Name: Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Erfahren Sie die MyDoBID-Technik zur Isolierung einzelner Muskelfasern aus gefriergetrockneter menschlicher Skelettmuskulatur und deren Klassifizierung nach Myosin-Schwerketten-Isoformen. Diese Methode ermöglicht die Analyse fasertyp-spezifischer Proteinausdrucksunterschiede.

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Die in dieser Studie verwendeten Antikörper gegen MHC I (A4.840) und MHCIIa (A4.74) wurden von Dr. H. M. Blau entwickelt, und der Antikörper gegen MHCIIx (6H1) wurde von Dr. C. A. Lucas entwickelt und von der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) unter der Schirmherrschaft des National Institute of Child Health and Human Development bezogen und von der University of Iowa unterhalten. Fachbereich Biologische Wissenschaften (Iowa City, IA). Wir danken Victoria L. Wyckelsma für die Bereitstellung der menschlichen Muskelproben für diese Studie. Der Großteil der Bilder in Abbildung 1 stammt aus BioRender.com.
Finanzierung: Diese Studie erhielt keine Drittmittel.

MyDoBID - eine neuartige Technik zur effizienten Identifizierung von Muskelfasertypen

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Sammlung von Fasern Basierend auf mehrjähriger Erfahrung können die meisten Forscher diese Technik beherrschen; Die Praxis führt jedoch zu einer schnelleren und effizienteren Fasersammlung für nachgelagerte Analysen. Um 30 einzelne Fasersegmente einer Qualität für das Pooling isolieren zu können, wird empfohlen, 50 Fasersegmente pro Probe zu sammeln. Es wird empfohlen, das Video zur Fasersammlung sorgfältig und nach Durchführung von zwei Übungssitzungen (~50 Fasern pro Sitzung) zu studieren, um einen ...

