu induzieren. Alternativ kann die virale Transduktion global in den Nährmedien verabreicht werden, um die Genexpression zu erhöhen oder herunterzuregulieren. Zweitens ermöglicht das Hautrekombinationsprotokoll den Forschern, Gewebeinteraktionen zwischen Epidermis und Mesenchym zu untersuchen, die aus verschiedenen Hautregionen, verschiedenen Lebensstadien oder verschiedenen Arten stammen. Dies bietet die Möglichkeit, das Zeitfenster zu testen, in dem das Epithel in der Lage ist, auf Signale zu reagieren, und seine Fähigkeit, verschiedene Hautanhänge als Reaktion auf Signale aus verschiedenen mesenchymalen Quellen zu bilden. Drittens setzt die Hautrekonstitution mit dissoziierten Hautzellen, die mit intaktem Epithel überlagert sind, die Hautentwicklung zurück und ermöglicht die Untersuchung der anfänglichen Prozesse der periodischen Musterbildung. Dieser Ansatz verbessert auch unsere Fähigkeit, die Genexpression zwischen den dissoziierten Zellen zu manipulieren, bevor das rekonstituierte Hautexplantat erstellt wird. In diesem Artikel werden die drei Kulturprotokolle und beispielhafte Experimente vorgestellt, um ihren Nutzen zu demonstrieren.

Explantationskulturen der Haut Die Entwicklung von Federknospen aus ex vivo Hautorgankulturen kann direkt unter dem Mikroskop beobachtet werden. Unter Verwendung des Hautexplantationskulturmodells der Rückenhaut von Hühnern im Stadium 30 sind die Plakoden entlang der Mittellinie sichtbar. Die morphogenetische Front vermehrt sich dann allmählich lateral in Richtung Hautperipherie mit der Bildung neuer Federprimordien. Diese Federprimordien entwickeln sich nach 2 Tagen Kultur zu kurzen Federkno...

Hier beschreiben wir Protokolle für drei Arten von embryonalen Hautexplantatkulturen von Vögeln, die zur Untersuchung von Gewebeinteraktionen, 4D-Bildgebungs-Zeitrafferfilmen (3D plus Zeit), globalen oder lokalen Störungen der molekularen Funktion und systembiologischer Charakterisierung verwendet werden können.

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Das Forschungsziel meines Forschungsteams ist es, die Gewebeentwicklung und die Regeneration zu verstehen. Dieses Ziel ist in der heutigen Stammzellforschung besonders wichtig. Wir hoffen, die Prinzipien der Organbildung zu verstehen.Und dieses Wissen hilft uns nicht nur, die Natur zu verstehen, sondern kann auch in der regenerativen Medizin eingesetzt werden. Die Herausforderung, vor der wir stehen, besteht darin, den molekularen und zellulären Prozess zu verstehen, der an diesen morphogenetischen Prozessen beteiligt ist. Daher brauchen wir ein Explantatkultursystem, um molekulare und zelluläre Prozesse sorgfältig zu analysieren, da dies in vivo nicht möglich ist.Um diese Wissenslücke zu schließen, haben Wissenschaftler verschiedene Methoden der Organoidkulturen entwickelt. In der Organoidkultur werden wir in der Lage sein, kollektive Zellbewegungen durchzuführen, um zu sehen, wie Zellen miteinander interagieren. Wir sind auch in der Lage, die Zellen so zu manipulieren, dass sie verschiedene Moleküle exprimieren, um die Funktion der Moleküle zu testen.Der einzigartige Ansatz, den wir verwenden, ist die Explantatkultur mit Hühnerhaut. Hühnerhaut wird verwendet, weil sie vom Ei aus leicht zugänglich ist und ausgeprägte Federknospen bildet, die in einem sechseckigen Muster angeordnet sind, um Gewebemuster anzuzeigen. Es gibt drei Arten, wie wir die Kultur gestalten, wie Sie sehen werden.Die eine besteht darin, die Explantatkultur zu halten, uns zu erlauben, Filme zu drehen oder Moleküle zu liefern, um das System zu stören. Zweitens, um den Beitrag der Epizilien oder des Mesenzyms zu untersuchen, können wir sie auseinandernehmen und wieder einsetzen. Drittens, um die Fähigkeit jeder Zelle weiter herauszufordern, dissoziieren wir sie in einzelne Zellen und testen, wie sie zurückkommen, um sich in den Gewebemustern zu reorganisieren.Durch diese Ansätze konnten wir neue Erkenntnisse über die Gewebemuster gewinnen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Erstellung von Vogel-Vorderhirn-Chimären zur Beurteilung der Gesichtsentwicklung

Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.

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Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Zebrabärbling Keratozyten migrieren in Zellschichten aus Explantaten und stellen eine in vitro-Modell für die Untersuchung der Mechanismen der kollektiven Zellmigration im Rahmen der epithelialen Wundheilung. Diese Protokolle Detail ein effektiver Weg zur primären Explantatkulturen für den Einsatz in kollektive Zellmigrationsassays herzustellen.

Zebrafisch Keratozyten Explantate auf Collective Zellmigration und Reepithelialisierung in kutane Wundheilung Studieren

Die ex vivo aufrechte Tröpfchenkultur ist eine Alternative zu den derzeitigen in vitro und in vivo experimentellen Techniken. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert kleinere Mengen an Reagenzien, ermöglicht aber die Manipulation und Untersuchung der fetalen Vaskularisation, Morphogenese und Organogenese.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Erfahren Sie die Kultivierung von Hühnerhautexplantaten zur Analyse molekularer und zellulärer Prozesse bei der Gewebeentwicklung. Diese Methode ermöglicht 4D-Bildgebung und Untersuchungen zur Organogenese für die regenerative Medizin.

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

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