Name: Eine optimierte Reverse-Poly-Transfektionstechnik auf Basis embryonaler Stammzellen der Maus zur schnellen Erforschung von Nukleinsäureverhältnissen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Lernen Sie die optimierte Reverse-Poly-Transfektion für embryonale Maus-Stammzellen in 2i- und LIF-Medien. Diese Methode ermöglicht höhere Zellviabilität und Transfektionseffizienz für die schnelle Optimierung von Plasmidverhältnissen.

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Die Autoren möchten die vielen Beiträge auf diesem Gebiet würdigen, die in dieser Arbeit aus Platzgründen nicht zitiert wurden, sowie die Förderorganisationen, die diese Möglichkeit zur Verfügung gestellt haben. Die Autoren danken für die Finanzierung durch den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und die Canadian Institutes of Health Research (CIHR), die diese Arbeit unterstützt haben. K.M. ist Empfänger eines CGS-M-Stipendiums von NSERC und eines Killam-Doktorandenstipendiums von der University of British Columbia. N.S. ist Empfänger eines Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

1. Vorbereitung von Reagenzien für die mPSC-Kultur
<ol><li>N2-Ergänzung vorbereiten.<ol><li>Unter nicht sterilen Bedingungen werden die folgenden Stammlösungen (Schritt 1.1.1.1) in einem chemischen Sicherheitsabzug hergestellt. Geben Sie das feste Pulver jeder Chemikalie in ein vorgewogenes konisches 50-ml-Röhrchen. Wiegen Sie jedes Röhrchen nach Zugabe des Pulvers und fügen Sie eine angemessene Menge Lösungsmittel hinzu, um die folgenden Konzentrationen zu erreichen. Bereiten Sie für einen Medienstapel die angegebene Mindestmenge vor. HINWEIS: Die folgenden Reagenzien sind gefährlich und sollten in Übereinstimmung mit den örtlichen Chemikaliensicherheitsrichtlinien gehandhabt werden. Achten Sie bei der Handhabung auf die richtige PSA und arbeiten Sie nur mit den festen Pulverformen dieser Chemikalien in einem chemischen Abzug, um ein Einatmen zu verhindern.<ol><li>Mindestens 0,05 ml Natriumselenit in Wasser bei 0,518 mg/ml, 0,5 ml Putrescin in Wasser bei 160 mg/ml, 0,165 ml Progesteron in 100% Ethanol bei 0,6 mg/ml (siehe Materialtabelle).</li>
			<li>Lagern Sie Lösungen bis zu 2 Jahre bei -20 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>In einer Biosicherheitswerkbank (BSC) fügen Sie Folgendes zu 58,035 ml DMEM-F12 hinzu.<ol><li>0,05 ml einer 0,518 mg/ml Natriumselenitlösung, 0,5 ml einer 160 mg/ml Putrescinlösung, 0,165 ml einer 0,6 mg/ml Progesteronlösung.</li>
			<li>Filter Sterilisieren Sie die obige Mischung mit einem 0,22-μm-Filter.</li>
		</ol></li>
		<li>Bereiten Sie immer noch in der BSC eine 100 mg/ml-Lösung von Apotransferrin vor.<ol><li>Fügen Sie 5 ml DMEM-F12 zu 500 mg Apotransferrin hinzu (siehe Materialtabelle). Den Behälter langsam wieder aufhängen und waschen, Blasen vermeiden.</li>
			<li>Nachdem Sie es mit 5 ml resuspendiert und so viel wie möglich entfernt haben, fügen Sie es der Selenit/Putrescin/Progesteron-Lösung hinzu. Nehmen Sie mehr von der vorherigen Lösung und waschen Sie die Apotransferrinflasche, um so viel wie möglich davon herauszuholen.</li>
		</ol></li>
		<li>Geben Sie 5 ml 7,5 % BSA-Fraktion V (siehe Materialtabelle) in die Lösung.</li>
		<li>Mischen und aliquotieren Sie 6,875 ml pro Röhrchen. Aliquote bis zu 1 Jahr bei -80 °C lagern.</li>
		<li>Wenn Sie die oben genannten N2-Aliquots zur Herstellung von N2B27-Medien verwenden, tauen Sie das gewünschte Aliquot auf und fügen Sie 3,125 ml einer 4 mg/ml-Insulinlösung (siehe Materialtabelle) zu den 6,875 N2 hinzu, um 10 ml 100x N2 zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie N2B27-Basalmedien vor.<ol><li>Tauen Sie N2- und B27-Ergänzungen einige Stunden oder über Nacht in einem 4 °C-Kühlschrank auf.</li>
