Name: Isolierung, In-vitro-Expansion und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung ihrer therapeutischen Potenziale bei entzündlichen Erkrankungen.

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Die Forschung wurde durch ein Stipendium des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) und der Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11) unterstützt. Diese Studie wurde teilweise vom PROPP UESC finanziert (073.6764.2019.0021079-85). MGAG und URS dank des Stipendiums der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) bzw. der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Primärkultur von Stammzellen aus Fettgewebe aus Nebenhoden der Maus

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<li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-stem-cell-induced+immunoregulation+involves+FAS-ligand-%2FFAS-mediated+T+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis.</a> Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die MSCs können aus verschiedenen Geweben extrahiert werden. Obwohl Knochenmark sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen eine häufige Quelle für MSCs darstellt25,26, haben wir uns in dieser Studie für die Arbeit mit Fettgewebe entschieden, da es reich an MSCs ist, im Körper verteilt ist und leicht zugänglich ist. Als Alternative können aus Fett gewonnene Stammzellen verwendet werden, um MSCs-ähnliche immortalisierte Zellen zu erzeugen27.
Einige Punkte der Extraktion verdienen besondere Aufmerksamkeit für den Erfolg der hier vorgestellten Protokolle. Zunächst heben wir die Sorgfalt bei der Entnahme des Gewebes hervor, die unter aseptischen Bedingungen erfolgen muss. Stellen Sie also sicher, dass die Mäuse vor Beginn der Operation ordnungsgemäß mit 70% Alkohol desinfiziert werden. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, nicht die gleiche Pinzette und Schere zu verwenden, um das Nebenhodenfettgewebe aufzunehmen, um jede Kontaminationsquelle zu vermeiden. 
Ein zweites Problem ist die Verarbeitung von Gewebe. Die Fragmente in dem konischen Röhrchen müssen nach einer Inkubationszeit von 10 min bei 37 °C ordnungsgemäß und kräftig geschüttelt werden. Es ist sehr wichtig, das Medium am nächsten Tag und dann alle 2-3 Tage zu wechseln. Es wird empfohlen, die Kultur täglich zu beobachten und dabei die Farbe des Mediums, die Zellform und jegliche Interferenzen in der Umgebung der Kultur zu überprüfen. 
Eine dritte Sorge betrifft den besten Zeitpunkt/Durchgang für die MSC-Charakterisierung. Hier empfehlen wir, dies beim dritten Durchgang der Zellen zu tun, aber dies ist nicht zwingend erforderlich. Das hängt vom Ziel der Studie ab. In der dritten Passage haben wir etwa 80% der Zellen als MSCs charakterisiert, was zum Beispiel für die Ziele dieser Studie ausreicht. Die phänotypische Charakterisierung erfolgt durch die Analyse der Expression von hämatopoetischen Markern (z.B. CD34 und CD45) und mesenchymalen Markern (z.B. CD29, CD73, CD90 und CD105). Darüber hinaus betont die International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)21 , dass die ADSCs eine fibroblastenähnliche Morphologie aufweisen und an den Kunststoff der Kulturplattform anhaften sollten. Die Morphologie kann während der Wachstumskultur unter dem Mikroskop beobachtet werden. Die funktionelle Charakterisierung erfolgt durch die Analyse des Potenzials von ADSCs zur Differenzierung in Osteoblasten-, Adipoblasten- und Chondroblastenzellen. Bei der phänotypischen Charakterisierung kann der Prozentsatz der mesenchymalen und hämatopoetischen Marker je nach Tierart und Zellquelle variieren und entspricht nicht vollständig den von der ISCT empfohlenen Zahlen. Zum Beispiel empfiehlt das ISCT für humane MSCs ≥95 % CD105, CD73, CD90 und ≤2 % CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79a oder CD19, humanes Leukozytenantigen - DR-Isotyp (HLA-DR)21. Darüber hinaus ist es wichtig, die funktionelle Charakterisierung durchzuführen und die Multipotenz von Zellen zu bestätigen, die sich in Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozytenlinien differenzieren. Mindestens zwei dieser Linien werden zum Nachweis der Multipotenz empfohlen. 
Zusätzlich zu diesen hervorgehobenen Punkten können einige hier vorgeschlagene Assays substituiert werden, z. B. Alizarin Red S anstelle der Von Kossa-Färbung, Periodic Acid Shiff anstelle von Alcian Blue und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) anstelle der Durchflusszytometrie. 
Unter den drei beim Menschen beschriebenen Arten von Fettgewebe (weiß, braun und beige) hat weißes Fettgewebe die höchste Quelle für MSCs28. Dieses Gewebe kann aus der Unterhaut-, Bauch- und Leistenregion gewonnen werden, wie z. B. das Fett oberhalb der Nebenhoden, von dem hier berichtet wird. Die physikalische Fragmentierung und der enzymatische Verdau durch Kollagenase, die in dem hier geteilten Protokoll verwendet werden, leiten die stromale vaskuläre Fraktion (SVF) ab, die aus vielen Zelltypen besteht, mit Ausnahme der Adipozyten, die während der Verarbeitung erschöpft werden. 
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Hauptvorteile der Verwendung von Fettgewebe als Quelle für MSCs die Fülle und Einfachheit der Methoden zur Zellisolierung sind, die mit dem therapeutischen Potenzial der MSCs als entzündungshemmende und regenerative Eigenschaften verbunden sind.