Der Skelettmuskel ist ein heterogenes Gewebe mit ausgeprägten zellulären metabolischen und kontraktilen Eigenschaften, die davon abhängen, ob die Zelle (Faser) langsam zuckt (Typ I) oder schnell zuckt (Typ II). Der Fasertyp kann durch die Untersuchung der Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) identifiziert werden, die sich in mehrfacher Hinsicht voneinander unterscheiden, einschließlich Kontraktionszeit, Verkürzungsgeschwindigkeit und Ermüdungsbeständigkeit1. Zu den wichtigsten MHC-Isoformen gehören Typ I, Typ IIa, Typ IIb und Typ IIx, und ihre metabolischen Profile sind entweder oxidativ (Typ I und IIa) oder glykolytisch (IIx, IIb)1. Der Anteil dieser Fasertypen variiert je nach Muskeltyp und zwischen den Arten. Typ IIb kommt häufig im Nagetiermuskel vor. Menschliche Muskeln enthalten keine Typ-IIb-Fasern und bestehen überwiegend aus MHC-Isoformen der Typ-I- und IIa-Fasern, mit einem geringen Anteil an IIx-Fasern2. Die Proteinexpressionsprofile variieren zwischen verschiedenen Fasertypen und können sich mit dem Alter3, der körperlichen Betätigung 4,5 und der Krankheit6 verändern.
Die Messung zellulärer Reaktionen in verschiedenen Skelettmuskelfasertypen wird aufgrund der Untersuchung von Muskelhomogenaten (eine Mischung aus allen Fasertypen) oft übersehen oder ist nicht möglich. Der Western Blot mit einer Faser ermöglicht die Untersuchung mehrerer Proteine in einzelnen Muskelfasern7. Diese Methodik wurde zuvor verwendet, um neuartige und informative Einzelfasereigenschaften herzustellen, die mit Homogenatpräparaten nicht erreicht werden konnten. Es gibt jedoch einige Einschränkungen der ursprünglichen Einzelfaser-Western-Blot-Methode, einschließlich der zeitaufwändigen Natur, der Unfähigkeit, Probenreplikate zu erstellen, und der Verwendung teurer, empfindlicher Reagenzien für die verbesserte Chemilumineszenz (ECL). Wenn frisches Gewebe verwendet wird, ist diese Methode aufgrund der zeitlichen Beschränkungen, einzelne Fasern innerhalb eines begrenzten Zeitrahmens (d. h. 1-2 Stunden) zu isolieren, weiter eingeschränkt. Glücklicherweise wird diese Einschränkung durch die Isolierung von Einzelfasersegmenten aus gefriergetrocknetem Gewebe gemildert8. Die Fasergewinnung aus gefriergetrockneten Proben ist jedoch durch die Größe und Qualität des biopsierten Gewebes begrenzt.
Die Identifizierung von Fasertypen mit der Dot-Blotting-Methode9 wurde in diesem umfassenden Protokoll erheblich ausgearbeitet und erweitert. Zuvor wurde gezeigt, dass bereits ~2-10 mg nasses Muskelgewebe für die Gefriertrocknung und die Analyse von MHC-Isoformproteinen aus einer Faser ausreichen9. Christensen et al.9 verwendeten 30% eines ~1 mm großen Fasersegments, um die MHC-Isoform durch Dot Blot zu detektieren, was durch Western Blot bestätigt wurde. Diese Arbeit zeigte, dass durch die Substitution von Western Blotting durch Dot Blot die Gesamtkosten um ~40-fach gesenkt wurden (für 50 Fasersegmente). Die Fasern wurden dann in Typ-I- und Typ-II-Proben "gepoolt", was eine experimentelle Replikation ermöglichte9. Eine Einschränkung bestand jedoch darin, dass nur zwei fasertypspezifische Proben gewonnen wurden: Typ I (MHCI-positiv) und Typ II (MHCII-positive Fasern), wobei Typ-II-Proben eine Mischung aus MHCIIa und MHCIIx 6,10 enthielten. Insbesondere zeigt das aktuelle Protokoll, wie reine Typ-IIx-Fasern identifiziert werden können, und bietet einen sehr detaillierten Arbeitsablauf (zusammengefasst in Abbildung 1), einschließlich Strategien zur Fehlerbehebung bei häufigen Protokollproblemen.