		<li>Mischen Sie in einer BSC 484,5 ml DMEM-F12 und 484,5 ml neurobasales Medium (siehe Materialtabelle) in einer sterilen 1-l-Flasche.</li>
		<li>Fügen Sie dem Medium 10 ml B27 und 10 ml N2-Ergänzung hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml 55 mM Beta-Mercaptoethanol hinzu (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 10 ml 100x Glutamax hinzu. Mischen Sie kräftig, indem Sie die Flasche schwenken.</li>
		<li>Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen pro Aliquot (typischerweise 100 ml) und lagern Sie es bis zu 1 Jahr bei -80 °C. Nach dem Auftauen bei 4 °C bis zu 3 Wochen im Gebrauch lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie NBiL-Medien vor.<ol><li>Tauen Sie ein 100-ml-Aliquot von N2B27-Basalmedien bei -80 °C im 4 °C-Kühlschrank auf.</li>
		<li>In einer BSC wird LIF (siehe Materialtabelle) bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/l hinzugefügt.</li>
		<li>Fügen Sie CHIR99021 (3 μM endg.) und PD0325901 (1 μM endg.) hinzu (siehe Materialtabelle). Mit einer serologischen 50-ml-Pipette gut mischen. Bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie 0,2% ige Gelatinelösung vor.<ol><li>500 ml doppelt destilliertes H2O in eine 1-Liter-Glasflasche umfüllen.</li>
		<li>Messen Sie 1 g Gelatine ab (siehe Materialtabelle) und geben Sie sie in das Wasser. Mischen Sie, indem Sie die Flasche schütteln, bis sie sich weitgehend aufgelöst hat.</li>
		<li>Autoklavieren Sie die Gelatine-Wasser-Mischung bei 15 psi, 121 °C für 35 min. Nach dem Abkühlen mit einem 0,22-μm-Filter in einem BSC filtern. Bei 4 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschmedien vorbereiten.<ol><li>Mischen Sie in einem BSC 160 μl 7,5 % BSA pro 10 ml DMEM-F12.</li>
		<li>Skalieren Sie die oben genannten und bereiten Sie sie in großen Mengen für eine einfache zukünftige Verwendung vor (z. B. 8 ml 7,5 % BSA auf 500 ml DMEM-F12). Bei 4 °C lagern.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung von Reagenzien für die mPSC-Polytransfektion
HINWEIS: Die folgenden Werte gelten für eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte. Die Werte können entsprechend skaliert werden. Die Sequenzen aller DNA/Plasmide sind in der Zusatzdatei 1 detailliert beschrieben.
<ol><li>Berechnen Sie das Volumen der DNA-Lösung, die pro Behandlung benötigt wird.<ol><li>Bereiten Sie 500 ng DNA pro Well/Zustand vor.<ol><li>Wenn ein einzelnes Plasmid mit einer DNA-Lösung von 100 ng/μl transfiziert wird, bereiten Sie ein Röhrchen mit 5 μl DNA vor.</li>
			<li>Wenn zwei Plasmide mit jeweils 100 ng/μl transfiziert werden, bereiten Sie zwei Röhrchen mit jeweils 2,5 μl vor, eines für jedes Plasmid.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie in einer BSC Folgendes durch: Aliquotieren Sie für jede 500-ng-Transfektionsbehandlung (siehe Materialtabelle) 25 μl OptiMEM in ein 1,5-ml-Röhrchen.<ol><li>Skalieren Sie dies entsprechend - für das obige Beispiel bereiten Sie zwei Röhrchen mit jeweils 250 ng DNA (2,5 μl) und 12,5 μl OptiMEM vor.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie das erforderliche DNA-Volumen für diese Behandlung in das OptiMEM im Röhrchen.</li>
	<li>Stellen Sie für jedes Röhrchen mit 500 ng DNA und OptiMEM ein passendes Röhrchen mit weiteren 25 μl OptiMEM und 1 μl kationischem Transfektionsreagenz auf Lipidbasis her.<ol><li>Auch diese Werte müssen entsprechend skaliert werden. Bereiten Sie für das obige Beispiel zwei Röhrchen mit jeweils 12,5 μl OptiMEM und 0,5 μl Transfektionsreagenz vor. HINWEIS: Verwenden Sie beim Skalieren von Werten die Masse der hinzugefügten DNA, nicht das Volumen, das für diese DNA-Menge erforderlich ist. Reaktionen mit Transfektionsreagenz und DNA können skaliert werden (z. B. wenn 5 Wells mit derselben DNA transfiziert werden sollen). Lassen Sie die Verhältnisse der Reagenzien gleich, skalieren Sie jedoch entsprechend (z. B. 1000 ng DNA: 50 μl OptiMEM: 2 μl Transfektionsreagenz: 50 μl OptiMEM).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorbereitung von mPS-Zellen für die Transfektion
