Name: Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Aufreinigung von Hepatozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels FACS-Sortierung ohne genetische Modifikation. Diese Methode erreicht 97% Reinheit und verbesserte Zellviabilität für regenerative Medizin.

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Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie mit der Fördernummer [23390072] unterstützt.

In dieser Studie wurden kommerziell hergestellte humane iPS-Zellen (Stamm 253G1) verwendet (siehe Materialtabelle).
1. Erhaltung humaner iPS-Zellen
<ol><li>Humane iPS-Zellen werden unter feederfreien Bedingungen im AK02-Medium auf Kulturschalen aufbewahrt, die mit 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 beschichtet sind (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>2. Leberdifferenzierung von humanen iPS-Zellen in 2D-Kulturen
HINWEIS: In Abbildung 1A finden Sie den Tagesablauf der Leberdifferenzierung. Verwenden Sie während des gesamten Prozesses 6-Well-Kulturplatten und geben Sie 2 ml des dafür vorgesehenen Wasch- oder Kulturmediums in jede Vertiefung. Halten Sie den Zellkulturzustand bei 100 % Luftfeuchtigkeit, 5 % CO2 und 20 % O2 bei 37 °C aufrecht.
<ol><li>Jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml Basalmembranmatrix (verdünnt 1/25 in PBS ()) beschichten und 1 h bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Humane iPS-Zellen werden mit einer Dichte von 20.000-30.000 Zellen/cm² unter Verwendung von AK02N-Medium, das mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632) ergänzt wird, in die beschichtete Schale gebracht (siehe Materialtabelle). Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag ohne Y-27632 und kultivieren Sie es für weitere 2 Tage.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit RPMI-1640 Medium. Initiieren Sie die Endodermdifferenzierung, indem Sie das Medium durch RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% B27 Insulin + 1% Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin) ersetzen, ergänzt mit 3-6 μM CHIR-99021 und 100 ng/ml Activin A für 24 h (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium durch RPMI-B27-Glu, ergänzt mit 50 ng/mL Activin A für 24 h.</li>
	<li>Um die Differenzierung der hepatischen Vorläuferzellen zu induzieren, ersetzen Sie das Medium 5 Tage lang durch RPMI-B27-Glu, das mit 1 % Dimethylsulfoxid (DMSO) ergänzt ist.</li>
	<li>Um die Hepatozytenreifung zu fördern, wechseln Sie zu Hepatozyten-Reifungsmedium: L-15-Medium von Leibovitz mit 10 μM Hydrocortison-21-hemisuccinat, 8,3 % Tryptosephosphat-Brühe, 100 nM Dexamethason (DEX), 50 μg/ml Natrium-L-Ascorbat, 0,58 % Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 8,3 % fötales Rinderserum (FBS), 2 mM Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin und 100 nM N-Hexanosäure-Try-Ile-(6)-aminohexansäureamid (Dihexa) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage für 20 Tage. Sortieren Sie die Zellen etwa 27 Tage nach Beginn der Differenzierung.</li>
</ol>3. Zellvorbereitung für die Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen iPS-Zellen gewonnen wurden
<ol><li>Waschen Sie hepatische differenzierte Zellen mit 2 ml PBS (-) pro Well.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Enzymlösung pro Vertiefung hinzu, die 0,1 % Kollagenase, 0,083 % Trypsin, 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632), 20 μM Ciclosporin A und 50 μg/ml Natrium-L-Ascorbat in Ads-Puffer (116 mM NaCl, 12,5 mM NaH2PO4, 20 mM HEPES, 5,4 mM KCl, 5,6 mM Glukose und 0,8 mM MgSO4; pH 7,35) enthält (siehe Materialtabelle). Die Zellen werden von den Platten gelöst, indem sie sie ca. 2 h lang bei 37 °C horizontal drehen.</li>
	<li>Nachdem Sie unter einem Mikroskop bestätigt haben, dass die Zellen abgetrennt und gerundet sind, dispergieren Sie sie durch vorsichtiges Pipettieren in einzelne Zellen und sammeln Sie sie in einem 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Zellen bei 200 x g für 5 min bei 18 °C zentrifugieren, um sie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einem Aspirator.</li>