<table><tbody><tr><td>1x Denaturierungspuffer</td><td>Nach Rezept herstellen</td><td>Die Bestandteile können von Sigma-Aldrich oder anderen Chemikalienvertriebsunternehmen bezogen werden</td><td>. 1x Denaturierungspuffer wird durch Verdünnung von 3x Denaturierungspuffer 1 in 3 V/V mit 1X Tris-HCl (pH 6,8) hergestellt. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>3x Denaturierungspuffer</td><td>Nach Rezeptur herstellen</td><td>Die Bestandteile können von Sigma-Aldrich oder anderen Chemiehändlern bezogen werden</td><td>3x Denaturierungspuffer enthält: 0,125 M Tris-HCI, 10 % Glycerin, 4 % SDS, 4 M Harnstoff, 10 % 2-Mercaptoethanol und 0,001 % Bromphenolblau, pH 6,8. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>N/A</td><td>100% Ethanol kann von jedem Unternehmen bezogen werden</td><td>Verdünnt auf 95% mit hochreinem H2O.</td></tr><tr><td>Polyklonaler Aktin-Kaninchen-Antikörper</td><td>Sigma-Aldbsp</td><td>; A2066</td><td>1 zu 1.000 mit BSA-Puffer verdünnen.</td></tr><tr><td>Analysewaagen</td><td>Mettler Toledo</td><td>Modellnummer: MSZ042101</td><td></td></tr><tr><td>Antikörperverstärker</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>32110</td><td>Der Produktname lautet Miser Antikörper-Extender Solution NC.</td></tr><tr><td>Becherglas (100 mL)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5452</td><td>Modellname: Mini Spin.</td></tr><tr><td>Blockierungspuffer: 5 % Magermilch im Waschpuffer.</td><td>Diploma</td><td>Im Shop gekaufter</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Puffer: 1 % BSA/PBST, 0,02 % NaN3</td><td>BSA: Sigma-Aldbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PBS: Bio-Rad Laboratorien. NaN3 : Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>BSA: A6003-25G&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x PBS: 1610780&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaN3: S2002</td><td>Rinderserumalbumin (BSA), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Natriumazid (NaN3). Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Öffnungshebel für die Kassette</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4560000</td><td>Wird zum Öffnen der vorgefertigten Gelkassetten verwendet.</td></tr><tr><td>Chemidoc MP Imager&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>Modellnummer: Universalhaube III</td><td>Jedes Bildgebungssystem mit fleckenfreien Gel-Bildgebungsfunktionen.</td></tr><tr><td>Criterion Blotter</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704070</td><td>Enthält Eisbeutel, Transferschale, Rolle, 2 Kassettenhalter, Filterpapier, Schaumstoffpolster und Deckel mit Kabeln.</td></tr><tr><td>Criterion Cell (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1656001</td><td></td></tr><tr><td>ECL (enhanced chemiluminescence)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1705062</td><td>Produktname: Clarity Max Western ECL Substrat.</td></tr><tr><td>Elektrophoresepuffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610772</td><td>Verdünnen Sie 10x TGS 1 zu 10 mit ultrareinem H2O.</td></tr><tr><td>Filterpapier, 0,34 mm stark</td><td>Whatmann</td><td>3030917</td><td>Großformat 3 MM, Packung 100 Blatt, 315 x 335 mm.</td></tr><tr><td>Zange zum Präparieren von feinem Gewebe</td><td>Dumont</td><td>F6521-1EA</td><td>Jeweller' s Pinzette Nr. 5.</td></tr><tr><td>Flache Kunststoffschale/Deckel &nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Groß genug, um die Membran darauf zu platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche vollständig eben ist.</td></tr><tr><td>Gefriertrocknungsanlage</td><td>Labconco</td><td>7750030</td><td>Freezone 4,5 L mit Glaskammer-Probentisch.</td></tr><tr><td>Gefrierschrank -80 oC&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Jeder Gefrierschrank mit einer konstanten Temperatur von -80 &°; C geeignet ist.</td></tr><tr><td>Gelabscheider</td><td>1653320</td><td>Bio-Rad</td><td>Schieben Sie unter die Membran, um die Membran zu sammeln oder zu bewegen.</td></tr><tr><td>Grauer Bleistift</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&NBSP; Software für das Image-Labor&nbsp;</td>Die Zahlen von <td>Bio-Rad Laboratories</td><td>N/A</td><td>beziehen sich auf die Softwareversion 5.2.1, es können jedoch auch andere Versionen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1660521</td><td>Jeder Inkubator, der auf 37 μd; C würde ausreichen.</td></tr><tr><td>Lampe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer mit Floh</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Membranwalze &nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1651279</td><td>Kann im Transfer-Bundle erworben werden. Wenn dieses Produkt jedoch nicht verfügbar ist, würde jedes zylindrische Rohr mit glatter Oberfläche, das lang genug ist, um über die Membran zu rollen, ausreichen.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugen-Röhrchen&nbsp; (0,6 ml)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG HRP sekundär</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31430</td><td>Ziege Anti-Maus IgG (H+L), RRID AB_228341. Bei 1 zu 20.000 im Blockierungspuffer verdünnen.</td></tr><tr><td>Maus IgM HRP sekundär</td><td>Abcam</td><td>ab97230</td><td>Ziege Anti-Maus IgM mu Kette. In der gleichen Verdünnung wie Maus-IgG verwenden.</td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain I (MHCI) Primärantikörper</td><td>DSHB</td><td>A4.840&nbsp;</td><td>Verdünnungsbereich: 1 zu 200 bis 1 zu 500 in BSA-Puffer.</td></tr><tr><td>Myosin-Schwerkett-IIa (MHCIIa)-Primärantikörper</td><td>DSHB</td><td>A4.74&nbsp;</td><td>Verdünnungsbereich: 1 zu 200 bis 1 zu 500 in BSA-Puffer.</td></tr><tr><td>Myosin-Schwerketten-IIx (MHCIIx)-Primärantikörper</td><td>DSHB</td><td>6H1</td><td>Verdünnungsbereich: 1 zu 200 bis 1 zu 500 in BSA-Puffer.</td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran 0,45 &Mikro; M&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620115</td><td>Für Western Blotting.</td></tr><tr><td>Petrischalendeckel</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffpinzette</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>164-5050</td><td>Produktname: Basis-Stromversorgung.</td></tr><tr><td>Proteinleiter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter, 10 bis 180 kDa.</td></tr><tr><td>PVDF-Membran 0,2 & Mikro; m</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen HRP sekundär</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31460</td><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), RRID AB_228341. Verdünnung wie bei Sekundärantikörpern der Maus.</td></tr><tr><td>Wippe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lineal</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Stripping Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21059</td><td>Produktname: Restore Western Blot Stripping Buffer.</td></tr><tr><td>Taschentuch (fusselfrei)</td><td>Kimberly-Clark professional</td><td>34120</td><td>Produktname: Kimwipe.</td></tr><tr><td>Transferpuffer (1x Trisglycin-Puffer (TG), 20% Methanol)</td><td>TG: Bio-Rad Laboratories&nbsp; &nbsp; Methanol: Merck</td><td>TG Puffer: 1610771&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Methanol: 1.06018</td><td>10x TG Puffer mit hochreinem H2O auf 1x verdünnen. 100 % Methanol bis zu einer Endkonzentration von 20 % Methanol zugeben. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Transfertablett</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1704089</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Vorgefertigtes Gel zur UV-Aktivierung</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5678085</td><td>Geltyp: 4&ndash; 15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 Well, 15 & micro;L.</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Waschpuffer (1x TBST)</td><td>10x TBS: Astral Scientific&nbsp; Tween 20: Sigma</td><td>&nbsp; BIOA0027-4L</td><td>1x TBST Rezept: 10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) wird auf 1x mit hochreinem H2O verdünnt, Tween 20 wird bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben. Puffer bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Waschbehälter</td><td>Sistema</td><td>Store gekauft</td><td>Jeder Tupperware-Behälter, der den ungefähren Abmessungen der Membran entspricht, würde ausreichen.</td></tr></tbody></table>