HINWEIS: Bereiten Sie für die umgekehrte Transfektion das Kulturgefäß vor und passieren Sie die mPSCs direkt, bevor Sie die Transfektionsreagenzien hinzufügen. Für die Vorwärtstransfektion die Zellen 12-18 Stunden vor der Transfektion durchlassen und plattieren, damit die Zellen an der Platte haften können.
<ol><li>Bereiten Sie ein mit 0,2 % gelatinebeschichtetes Zellkulturgefäß vor.<ol><li>Planen Sie die Anzahl der für die Transfektion benötigten Wells (ein Well einer 24-Well-Platte pro Behandlung/Gruppe).</li>
		<li>Geben Sie 200 μl der 0,2%igen Gelatinelösung in jede der gewünschten Vertiefungen in der 24-Well-Platte.</li>
		<li>Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen, und stellen Sie sicher, dass sie den gesamten Boden der Vertiefung bedeckt.</li>
		<li>Lassen Sie die Vertiefungen mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur beschichten.</li>
		<li>Entfernen Sie mit einem Vakuumsauger vorsichtig alle Gelatinereste aus den Vertiefungen (kippen Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die gesamte Flüssigkeit entfernt wird, ohne die Gelatineschicht abzukratzen).</li>
		<li>Geben Sie 0,5 ml NBiL-Medien (Schritt 1.3) in jede Vertiefung und lassen Sie die Platte zum Vorwärmen in einem Gewebekultur-Inkubator.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage mPSCs.<ol><li>Aliquotieren Sie 30 ml Waschmedium (Schritt 1.5) in ein konisches 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Aspirieren Sie die alten Medien aus der Gewebekulturschale von mES-Zellen. HINWEIS: Mehrere Aspirationstechniken sind zulässig. Unabhängig davon, welche Technik gewählt wird, stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht über längere Zeiträume (maximal ca. 30 s) trocken bleiben.</li>
		<li>Fügen Sie die erforderliche Menge des handelsüblichen Zellentfesselungsmediums hinzu (1,5 ml für eine 10-cm-Schale, entsprechend skalieren, siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Warten Sie 3-5 Minuten, bevor Sie 15-20 Mal mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren, um eine Einzelzellensuspension zu erhalten. Betrachten Sie Zellen unter einem Mikroskop, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen im Trennmedium in das 50-ml-Röhrchen mit dem Waschmedium.</li>
		<li>Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie das Waschmedium an und stellen Sie sicher, dass keine Restflüssigkeit im Rohr verbleibt.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in einer kleinen Menge Waschmedium (~300 μl). Zählen Sie die Zellsuspension mit einem Hämozytometer, um die Zelldichte zu erhalten.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Rückwärtstransfektion von mPS-Zellen
<ol><li>Bereiten Sie Polytransfektionsreagenzien gemäß Schritt 2 vor.</li>
	<li>Bereiten Sie das Zellkulturgefäß und die Passage-mPSCs gemäß Schritt 3 vor.</li>
	<li>Aliquotieren Sie 200 μl NBiL-Medien auf 1,5 ml-Röhrchen, eines für jede Behandlung.</li>
	<li>Geben Sie 26 μl des OptiMEM:Transfektionsreagenzgemisches in das DNA:OptiMEM-Gemisch. Mischen Sie die Reagenzien schnell und kräftig, indem Sie sie etwa 10 Mal pipettieren. Lassen Sie die Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie basierend auf der Zelldichte das erforderliche Zellvolumen von der 300-μl-Zellsuspension auf die 200-μl-NBiL-Röhrchen, um 25.000 Zellen pro Röhrchen zu erhalten.</li>