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind adulte Multipotentialzellen, die sich in Zellen wie Osteoblasten, Chondroblasten und Adipozytendifferenzieren 1,2. Diese Zellen befinden sich in mehreren Organen und können daher aus adulten Geweben wie Knochenmark, Muskeln, Fett, Haarfollikel, Zahnwurzel, Plazenta, Dermis, Perichondrium, Nabelschnur, Lunge, Leber und Milz extrahiert werden 3,4.
Über die Auswirkungen von MSCs auf die Physiologie und das Immunsystem wurde berichtet 5,6. Diese Zellen haben sich als vielversprechend für die Behandlung verschiedener Krankheiten erwiesen, sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin. Die MSCs können Entzündungen kontrollieren und die Angiogenese und Gewebehomöostase durch verschiedene Mechanismen fördern, wie z. B. Zell-Zell-Kontakt, lösliche Faktoren und kleine extrazelluläre Vesikel 7,8,9,10. Darüber hinaus handelt es sich bei den MSCs um immunprivilegierte Zellen, die in der Lage sind, in immunologisch inkompatiblen allogenen Transplantatempfängern zu überleben, da diese Zellen eine geringe Expression von Klasse-I-Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) aufweisen und in der zellbasierten Therapie für allogene Transplantationen verwendet werden11,12. Die geringe Immunogenität in Kombination mit dem regenerativen Potenzial macht MSCs zu idealen Kandidaten für Zelltherapien, wie z.B. bei der Graft-versus-Host-Reaktion (GvHD)13, dem systemischen Lupus erythematodes (SLE)14 und der Multiplen Sklerose15 16,17.
Trotz der Tatsache, dass sich MSCs in mehreren adulten Geweben befinden, bietet das Fettgewebe Vorteile gegenüber anderen Quellen, wie z. B. die Zugänglichkeit für die Entnahme mit minimalen chirurgischen Eingriffen; große Anzahl verfügbarer Zellen mit hoher Expansionsrate; und einfache In-vitro-Expansion mit einem einfach durchzuführenden Protokoll, ohne dass spezielle Geräte und kostengünstige Materialien erforderlich sind 18,19,20. Nach der Extraktion müssen die aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ADSCs) charakterisiert werden, wie von der International Society for Cellular Therapy (ISCT)21 festgelegt. Daher müssen MSCs eine morphologische Fibroblasten-ähnliche Adhärenz an plastischen Kulturen aufweisen und einen hohen Prozentsatz (≥95%) von mesenchymalen Markern wie Endoglin (CD105), Ecto-5'-Nukleotidase (CD73) und Thy-1 (CD90) und einen niedrigen Prozentsatz (≤2%) von hämatopoetischen Markern wie Leukozyten-Common-Antigen (CD45), Transmembran-Phosphoglykoprotein (CD34), Glykolipid-verankertes Membranglykoprotein (CD14), Integrin alpha M (CD11b), B-Zell-Antigen-Rezeptor-Komplex-assoziierte Protein-Alpha-Kette (CD79α) oder B-Lymphozyten-Oberflächenantigen B4 (CD19) und humanes Leukozytenantigen der Klasse II (HLA-II). Darüber hinaus ist eine funktionelle Charakterisierung erforderlich, und die Zellen sollten in der Lage sein, sich in Osteoblasten-, Chondroblasten- oder Adipoblastenzellen zu differenzieren21.
In dieser Arbeit zeigen wir, wie die MSCs aus Nebenhodenfettgewebe mittels mechanischer Dissoziation und enzymatischem Verdau für in vitro Studien und die durch ISCT präkonisierte morphologische Charakterisierung gewonnen werden können.