	<li>Färben Sie die Mitochondrien der Zellen, indem Sie sie in 5 ml Hepatozyten-Reifungsmedium dispergieren, das 100 nM TMRM (Tetramethylrhodamin, Mehlester) enthält (siehe Materialtabelle). 30 min bei 37 °C inkubieren und dabei vor Licht schützen, indem in Alufolie eingewickelt werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 18 °C, um sie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen mit 1-5 ml kaltem Ads-Puffer mit 2% FBS.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellzahl mit einer 0,4%igen Trypanblau-Lösung und einer Zellzählplatte.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C, um sie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Verdünnen Sie einen Anti-ALCAM-Antikörper (Primärantikörper, siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:50 in Ads-Puffer und fügen Sie 100 μl des verdünnten Antikörpers pro 106 Zellen hinzu. Färben Sie die Zellen 50 Minuten lang auf Eis. Bereiten Sie Zellen vor, die nicht mit dem primären Antikörper als Negativkontrolle gefärbt sind.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem Ads-Puffer mit 2% FBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie ein Alexa Fluor 488 Esel-Anti-Ziegen-IgG (Sekundärantikörper, siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:100 in Ads-Puffer und fügen Sie 100 μl des verdünnten Antikörpers pro 106 Zellen hinzu. Färben Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis. Färben Sie Zellen, die nicht mit dem Primärantikörper gefärbt wurden, mit dem Sekundärantikörper.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem Ads-Puffer mit 2% FBS.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in Ads-Puffer und filtern Sie sie durch ein Schnappkappen-Zellsieb (35 μm Netz), kurz bevor Sie nach FACS sortieren, um große Zellklumpen und Ablagerungen zu entfernen.</li>
</ol>4. FACS-Analysen und Sortierung von aus humanen iPS-Zellen gewonnenen Hepatozyten
<ol><li>Richten Sie die FACS-Maschine für die Zellensortierung gemäß den Anweisungen des Herstellers ein (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Verwenden Sie eine Düsengröße von 85 μm oder 100 μm und einen ND-Filter von 2,0 für Hepatozyten. Verwenden Sie den FITC-Kanal zum Nachweis von Alexa Flour 488 für ALCAM und den PE-Kanal zum Nachweis von TMRM-Fluoreszenz für Mitochondrien.</li>
	<li>Passen Sie die Spannungen FSC (Vorwärtsstreuung) und SSC (Seitenstreuung) an, um die Zellpopulation richtig zu visualisieren.</li>
	<li>Passen Sie die Spannungen der FITC- und PE-Leuchtstoffkanäle an. Beginnen Sie mit unbeschrifteten Zellen, und zentrieren Sie die Zellpopulation am unteren Rand jedes Kanaldiagramms. Stellen Sie sicher, dass die beschrifteten Zellen im Diagramm richtig positioniert sind.</li>
	<li>Verwenden Sie eine gängige Gating-Strategie, um Dubletten zu eliminieren: Gate die wichtigsten FSC-A vs. SSC-A-Population (Abbildung 2A), gefolgt von FSC-H vs. -W und dann SSC-H vs. -W (Abbildung 2B,C).</li>
	<li>Gate der TMRMhi- und ALCAM+-Population (P2 in Abbildung 2E), um Hepatozyten zu sortieren. Gate der TMRMhi- und ALCAM-Population (P1 in Abbildung 2E), um Nicht-Hepatozyten zu sortieren. Sammeln Sie sortierte Hepatozyten und Nicht-Hepatozyten in 15-ml-Entnahmeröhrchen, die Hepatozyten-Reifungsmedium enthalten.</li>
	<li>Das Sammelröhrchen mit den sortierten Zellen bei 200 x g für 5 min bei 18 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in Hepatozyten-Reifungsmedium.</li>
	<li>Aussaat der Zellen auf Mitomycin C-behandelten embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) oder gelartiger Basalmembranmatrix mit Hepatozyten-Reifungsmedium, ergänzt mit 10 μM Y-27632 und 20 nM Ciclosporin A. Kulturieren Sie die Zellen in einem 37 °CCO 2 -Inkubator für 5 Tage.</li>
</ol>5. Immunzytochemie zum Nachweis von Hepatozyten, die aus humanen iPS-Zellen gewonnen wurden
<ol><li>Waschen Sie die kultivierten Zellen nach der Sortierung mit PBS (-) 5 Tage lang.</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit TBS-T-Puffer (1x TBS mit 1% Tween 20), um das Paraformaldehyd zu entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 verdünntem TBS-T-Puffer für 5 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit TBS-T-Puffer, um Triton X-100 zu entfernen.</li>
	<li>Die handelsübliche Blockierungslösung (siehe Materialtabelle) für 30 min bei Raumtemperatur in die Zellen geben.</li>
	<li>Primäre Antikörper gegen Albumin (Hepatozytenmarker) und humanes nukleäres Antigen (hNA, siehe Materialtabelle) zugeben, verdünnt 1:50 in Blockierungslösung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen zweimal mit TBS-T-Puffer.</li>
	<li>Sekundärantikörper hinzufügen: Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-IgG und Alexa Fluor 546 Esel-Anti-Maus-IgG, 1:100 in Blockierungslösung verdünnt (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen zweimal mit TBS-T-Puffer.</li>
	<li>Bewerten Sie die Reinheit von Hepatozyten, indem Sie albuminpositive und hNA-positive Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop zählen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Albumin-positiven Zellen pro hNA-positiver Zelle sowohl für die P1- als auch für die P2-Population.</li>
</ol>