	<li>Nach 5 Minuten Inkubation des Lipofectamine 2000 (L2K, Transfektionsreagenz) und der DNA-Mischung in das 1,5-ml-Zellröhrchen geben und durch Pipettieren gut mischen. Lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem Reagenz inkubieren.</li>
	<li>Bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Pipettieren Sie die Flüssigkeit heraus und lassen Sie ca. 50 μl übrig.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 100 μl NBiL-Medien. Übertragen Sie die Zellen auf die Platte und legen Sie die Platte in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium 24 h später mit frischen NBiL-Medien.</li>
</ol>5. Vorwärtstransfektion von mPS-Zellen
<ol><li>12-18 h vor der Transfektion das Zellkulturgefäß und die Passage-mPSCs gemäß Schritt 3 vorbereiten.</li>
	<li>Übertragen Sie basierend auf der Zelldichte das erforderliche Zellvolumen aus der 300-μl-Zellmischung auf 25.000 Zellen pro Well. Legen Sie die Platte in den Inkubator.</li>
	<li>1 h vor der Transfektion das Medium aus allen Wells absaugen und durch 0,5 ml NBiL-Medium ersetzen. Legen Sie die Platte in den Inkubator.</li>
	<li>Bereiten Sie zum Zeitpunkt der Transfektion mPSC-Polytransfektionsreagenzien gemäß Schritt 2 vor.</li>
	<li>Geben Sie 26 μl des OptiMEM:Transfektionsreagenzgemisches in das DNA:OptiMEM-Gemisch. Mischen Sie die Reagenzien schnell und kräftig, indem Sie sie etwa 10 Mal pipettieren. Lassen Sie die kombinierte Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Geben Sie die kombinierte Mischung tropfenweise in die Vertiefungen. Legen Sie die Platte in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium 24 h später.</li>
</ol>6. Durchflusszytometrie
<ol><li>Aspirieren Sie das Medium 48 Stunden nach der Transfektion aus der transfizierten 24-Well-Platte.</li>
	<li>200 μl Trypsin in jede Vertiefung geben, schwenken und 30 s bei 37 °C inkubieren. Klopfen Sie auf die Seiten der Platte und fügen Sie 200 μl eiskalten FACS-Puffer (2% FBS in PBS) hinzu.</li>
	<li>Öffnen und beschriften Sie eine 96-Well-Platte mit V-Boden, beginnend mit A1. Mischen Sie den Inhalt jeder Vertiefung auf der transfizierten Platte, um Zellen zu entfernen, und stellen Sie Einzelzelllösungen mit einer P200-Pipette her. Übertragen Sie 200 μl aus jeder Vertiefung in die entsprechende Vertiefung auf der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Geben Sie 15 ml FACS-Puffer in ein 50-ml-Reagenzreservoir. Die Platte bei 300 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die 96-Well-Platte mit einer schnellen und gleichmäßigen Bewegung in die Spüle umdrehen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Pellets auf der 96-Well-Platte in 150 μl FACS-Puffer aus dem Reagenzreservoir zu resuspendieren. Wiederholen Sie die Schritte 6.4-6.5 zweimal. Legen Sie die 96-Well-Platte in eine mit Eis gefüllte Box, die vor Licht geschützt ist.</li>
	<li>Führen Sie die Proben durch ein Durchflusszytometer, um die Populationsverteilungen der fluoreszierenden Reporter zu erhalten.<ol><li>Stellen Sie sicher, dass das Zytometer in Bezug auf Laser- und Filterkombinationen für das durchzuführende Experiment geeignet ist (verwenden Sie z. B. keinen Infrarot-Reporter, wenn es nicht möglich ist, im dunkelroten Spektrum anzuregen oder zu detektieren).</li>
		<li>Fügen Sie zusätzliche Proben für Standardisierungsperlen hinzu, um eine MEFL-Konvertierung der Daten während der Analyse zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass genügend Zellen pro Probe für eine angemessene statistische Analyse gesammelt werden9.</li>
	</ol></li>
	<li>Konvertieren Sie Fluoreszenzeinheiten aus den Rohzytometerdateien und analysieren Sie die Daten mit einer von mehreren Methoden, wie z. B. Python- oder MATLAB-basierten Pipelines oder kommerziell erhältlicher Software 9,13.</li>
</ol>

