Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung
28. Juli 2023
Die Studie beschreibt ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe für die nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung.
Diese Forschung konzentriert sich auf die Unterstützung von Arzneimittelforschungsstudien mit Einzelkern-RNA-Sequenzierung, um die Wirksamkeit und Sicherheit potenzieller Behandlungen zu untersuchen. Daher entwickeln wir standardisierte Kernextraktionsprotokolle für frisch gefrorene Gewebeproben aus verschiedenen Organen. Unser Ziel war es, die Kernextraktion zu automatisieren und zu standardisieren, um konsistente und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, indem wir die nicht-biologische Variabilität reduzieren.
Der Vorteil liegt in der Teilautomatisierung durch den Einsatz eines Roboterdissoziators und dem einfachen und kurzen Arbeitsablauf, der auf verschiedene Gewebeproben unterschiedlicher Spezies angewendet werden kann. Standardisierte Protokolle können uns helfen, Fragen zur Bioverteilung von Medikamenten zu beantworten und die Mechanismen zu erforschen, die den von uns beobachteten Sicherheitssignalen zugrunde liegen. In Zukunft werden wir die Anwendbarkeit unseres Protokolls für weitere nachgelagerte Anwendungen, wie z.B. ATAC-seq oder Multiomics, testen.
Wir werden auch versuchen, Protokolle zu etablieren, um viral exprimierte Transgene in einzelnen Zellkernen nachzuweisen.
Übersicht
Diese Studie stellt einen standardisierten und teilweise automatisierten Protokollablauf für die Isolierung von hochwertigen Zellkernen aus gefrorenen Säugetiergeweben vor, mit dem Ziel, die Effizienz und Zuverlässigkeit nachgeschalteter Einzelzellkern-RNA-Sequenzierungen zu verbessern. Das Protokoll dient dazu, Studien zur Wirkstoffentdeckung zu optimieren, indem nichtbiologische Variabilität verringert wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Einzelzellkern-RNA-Sequenzierung
- Studien zur Wirkstoffforschung
- Isolierung von hochwertigen Zellkernen
Hintergrund
- Entwicklung standardisierter Protokolle zur Extraktion von Zellkernen
- Schwerpunkt auf frisch gefrorenen Gewebeproben aus verschiedenen Organen
- Ziel: Klärung von Fragen zur Biodistribution von Arzneimitteln und Sicherheitssignalen
Verwendete Methoden
- Teilautomatisierte Gewinnung von Zellkernen mithilfe eines robotischen Dissoziators
- Säuger-Gewebe aus verschiedenen Arten
- Durchführung einer Reinigung über eine Saccharose-Gradienten-Zentrifugation
Hauptergebnisse
- Hochwertige Kerne ohne Anzeichen von Trümmern oder Agglomerationen
- Konsistente Ergebnisse über verschiedene Gewebetypen hinweg
- Geringe technische Variabilität und ähnliche Zellanteile über die Proben hinweg
Schlussfolgerungen
- Die Studie automatisiert und standardisiert die Extraktion von Kernen erfolgreich.
- Dieses Protokoll kann wesentlich zur Beantwortung biologischer Fragestellungen in der Arzneimittelforschung und Sicherheitsbewertung beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die standardisierte Isolierung einzelner Zellkerne aus gefrorenem Gewebe ermöglicht eine robuste transkriptomische Profilierung in der Wirkstoffforschung und unterstützt sowohl Wirksamkeits- als auch Sicherheitsuntersuchungen. Durch die Minimierung nicht-biologischer Variabilität mittels teilweiser Automatisierung erhöht dieses Protokoll das Vorhersagevertrauen in nachgeschaltete Einzelzellkern-RNA-Sequenzierungen. Die Anpassungsfähigkeit über verschiedene Gewebetypen hinweg macht es zu einer wiederverwendbaren Methode für mechanistische Entwicklungsrisikominderung und Zielstrukturnachweise im gesamten Portfolio.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung des Wirkmechanismus von Arzneimitteln und der gewebespezifischen Genexpression in schwer zu dissoziierenden oder archivierten Proben.
- Verringert die technische Variabilität und unterstützt die funktionelle Zielvalidierung sowie die Absicherung von Wirkmechanismen.
- Erleichtert die Erzeugung reproduzierbarer Daten für die hypothesengetriebene Portfolio-Priorisierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erstellt Suspensionen von hochwertigen Kernen, die für standardisierte Einzelkern-RNA-Sequenzierungs-Workflows geeignet sind.
- Unterstützt die Reproduzierbarkeit des Assays und die konsistente quantitative Ausgabe über verschiedene Gewebetypen und Arten hinweg.
- Ermöglicht skalierbare, teilautomatisierte Probenvorbereitung zur zuverlässigen Wirkstoffbewertung.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht bei Verwendung von gefrorenen oder archivierten Proben die Übereinstimmung mit der analyse krankheitsrelevanter Gewebe für die translationale Biomarker-Entdeckung.
- Gewährleistet Kontinuität von der frühen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem multigewebliche und multispezifische Studien unterstützt werden.
- Bietet eine Grundlage für zukünftige Multiomik- und ATAC-seq-Anwendungen, wie im Ausblick des Protokolls beschrieben.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll verbindet den Bereich der frühen Entdeckung mit der präklinischen Forschung und ermöglicht eine hochpräzise transkriptomische Analyse aus gefrorenen Geweben zur Identifizierung von Leitstrukturen und mechanistischen Studien.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Einzelkern-Transkriptomik aus verschiedenen Geweben.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, quantitative Präparationen von Kernen für nachgeschaltete Sequenzierungsanalysen.
- Analytik: Liefert standardisierte Ausgabedaten wie Genanzahlen, UMI-Anzahlen und mitochondriale Anteile für den Vergleich zwischen Proben.
- Translationale Forschung: Erleichtert die Analyse der Biodistribution von Wirkstoffen und von Sicherheitssignalen in krankheitsrelevanten Geweben.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet ein breit anwendbares Protokoll für verschiedene Gewebetypen und Spezies, das Studien über das gesamte Portfolio hinweg unterstützt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in transkriptomischen Studien.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und teilweise Automatisierung von Protokollen zur Isolierung von Zellkernen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz, indem technische Variabilität reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Wirkstoffkandidaten basierend auf robusten molekularen Daten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Geweben, der Isolierung von Zellkernen und nachgeschalteten Sequenzierungsabläufen.
- Benötigt Zugang zu einem robotergestützten Gewebezerkleinerer, einem automatisierten fluoreszenzbasierten Zellzähler sowie einer Standardinfrastruktur der Molekularbiologie.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um die Reproduzierbarkeit zwischen Studien und Standorten sicherzustellen.
- Kann mit geringer Optimierung auf verschiedene Säugetiergewebe angewendet werden, wie bereits an mehreren Arten gezeigt wurde.
- Mögliche Einschränkungen bestehen in der Notwendigkeit, das Protokoll für nicht standardmäßige Gewebe oder zukünftige Multiomik-Anwendungen anzupassen.