identifizierung des fasertyps der menschlichen skelettmuskulatur

Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle

Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, um spezifische Myosin-Schwerketten-Isoformen (MHC) in Segmenten einzelner Muskelfasern unter Verwendung von Dot-Blotting zu identifizieren, im Folgenden als My-Osin-Schwerketten-Detektion durch Do-t-B-Lotting zur Identifizierungdes Muskelfasertyps (MyDoBID) bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Gefriertrocknung der menschlichen Skelettmuskulatur und der Isolierung von Segmenten einzelner Muskelfasern. Mit MyDoBID werden Typ-I- und Typ-II-Fasern mit MHCI- bzw. IIa-spezifischen Antikörpern klassifiziert. Klassifizierte Fasern werden dann für jede Biopsie zu fasertypspezifischen Proben kombiniert.
Das Gesamtprotein in jeder Probe wird durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und UV-aktivierte Geltechnologie bestimmt. Der Fasertyp der Proben wird mittels Western Blot validiert. Es wird auch beschrieben, wie wichtig es ist, eine Normalisierung der Proteinbeladung durchzuführen, um die Detektion von Zielproteinen über mehrere Western Blots hinweg zu verbessern. Zu den Vorteilen der Konsolidierung klassifizierter Fasern in fasertypspezifischen Proben im Vergleich zu Western Blots mit einer Faser gehören die Vielseitigkeit der Proben, der erhöhte Probendurchsatz, die kürzere Zeitinvestition und die Kosteneinsparungsmaßnahmen, während wertvolle fasertypspezifische Informationen erhalten bleiben, die bei homogenisierten Muskelproben häufig übersehen werden. Der Zweck des Protokolls besteht darin, eine genaue und effiziente Identifizierung von Typ-I- und Typ-II-Fasern zu erreichen, die aus gefriergetrockneten menschlichen Skelettmuskelproben isoliert wurden.
Diese einzelnen Fasern werden anschließend zu typ- und typ-II-fasertypspezifischen Proben kombiniert. Darüber hinaus wird das Protokoll um die Identifizierung von Typ-IIx-Fasern erweitert, wobei Aktin als Marker für Fasern verwendet wird, die negativ für MHCI und MHCIIa waren, die durch Western Blot als IIx-Fasern bestätigt werden. Jede fasertypspezifische Probe wird dann verwendet, um die Expression verschiedener Zielproteine mit Hilfe von Western-Blotting-Techniken zu quantifizieren.