Vergleichende Analyse von Vorwärts- und Rückwärtstransfektionsmethoden an mPSCs

<ol><li>Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-aware+synthetic+biology+by+controller+design%3A+Engineering+the+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell.</a> Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).</li>
<li>FAU, K. T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+protocols+for+mouse+embryonic+stem+cell+culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing.</a> PLoS One. 8 (12), 81156(2013).</li>
<li>Morgani, S., Nichols, J., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+pluripotency%3A+in+vitro+adaptations+of+a+continuum+of+in+vivo+states%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states.</a> BMC Developmental Biology. 17 (1), (2017).</li>
<li>Mulas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+propagation+and+manipulation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for propagation and manipulation of mouse embryonic stem cells.</a> Development. 146 (6), Cambridge, England. 173146(2019).</li>
<li>Tamm, C., Kadekar, S., Pijuan-Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+transfection+of+mouse+embryonic+stem+cells+using+non-viral+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient transfection of mouse embryonic stem cells using non-viral reagents.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 584-591 (2016).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> PeerJ. 9, 11165(2021).</li>
<li>Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bpoly-transfection%26%2334%3B+method+for+rapid%2C+one-pot+characterization+and+optimization+of+genetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A &#34;poly-transfection&#34; method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems.</a> Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).</li>
<li>Jones, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endoribonuclease-based+feedforward+controller+for+decoupling+resource-limited+genetic+modules+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).</li>
<li>Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+development+of+cell+state+identification+circuits+with+poly-transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid development of cell state identification circuits with poly-transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (192), e64793(2023).</li>
<li>Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+extract+based+optimization+of+biomolecular+circuits+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics.</a> Lab on a Chip. 17 (18), 3037-3042 (2017).</li>
<li>Teague, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoflow%3A+A+python+toolbox+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cytoflow: A python toolbox for flow cytometry.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PLoS One. 5 (5), 0010611(2010).</li>
</ol>

Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Ein Hauptgrund für die weit verbreitete Einführung von Transfektionsprotokollen ist ihre Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit; Diese Protokolle erfordern jedoch eine Optimierung in experimentellen Kontexten. Nicht erwähnt sind die Standardtests, die erforderlich sind, wenn zum ersten Mal versucht wird, eine neue Zelllinie zu transfizieren. Erstens ist die Wahl des Transfektionsreagenzes entscheidend, da kommerziell erhältliche Reagenzien keine Einheitsgröße sind und in der Effizienz der NA-Verabreichungsfähigkeit je nac...