<table><tbody><tr><td>140 °C; C Sterilisation bei hoher Hitze CO2 Inkubator</td><td>RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China</td><td>C180</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>I7018</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure eiszeitlich</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR1748</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>A9186</td><td>BioReagenz, geeignet für den Nachweis von Glykoproteinen. 1% in Essigsäure, pH 2,5</td></tr><tr><td>Alkohol 70%</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>65350-M</td><td>70% in Wasser</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper gegen Maus anti-CD29 FITC (Klon Ha2/5)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>555005</td><td>Funktionen in der Zelle: Adhäsion und Aktivierung, Embryogenese, Leukozyten, DC, Blutplättchen, Mastzellen, Fibroblasten und Endothelzellen</td></tr><tr><td>Antikörper Anti-Maus Anti-CD34 PE (Klon RAM34)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>551387</td><td>Funktionen in der Zelle: Zelladhäsionsfaktor. Hämatopoetische Stammzellen</td></tr><tr><td>Antikörper Anti-Maus Anti-CD45 APC (Klon 30-F11)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>559864</td><td>Funktionen in der Zelle: Hilft bei der Aktivierung von Leukozyten</td></tr><tr><td>Antikörper Anti-Maus Anti-CD71 FITC (Klon C2)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>553266</td><td>Funktionen in der Zelle: Kontrolliert die Eisenaufnahme während der Zellproliferation. Proliferierende Zellen, Retikulozyten und Vorläufer</td></tr><tr><td>Antikörper Anti-Maus Anti-CD90 PerCP (Klon OX-7)</td><td>BD Biosciences, San Diego, CA, USA</td><td>557266</td><td>Funktionen in der Zelle: Signalweg, Adhäsion. T-Lymphozyten, NK, Monozyten, HSC, Neuronen, Fibroblasten</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR1008</td><td></td></tr><tr><td>Automatische Pipetten</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>4700850N</td><td>Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits</td></tr><tr><td>Becherglas</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td><td>1 Einheit</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten (6-Well)</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>Z707759</td><td>07 Einheiten steril. TPP-Gewebekulturplatten</td></tr><tr><td>Zellkulturplatten (96-Well. Rund- oder V-Boden)</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>CLS353077</td><td>01 Einheit steril. Wells, 96, mit Gewebekultur (TC) behandelte Oberfläche, durchsichtige Wells mit rundem Boden, steriles</td></tr><tr><td>chondrogeneses Medium</td><td>Stem Pro Chondrogenesis Differenzierung&ndash; Life Technologies</td><td>A1007101</td><td>TGF-&beta; 2, TGF-&Beta; 3, Dexamethason, Insulin, Transferrin, ITS, Natrium-L-Ascorbat, Natriumpyruvat, Ascorbat-2-phosphat</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Life Technologies, Kalifornien, USA</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Kork- oder Styroporplatte mit Aluminium überzogen</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td><td>1 Einheit</td></tr><tr><td>Baumwolle</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td><td>03 Einheiten steriles</td></tr><tr><td>DPX Eindeckmittel für die Histologie</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>D5523</td><td>Mit 1000 mg/L Glucose und L-Glutamin, ohne Natriumbicarbonat, Pulver, geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>Eosin B</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>861006</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>47608</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadel (0,3 mm x 13 mm)</td><td>Nicht anwendbar</td><td></td><td>5 Einheiten</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>I0200000</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>563935</td><td>70% in H2O</td></tr><tr><td>Ketamin-D4-Hydrochloridlösung</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>K-006</td><td>1,0 mg/ml in Methanol (als freie Base), zertifiziertes Referenzmaterial, Cerilliant&reg;</td></tr><tr><td>Neubauer Kammer</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>BR718620</td><td>BRAND Zählkammer BLAUBRAND Neubauer Muster. Mit Clips, doppellinigen</td></tr><tr><td>Nichiryo-Pipettenspitzen (0,1&ndash; 10 &mu; L)</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>Z645540</td><td>Volumenbereich 0,1&ndash; 10 &mu; L, länglich, Großpackung. Sterile</td></tr><tr><td>Nichiryo Pipettenspitzen (1&ndash; 10 mL)</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>Z717401</td><td>Volumenbereich 1&ndash; 10 mL, universell, Großpackung. Sterile</td></tr><tr><td>Nichiryo Pipettenspitzen (200 &mu; L)</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>Z645516</td><td>Maximales Volumen 200 &mu; L, graduiert, Ministack. Steriles</td></tr><tr><td>Öl-Rot-O-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>O1391</td><td>0,5 % in Isopropanol-Paraffin</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>107.151</td><td>46&ndash; 48, in Blockform</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>P4333</td><td>Lösung stabilisiert, mit 10.000 Einheiten Penicillin und 10 mg Streptomycin/ml, 0,1 &mu; m filtriert, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS).</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>P3813</td><td>Pulver, pH 7,4, zur Herstellung von 1 L Lösungen. Konische und sterile</td></tr><tr><td>Röhrchen aus Polypropylen (15 mL)</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>konische Röhrchen aus Polypropylen (50 mL)</td><td>Falcon, Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td> 2 <td>Einheiten steriles</td></tr><tr><td>Skalpell (optional)</td><td>Nicht anwendbar</td><td></td><td>1 Einheit</td></tr><tr><td>Silbernitrat</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>Natriumthiosulfat</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Pinzette (15 cm)</td><td>Nicht anwendbar</td><td></td><td>3 Einheiten sterile</td></tr><tr><td>Schweizer männliche Mäuse (6&ndash; 8 Wochen)</td><td>Bioterium, Santa Cruz State University</td><td>021/22</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (1 mL)</td><td>Nicht anwendbar</td><td></td><td>1 Stück</td></tr><tr><td>Trypan Blue Dye</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>T8154</td><td>0,4%, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>PHR3263</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphat Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA</td><td>G9422</td><td>BioUltra, geeignet für Zellkultur, geeignet für pflanzliche Zellkultur, &ge; 99% (Titration)</td></tr></tbody></table>