Identifizierung einzelner MHCI-, MHCIIa- und MHCIIx-Muskelfasern mittels Dot Blot Ein Merkmal von MyDoBID ist die Kategorisierung der variierenden MHC- und Aktin-Signalintensitätsstärke in einer bestimmten Faser (Abbildung 4A). Der Fasertyp wurde durch das Vorhandensein oder Fehlen von MHCI- und IIa-Isoformen identifiziert (Abbildung 4B). Sechs Fasern zeigten keine MHC- oder Aktin-Detektion, was darauf hindeutet, dass keine Faser gesammelt wu...

Dieses Protokoll demonstriert die Einzelfaserisolierung aus gefriergetrocknetem menschlichem Skelettmuskel und die Klassifizierung von Fasertypen gemäß der Myosin-Schwerketten-Isoform (MHC) unter Verwendung der Dot-Blotting-Technik. Identifizierte MHC I- und II-Faserproben können dann mittels Western Blot weiter auf fasertypspezifische Unterschiede in der Proteinexpression analysiert werden.

Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur

The technique described here can be used to identify specific myosin heavy chain (MHC) isoforms in segments of individual muscle fibers using dot ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Skelettmuskulatur, die aus Zellen mit ausgeprägten metabolischen und kontraktilen Eigenschaften besteht, die als langsam oder schnell zuckende Fasern gekennzeichnet sind. Wir befassen uns mit den Faktoren, die zu diesen Unterschieden beitragen, und untersuchen ihre Auswirkungen im Zusammenhang mit Alterung, Bewegung und verschiedenen Krankheiten. Die Messung zellulärer Reaktionen in verschiedenen Skelettmuskelfasern wird oft übersehen oder ist aufgrund der Untersuchung von Muskelhomogenaten nicht möglich.Die MyDoBID-Technik ermöglicht es uns, Proteinunterschiede zwischen den Fasertypen wiederholt zu analysieren, die bisher nicht messbar waren. Dieses Protokoll identifiziert genau und effizient Typ-1- und Typ-2-Muskelfasern aus gefriergetrockneten menschlichen Skelettmuskelproben. Diese neu überarbeitete Methode bietet Forschern einen einfachen Ansatz, um Proteinunterschiede in der Skelettmuskulatur auf zellulärer Ebene zu untersuchen.Insbesondere erleichtert es die Identifizierung von X-Fasern vom Typ zwei, und diese waren in der Vergangenheit schwierig zu unterscheiden. Die Technik ermöglicht es den Forschern, alle Fasertypen zu beleuchten, einschließlich der schwer fassbaren X-Faser vom Typ zwei. Mit der MyDoBID-Technik können nun zahlreiche Fragen beantwortet werden.Zum Beispiel kann man die Eigenschaften von Muskelfasern vom Typ zwei X entdecken und feststellen, ob es Hinweise auf eine bevorzugte Atrophie von Muskelfasern vom Typ zwei X während des Alterns oder der Krankheit gibt. Man kann auch beobachten, wie sich eine bestimmte Übungsintervention auf jeden Fasertyp auswirkt.