Die Verabreichung von DNA und RNA in Säugetierzellen dient als Kernpfeiler der biomedizinischen Forschung1. Eine gängige Methode zur Einführung exogener Nukleinsäuren (NA) in Säugetierzellen ist die transiente Transfektion 2,3. Diese Technik beruht auf dem Mischen von NA mit kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzien, die in der Lage sind, sie in die Empfängerzellen zu bringen. Typischerweise wird NA durch Vorwärtstransfektion abgegeben, bei der Zellen, die an einer zweidimensionalen Oberfläche haften, den Transfektionskomplex erhalten. Während die Vorwärtstransfektion für die gängigsten etablierten Zelllinien robust ist und die Protokolle gut veröffentlicht sind, lassen sich Nischenzelltypen mit Nicht-Monolayer-Morphologien nicht leicht transfizieren, was die Menge an NA, die abgegeben werden kann, und die Anzahl der Zellen, die sie erhalten, begrenzt.
Pluripotente Stammzellen (PSCs) dienen als attraktives Modell für das Verständnis der Entwicklung und als Werkzeug für die regenerative Medizin, da sie sich unbegrenzt teilen und jeden Körperzelltyp produzieren können. Bei Maus-PSCs (mPSCs) behalten routinemäßige In-vitro-Kulturbedingungen mit 2 Inhibitoren und LIF (2i/LIF) eine kuppelartige Koloniemorphologie bei, die die Anzahl der Zellen, die einer Vorwärtstransfektion ausgesetzt sind, direkt begrenzt 4,5,6. Um dies zu beheben, kann eine umgekehrte Transfektion durchgeführt werden: Zellen werden in eine Schale gegeben, die Medien und Transfektionsreagenz enthält, anstatt Transfektionsreagenz zu adhärenten Zellenhinzuzufügen 7. Dies erhöht zwar die Anzahl der Zellen, die dem Reagenz ausgesetzt sind, erfordert aber auch, dass die Zellen gleichzeitig durchgelassen und transfiziert werden.
Über einfache Einzel-NA-Transfektionen hinaus zielen Forscher oft darauf ab, mehrere NA-Konstrukte in vitro in eine Zellpopulation einzubringen. Dies wird typischerweise durch eine Co-Transfektion erreicht, bei der die NAs in einem bestimmten Verhältnis (1:1, 9:1 usw.) gemischt und dann mit dem gewählten Transfektionsreagenz8 kombiniert werden. Dies ergibt eine Mischung aus NAs und Reagenzien, die das ursprüngliche Verhältnis von NAs zueinander beibehält - während die Zellen in der Behandlung unterschiedliche Mengen dieser Mischung erhalten können, erhalten sie alle das gleiche Verhältnis9. Dies ist zwar von Vorteil, wenn das gewünschte Verhältnis der Teile bekannt ist, aber die Bestimmung dieses Verhältnisses im Voraus kann arbeitsintensiv sein, da jedes Verhältnis eine andere Bedingung darstellt. Eine Alternative besteht darin, eine "Polytransfektion" durchzuführen, bei der einzelne NAs unabhängig voneinander mit dem Transfektionsreagenz gemischt werden9. Durch die Kombination von Transfektionskomplexen, die einzelne NAs enthalten (anstatt NAs zu kombinieren, bevor die Komplexe erstellt werden), können Forscher eine breite Palette von NA-Stöchiometrien in einem einzigen Transfektionsexperiment untersuchen9. Dies ist besonders wertvoll in Fällen, in denen erwartet wird, dass die Produkte mehrerer NAs miteinander interagieren, wie z. B. bei induzierbaren Transkriptionssystemen oder Systemen mit in 1,10,11 eingebauter Rückkopplung. Um dies effektiv zu tun, ist jedoch eine hohe Transfektionseffizienz erforderlich. In der Tat nimmt mit zunehmender Anzahl einzigartiger transfizierter NAs die Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Zelle alle gewünschten NAs erhält, exponentiell ab 9,12.
Der folgende Bericht beschreibt ein reverses Transfektionsprotokoll für mPSCs unter Verwendung eines kationischen Transfektionsreagenzes auf Lipidbasis, bei dem die Zellen maximal 5 Minuten lang dem Reagenz-NA-Mix ausgesetzt werden, um die Lebensfähigkeit zu maximieren und die Zeit außerhalb typischer Kulturbedingungen zu minimieren. Der Vergleich dieses Protokolls mit der Standard-Vorwärtstransfektion dieser Zellen zeigt eine höhere Transfektionseffizienz und eine Erhöhung der Gesamtzahl der überlebenden transfizierten Zellen. Durch die Kombination dieser umgekehrten Transfektion mit einer Drei-Plasmid-Polytransfektion unter Einbeziehung einfacher fluoreszierender Reporter wird ein erweitertes Potenzial für das Screening von NA-Verhältnissen mit hoher Transfektionseffizienz demonstriert.

