Hochwertige Präparation von Hirn- und Knochenmarkkernen für Einzelkern-Multiom-Assays
22. Dezember 2023
Der Erfolg von Einzelzell-/Einzelkern-Transkriptomik und Multi-Omics hängt weitgehend von der Qualität der Zellen/Zellkerne ab. Daher muss die Isolierung von Zellen/Zellkernen aus Gewebe und deren Aufreinigung hochgradig standardisiert sein. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Zellkernen aus Gehirn und Knochenmark für den nachgeschalteten Einzelkern-Multiom-Assay.
Die Technologieeinheit Zytometrie und Biomarker unterstützt biomedizinische Projekte durch modernste Technologien und Pipelines zur Zellphänotypisierung und molekularen Profilierung mit Einzelzellauflösung. In diesem Zusammenhang verwenden wir verschiedene Werkzeuge für die Einzelzell-Multiom-Analyse, um Einblicke in die Genexpression und Genregulation in Gesundheit und Krankheit zu erhalten. Die Durchflusszytometrie identifiziert und entnimmt einzelne Zellen auf der Grundlage einzigartiger Eigenschaften.
Zu den jüngsten Fortschritten gehören bildbasierte Spektralsortierer mit hohem Durchsatz, die Flexibilität beim Panel-Design bieten, die gleichzeitige Verwendung ähnlicher Farbstoffe und die Verwaltung der Autofluoreszenz ermöglichen. Eine große experimentelle Herausforderung beim Einsatz modernster Einzelzelltechnologien ist die Arbeit mit besonders fragilen oder seltenen Zellpopulationen. Jeder Gewebe- oder Zelltyp muss einer fein abgestimmten Protokolloptimierung unterzogen werden, um genügend hochlebensfähige Zellen zu erhalten, die sich in qualitativ hochwertige Sequenzierungsdaten übersetzen lassen.
Unser modifiziertes Einzelkernpräparationsprotokoll verbessert die Zellkernregeneration und minimiert die Belastung der Kerne. Es ist speziell für Gehirn- und Knochenmarkgewebe optimiert und deckt alle Schritte von der Probendissoziation bis zur Zellkernreinigung ab.
Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Optimierung der Isolierung von Zellkernen aus Gehirn- und Knochenmarkgewebe für nachgeschaltete Single-Nuclei-Multiom-Analysen. Die Bedeutung einer hochwertigen Zellkernextraktion wird hervorgehoben, da sie einen entscheidenden Einfluss auf Einzelzell-Transkriptomik- und Multi-Omik-Analysen hat.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Einzelzell-Transkriptomik
- Multi-Omics
- Techniken zur Isolierung von Zellkernen
Hintergrund
- Der Erfolg der Transkriptomik hängt von der Reinheit und Qualität der isolierten Zellen/Kerne ab.
- Neuere Fortschritte in der Durchflusszytometrie und bildbasierten Technologien verbessern die Fähigkeiten zur Zellsortierung.
- Für empfindliche oder seltene Zellpopulationen sind besondere Überlegungen erforderlich, die optimierte Protokolle notwendig machen.
Verwendete Methoden
- Modifiziertes Protokoll zur Herstellung von Zellkernen aus Gehirn- und Knochenmarkgewebe
- Maus-Modellsystem
- Zu den Techniken gehören Durchflusszytometrie und automatisierte Zellzählung
Hauptergebnisse
- Verbesserte Gewinnungsraten von Kernen bei minimalem Stress während der Probenvorbereitung.
- Die Reinheit der Gehirnkerne stieg nach der Sortierung von 36 % auf nahezu 100 %.
- Ein zuverlässiger Workflow zur Vorbereitung von Kernen für Sequenzierungsdaten hoher Qualität wurde etabliert.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert ein wirksames Protokoll zur Isolierung hochreiner Zellkerne aus spezifischen Geweben.
- Die Ergebnisse haben bedeutende Implikationen für die Verbesserung von Einzelzell-Multiom-Analysen in der Gesundheits- und Krankheitsforschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Aufbereitung hochwertiger Zellkerne aus Gehirn und Knochenmark ist die Grundlage für robuste single-nuclei-Multiome-Assays und beeinflusst direkt die Zuverlässigkeit der transkriptomischen und epigenetischen Profilierung in der frühen Forschung. Standardisierte Protokolle zur Isolierung von Zellkernen ermöglichen eine konsistente Datenerzeugung und stützen die Vorhersagegenauigkeit sowie die mechanistische Entschärfung von Risiken bei Studien komplexer Gewebe. Diese Fähigkeit ist entscheidend, um krankheitsrelevante Modelle voranzutreiben und Portfolioentscheidungen in der Neurowissenschaft und Hämatologie zu beschleunigen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung zelltypspezifischer transkriptioneller und epigenetischer Zustände in komplexen Geweben.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem Kerne mit hoher Integrität für multimodale Analysen bereitgestellt werden.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung durch reproduzierbare Probenvorbereitung und Datenqualität.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte Zellsuspensionen, die für nachgeschaltete 10X Genomics Multiome-Arbeitsabläufe optimiert sind.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays, indem die Variabilität der Proben minimiert wird.
- Ermöglicht die skalierbare Herstellung von Zellbibliotheken für Hochdurchsatz-Screenings von Verbindungen oder Störungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Übereinstimmung mit krankheitsrelevanten Gewebemodellen für die translationale Biomarker-Entdeckung.
- Stellt durch die Erhaltung der Kernqualität über Experimente hinweg die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher.
- Verringert das Risiko technischer Artefakte, die die Interpretation präklinischer Daten verfälschen könnten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur Vorbereitung von Kernen integriert sich in die Schnittstelle zwischen Gewebeaufbereitung und Einzelkern-Multiom-Sequenzierung und unterstützt Arbeitsabläufe von der frühen Entdeckung bis hin zur präklinischen Forschung.
- Entdeckungsbiologie: Stellt hochwertige Zellkerne für Hypothesentests und Pfadanalysen in Gehirn- und Knochenmarkgeweben bereit.
- Screening: Gewährleistet die Einsatzbereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays für multimodale Profilierungsplattformen.
- Analytik: Liefert quantitative Metriken zur Beurteilung der Zellkernqualität, um die nachgeschaltete Datenanalyse und den Vergleich von Bedingungen zu unterstützen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern und die Genauigkeit von Krankheitsmodellen, indem die Integrität der Zellkerne erhalten bleibt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten, wiederverwendbaren Protokollablauf, der an verschiedene Gewebetypen und Studien angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in multiomischen Studien.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Protokollen zur Isolierung von Zellkernen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem sichergestellt wird, dass zuverlässige Dateneingaben vorliegen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Programmen in der Neurobiologie und Hämatologie.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gewebe-Dissociation, Nuklei-Isolierung und Beurteilung der Qualitätssicherung.
- Benötigt Zugang zu Durchflusszytometrie, automatischer Zellzählung und Sequenzierungsinfrastruktur.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um die Reproduzierbarkeit zwischen Studien und Standorten sicherzustellen.
- Kann eine Anpassung des Protokolls für verschiedene Gewebetypen oder Arten erforderlich machen.
- Hängt von der Aufrechterhaltung der Vitalität und Integrität der Zellkerne während sämtlicher Verarbeitungsschritte ab.