fiber-type-identification-of-human-skeletal-muscle

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier präsentieren wir ein Protokoll für schnelle Muskelfaseranalysen, die eine verbesserte Färbequalität ermöglicht und dadurch die automatische Erfassung und Quantifizierung von Faserpopulationen die frei verfügbare Software ImageJ.

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Immunhistochemische Färbung des Myosin schwere Kette Isoformen als State-of-the-Art-Diskriminator des skelettartigen Muskels Fasertyp entstanden (d.h., Typ I, Typ IIA, Typ IIX, Typ IIB). Hier präsentieren wir Ihnen eine Färbung Protokoll sowie eine neuartige semi-automatischen Algorithmus, der erleichtert die schnelle Beurteilung der Fasertyp und Faser Morphologie.

Semi-automatische Analyse von Maus Skelettmuskulatur Morphologie und Fasertyp Zusammensetzung

Dieser technische Bericht beschreibt eine Variation der modifizierten Bergström-Technik für die Biopsie des Musculus tibialis anterior, die Faserschäden begrenzt.

Sammlung von Skelettmuskelbiopsien aus dem Superior-Fach des menschlichen Musculus Tibialis Anterior für mechanische Bewertung

Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass eine übermäßige Infiltration von Lipiden in der Skelettmuskulatur zu Lipotoxizität und Diabetes führt. Hier präsentieren wir ein vollständiges Protokoll, einschließlich Gewebeverarbeitung, Färbung mit Bodipy, Bildaufnahme und Analyse, um die Größe, Dichte und subzelluläre Verteilung von Lipidtröpfchen auf fasertypspezifische Weise zu quantifizieren.

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakter einzelner Muskelfasern aus dem oxidativen Soleus und die Einrichtung hochgereinigter Myoblastkulturen, die aus diesen Fasern gewonnen wurden. Das optimierte Verfahren liefert zuverlässig etwa 300–500 intakte Myofasern pro Maus, was nachgelagerte molekulare und zelluläre Analysen ermöglicht.

Einzelfaser-Isolationstest zur Beurteilung des oxidativen Myofaserverhaltens

Es wird ein Protokoll zur Synthese von Peptoiden mit gemischter kationischer Funktionalität in der gleichen Sequenz vorgestellt (Lysin- und Arginin-Typ-Monomere). Anschließende Tests dieser Verbindungen gegen Leishmania mexicana, die protozoischen Parasiten, die kutane Leishmaniose verursachen, werden ebenfalls beschrieben.

Eine effiziente Methode zur Synthese von Peptoide mit gemischten Lysine-Typ / Arginin-Monomeren und die Bewertung der Anti-Leishmania-Aktivität

Wir schlagen ein Protokoll vor, um Fettsäuren zu identifizieren, ohne sie reinigen zu müssen. Es kombiniert Informationen über die Retentionszeiten mit den Massenspektren von drei Arten von Fettsäurederivaten: Fettsäuremethylester (FAMEs), 4,4-Dimethyloxazolinderivate (DMOX) und 3-Pyridylcarbinylester (Picolinyl).

Identifizierung von Fettsäuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Erfahren Sie die MyDoBID-Technik zur Isolierung einzelner Muskelfasern aus gefriergetrockneter menschlicher Skelettmuskulatur und deren Klassifizierung nach Myosin-Schwerketten-Isoformen. Diese Methode ermöglicht die Analyse fasertyp-spezifischer Proteinausdrucksunterschiede.

Identifizierung des Fasertyps der menschlichen Skelettmuskulatur

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