<table><tbody><tr><td>Accutase&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Apotransferrin&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>T1147-500MG</td><td></td></tr><tr><td>B27 Ergänzung&nbsp;</td><td>ThermoFisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Beta-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21985023</tr><tr><td>BSA-Fraktion V (7,5%)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>SML1046-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>MilliporeSigma</td><td>D6421-24X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Standardisierungskügelchen für Durchflusszytometrie</td><td>Spherotech</td><td>URCP-38-2K</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung&nbsp;</td><td>ThermoFisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12585-0014</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Neurobasale Medien</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>OptiMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>PZ0162-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8783</td><td>Chemische Gefahr - beachten Sie die örtlichen Sicherheitsrichtlinien, stellen Sie sicher, dass die richtige PSA getragen wird, und arbeiten Sie mit der festen Pulverform nur in einem chemischen Abzug</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6780</td><td>Chemische Gefahr - beachten Sie die örtlichen Sicherheitsrichtlinien, stellen Sie sicher, dass die richtige PSA getragen wird, und arbeiten Sie mit der festen Pulverform nur in einem chemischen Abzug.</td></tr><tr><td>Rekombinante mLIF&nbsp;</td><td>BioTechne</td><td>8878-LF-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5261-25G</td><td>Chemische Gefahr - beachten Sie die örtlichen Sicherheitsrichtlinien, stellen Sie sicher, dass die richtige PSA getragen wird, und arbeiten Sie mit der festen Pulverform nur in einem chemischen Abzug</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr></tbody></table>

eine optimierte reverse-poly-transfektionstechnik auf basis embryonaler stammzellen der maus zur schnellen erforschung von nukleinsäureverhältnissen

An Optimized Mouse Embryonic Stem Cell Based Reverse Poly-Transfection Technique for Rapid Exploration of Nucleic Acid Ratios

Aufgrund ihrer relativen Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit ist die transiente Transfektion von Säugetierzelllinien mit Nukleinsäuren zu einer tragenden Säule in der biomedizinischen Forschung geworden. Während die meisten weit verbreiteten Zelllinien robuste Protokolle für die Transfektion in adhärenten zweidimensionalen Kulturen haben, lassen sich diese Protokolle oft nicht gut auf weniger untersuchte Linien oder solche mit atypischen, schwer zu transfizierenden Morphologien übertragen. Unter Verwendung von pluripotenten Stammzellen der Maus, die in 2i/LIF-Medien, einem weit verbreiteten Kulturmodell für die regenerative Medizin, gezüchtet wurden, skizziert diese Methode ein optimiertes, schnelles umgekehrtes Transfektionsprotokoll, das eine höhere Transfektionseffizienz erreichen kann. Unter Nutzung dieses Protokolls wird eine Polytransfektion mit drei Plasmiden durchgeführt, wobei die überdurchschnittlich hohe Effizienz bei der Plasmidabgabe genutzt wird, um einen erweiterten Bereich der Plasmidstöchiometrie zu untersuchen. Dieses umgekehrte Polytransfektionsprotokoll ermöglicht eine experimentelle Eintopfmethode, die es den Anwendern ermöglicht, die Plasmidverhältnisse in einem einzigen Well zu optimieren, anstatt über mehrere Co-Transfektionen hinweg. Durch die schnelle Erforschung der Auswirkungen der DNA-Stöchiometrie auf die Gesamtfunktion der gelieferten genetischen Schaltkreise minimiert dieses Protokoll den Zeit- und Kostenaufwand für die Transfektion embryonaler Stammzellen.

Sowohl Vorwärts- als auch Rückwärtstransfektionen beruhen auf der Wechselwirkung zwischen der Zellmembran und den eingehenden Transfektionsreagenz-DNA-Komplexen, die die Abgabe von NA an die Empfängerzellen ermöglichen. Wo sich diese Techniken unterscheiden, ist der Zustand der Zelle bei der Abgabe - während die DNA in der Regel bei der traditionellen Vorwärtstransfektion an adhärente Zellmonoschichten abgegeben wird, beruht die umgekehrte Transfektion stattdessen darauf, dass der Reagenz-DNA-Komplex in einer Einzelzells...