isolierung, in-vitro-expansion und charakterisierung von mesenchymalen stammzellen aus epididymalem fettgewebe der maus

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als neuer therapeutischer Ansatz ausgiebig untersucht, hauptsächlich um verschlimmerte Entzündungen aufgrund ihres Potenzials, die Immunantwort zu modulieren, zu stoppen. Die MSCs sind immunprivilegierte Zellen, die in der Lage sind, in immunologisch inkompatiblen allogenen Transplantatempfängern zu überleben, basierend auf der geringen Expression von Klasse-I-Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und bei der Verwendung zellbasierter Therapien für allogene Transplantationen. Diese Zellen können aus mehreren Geweben isoliert werden, wobei die am häufigsten verwendeten Gewebe das Knochenmark und das Fettgewebe sind. Wir bieten ein einfaches Protokoll zur Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von MSCs aus Nebenhodenfettgewebe von Mäusen. Das Nebenhodenfettgewebe wird chirurgisch exzidiert, physikalisch fragmentiert und mit 0,15%iger Kollagenase-Typ-II-Lösung verdaut. Anschließend werden primäre Fettgewebe-Stammzellen (ADSCs) in vitro kultiviert und expandiert, und die phänotypische Charakterisierung erfolgt durch Durchflusszytometrie. Wir liefern auch die Schritte zur Differenzierung der ADSCs in osteogene, adipogene und chondrogene Zellen, gefolgt von der funktionellen Charakterisierung jeder Zelllinie. Das hier bereitgestellte Protokoll kann für In-vivo - und Ex-vivo-Experimente verwendet werden, und als Alternative können die aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen zur Erzeugung von MSCs-ähnlichen immortalisierten Zellen verwendet werden.

Zellen, die gemäß dem hier vorgestellten Protokoll aus Fettgewebe extrahiert wurden, zeigten eine Morphologie, die den von der ISCT vorgeschlagenen Mindestkriterien für MSCs entsprach. Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Phänotypisch zeigten ADSCs in den ersten Tagen der Zellkultur eine Adhärenz an der plastischen und fibroblastenähnlichen Morphologie (Abbildung 2A). Zudem wuchsen sie homogen und bildeten Kolonien. Darüber hinaus zeigten ADSCs eine geringe Expression von CD34 (2,12 %) und CD45 (1,81 %), beides hämatopoetische Marker, und eine hohe Expression von CD71 (42,6 %), CD29 (74,2 %) und CD90 (55,1 %), alles mesenchymale Zellmarker (Abbildung 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig02.jpg"> Abbildung 2: Phänotypische Charakterisierung von Zellen aus Fettgewebe. (A) ADSCs-Morphologie, die sich an den Tagen 2, 4 und 8 der Kultur von rund zu fibroblastenartig ändert; Maßstabsbalken = 22,22 μm. (B) Histogramme für Marker, die durch ASC exprimiert (CD71, CD29 und CD90) oder nicht (CD34 und CD45) exprimiert werden. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Miranda et al.24 reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Funktionell zeigten ADSCs eine Multipotenz zur Differenzierung in Osteoblasten, Adipoblasten und Chondroblasten, wenn sie 14 oder 21 Tage lang in konditionierten Medien für jede Linie kultiviert wurden (Abbildung 3). Die Von-Kossa-Färbung zeigte mineralisierte Knötchen in der extrazellulären Matrix, die für den Osteogeneseprozess charakteristisch sind (Abbildung 3). Die Ölrot-O-Färbung wies Lipidvakuolen im Zytoplasma von ADSCs nach, und die Alcianblau-Färbung bestätigte das Vorhandensein von Glykosaminoglykanen in der extrazellulären Matrix (Abbildung 3). Zusammengenommen haben phänotypische und funktionelle Merkmale die Population von Zellen bestätigt, die aus Nebenhodenfettgewebe als MSCs extrahiert wurden.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65722/65722fig03.jpg"> Abbildung 3: Funktionelle Charakterisierung von Zellen aus Fettgewebe. Osteogenes, adipogenes und chondrogenes Multilinienpotenzial von ADSC nach 14 und 21 Tagen in Kultur. Maßstabsleiste = 50 μm (obere Platte), 100 μm (mittlere und untere Platte). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Miranda et al.24 reproduziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65722/65722fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Das Fettgewebe ist eine ausgezeichnete Quelle für mesenchymale Stammzellen. Hier bringen wir die Schritt-für-Schritt-Extraktion, Kultivierung und Charakterisierung von Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe von Schweizer Mäusen an.