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur umgekehrten Polytransfektion von embryonalen Stammzellen der Maus während der Kultur mit 2i- und LIF-Medien. Diese Methode bietet eine höhere Durchführbarkeit und Effizienz als herkömmliche Vorwärtstransfektionsprotokolle und ermöglicht gleichzeitig eine Ein-Topf-Optimierung der Plasmidverhältnisse.

Eine optimierte Reverse-Poly-Transfektionstechnik auf Basis embryonaler Stammzellen der Maus zur schnellen Erforschung von Nukleinsäureverhältnissen

Due to its relative simplicity and ease of use, transient transfection of mammalian cell lines with nucleic acids has become a mainstay in biomedical ...

Unsere Arbeit konzentriert sich im Allgemeinen auf die Verwendung synthetischer genetischer Geräte zur Manipulation des Schicksals und Verhaltens von Stammzellen. Durch die Kontrolle zellulärer Zustände wollen wir die Entwicklung von Zelltherapien der nächsten Generation vorantreiben. In jüngster Zeit wurde ein tieferes Verständnis des Zusammenhangs zwischen der Dosierung eines schicksalsbestimmenden Gens und der Abstammung der Zelle etabliert.Erleichtert wurde dies durch die Entwicklung genetischer Controller, die in der Lage sind, ein bestimmtes Gen präzise zu titrieren. Klassische molekularbiologische Techniken wie Transfektion oder lentivirale Transduktion zur einfachen Genüberexpression werden immer eine tragende Säule sein. Unser Fachgebiet hat jedoch kürzlich synthetische Geräte eingeführt, die lineares und nichtlineares Feedback enthalten, um komplexere Ergebnisse aus der gelieferten DNA zu erhalten.Die Gendosis spielt eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung des Ergebnisses der Genexpression. Bei der Verabreichung mehrerer exogener Gene ist ein wichtiger experimenteller Faktor, wie viel von jedem Gen das optimale oder gewünschte Ergebnis liefert. Unser Protokoll ermöglicht es Forschern, in einer einzigen Behandlung schnell über Dosierungen hinweg zu scannen und nach dem gewünschten Verhältnis von DNA-Geräten zu suchen.

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Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Reporter-Assay schnell zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Selbst-Erneuerung zu regulieren.

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die Capture Hi-C-Methode, die verwendet wird, um die 3D-Organisation von megabasierten Zielgenomregionen mit hoher Auflösung zu charakterisieren, einschließlich der Grenzen topologisch assoziierender Domänen (TADs) und langreichweitiger Chromatininteraktionen zwischen regulatorischen und anderen DNA-Sequenzelementen.

Entschlüsselung der hochauflösenden 3D-Chromatinorganisation über Capture Hi-C

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Komplexe genetische Schaltkreise sind zeitaufwändig zu entwerfen, zu testen und zu optimieren. Um diesen Prozess zu erleichtern, werden Säugetierzellen so transfiziert, dass mehrere Stöchiometrien von Schaltungskomponenten in einem einzigen Well getestet werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die experimentelle Planung, Transfektion und Datenanalyse.

Schnelle Entwicklung von Schaltkreisen zur Identifizierung von Zellzuständen mit Poly-Transfektion

Lernen Sie die optimierte Reverse-Poly-Transfektion für embryonale Maus-Stammzellen in 2i- und LIF-Medien. Diese Methode ermöglicht höhere Zellviabilität und Transfektionseffizienz für die schnelle Optimierung von Plasmidverhältnissen.

Eine optimierte Reverse-Poly-Transfektionstechnik auf Basis embryonaler Stammzellen der Maus zur schnellen Erforschung von Nukleinsäureverhältnissen (Video) | JoVE Journal

Eine optimierte Reverse-Poly-Transfektionstechnik auf Basis embryonaler Stammzellen der Maus zur schnellen Erforschung von Nukleinsäureverhältnissen

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