Isolierung, In-vitro-Expansion und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been extensively studied as a new therapeutic approach, mainly to stop exacerbated inflammation due to their potential ...

Meine Forschung konzentriert sich auf aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen als neuen Behandlungsansatz, der mit anderen Therapien verbunden oder nicht verbunden ist, um die Entzündung durch verschiedene Krankheiten zu verbessern. Wir zeigten, dass die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen in Verbindung mit Praziquantel die granulomatöse Reaktion bei der Infektion mit Schistosoma mansoni signifikant kontrolliert hat, was die Vorteile dieses kombinierten Behandlungsansatzes hervorhebt. Unser Protokoll adressiert die Forschungslücke bei der sorgfältigen Entnahme von Nebenhodenfettgewebe unter aseptischen Bedingungen, dass die physikalische Verarbeitung mit kräftigem Schütteln einhergeht, und identifiziert den optimalen Zeitpunkt für die Verwendung von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen.Unser Protokoll bietet erhebliche Vorteile, insbesondere die reichliche Verfügbarkeit und die potenzielle Stärke für die Isolierung von mesenchymalen Stammzellen. Darüber hinaus weisen mesenchymale Stammzellen starke therapeutische Eigenschaften auf, einschließlich entzündungshemmender und geweberegenerierender Fähigkeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von fluoreszenzmarkierten Stammzellen (ADSCs) aus Fettzellen (ADSCs) aus dem periaortalen Bogenfettgewebe von Mäusen. Nach der Isolierung werden die NCADSCs nachgewiesen, mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert und anschließend auf einer Platte kultiviert, wodurch die Zellproliferation gefördert wird.

Isolierung von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus periaortalem Fettgewebe der Maus

Wir stellen ein Protokoll Fettgewebe stamm mikrovaskulärer Fragmente zu isolieren, die viel versprechende Vaskularisierung Einheiten darstellen. Sie können schnell isoliert werden, erfordern nicht in vitro - Prozessierung und somit für Prävaskularisation Ein-Schritt verwendet werden kann , in verschiedenen Bereichen des Tissue Engineering.

Die Isolierung von murinen Fettgewebe stammenden mikrovaskuläre Fragmente als Vaskularisation Einheiten für Tissue Engineering

Dieses Protokoll bietet eine enzymfreie Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus abdominoplastischen und lipoaspiratischen Proben mit einer Explant-Methode. Das Fehlen harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte sieht klinisch relevante Stammzellen vor, die für Studien in vitro verwendet oder in die Klinik zurückgebracht werden können.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (Ad-MSCs) können eine potenzielle Quelle für MSCs sein, die sich in insulinproduzierende Zellen (IPCs) differenzieren. In diesem Protokoll stellen wir detaillierte Schritte zur Isolierung und Charakterisierung von epididymalen Ad-MSCs von Ratten bereit, gefolgt von einem einfachen, kurzen Protokoll zur Generierung von IPCs aus denselben Ratten-Ad-MSCs.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes von Ratten zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.

Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe von Sprague-Dawley-Ratten

Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

In diesem Artikel zeigen wir die Isolierung von murinen Wohnsitz Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge), deren Expansion, Charakterisierung und Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung ihrer therapeutischen Potenziale bei entzündlichen Erkrankungen.

Isolierung, In-vitro-Expansion und Charakterisierung von mesenchymalen Stammzellen aus epididymalem Fettgewebe der Maus

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