Aufreinigung von humanen iPSC-abgeleiteten Hepatozyten durch mitochondriale ALCAM-Sortierung

<ol><li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+pluripotent+stem+cells+correlates+to+the+level+of+CHD7%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7.</a> Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).</li>
<li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3%CE%B2+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li>
<li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+serendipity+and+reproducibility%3A+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li>
<li>Chen, C. X. -Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quality+control+workflow+to+evaluate+the+reproducibility+and+differentiation+potential+of+human+iPSCs+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+originating+from+induced+pluripotent+stem+cells+and+methods+for+their+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).</li>
<li>Nori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+issues+of+iPSC-based+cell+therapy+in+a+spinal+cord+injury+model%3A+oncogenic+transformation+with+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).</li>
<li>Hentze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%3A+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Hidaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chamber-specific+differentiation+of+Nkx2.5-positive+cardiac+precursor+cells+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells.</a> The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).</li>
<li>Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+induces+differentiation+of+ANP-EGFP+expressing+embryonic+stem+cells+towards+a+pacemaker+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype.</a> The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).</li>
<li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li>
<li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+high-functioning+human+iPS+cell-derived+hepatocyte-like+cells+for+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research.</a> Biomaterials. 161, 24-32 (2018).</li>
<li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature methods. 7, 61-66 (2009).</li>
<li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22JMA+Journal%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+mitochondrial+activity+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis.</a> Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).</li>
<li>Swart, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule+%28CD166%2FALCAM%29%3A+Developmental+and+mechanistic+aspects+of+cell+clustering+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration.</a> European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).</li>
<li>Kamiya, A., Inagaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell+systems+in+liver+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration.</a> Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).</li>
<li>Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+vitro+expansion+system+for+generation+of+human+ips+cell-derived+hepatic+progenitor-like+cells+exhibiting+a+bipotent+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential.</a> PLOS One. 8 (7), e67541(2013).</li>
<li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+a+surface+marker+for+early+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes.</a> Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Aufgrund ihrer Funktionen im Nährstoffstoffwechsel und in der Entgiftung besitzen Hepatozyten im Vergleich zu anderen Zelltypen eine relativ große Anzahl an Mitochondrien15. ALCAM ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie und spielt eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration. Es wird in verschiedenen Zelltypen exprimiert, darunter hepatische, epitheliale, lymphozytäre, myeloische, Fibroblasten- und neuronale Zellen16. Durch die Verwendung einer Kombination aus der...

Embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen (ES bzw. iPS) gelten als vielversprechende Zellquellen für regenerative Therapien. Die Effizienz der Differenzierung dieser Zellen in spezifische Zielzelltypen kann jedoch variieren, selbst wenn die gleiche Zelllinie, das gleiche Protokoll und der gleiche Experimentator verwendetwerden 1,2,3,4. Diese Variabilität kann auf die hohe Empfindlichkeit menschlicher ES/iPS-Zellen gegenüber ihrer Umgebung zurückgeführt werden. Daher ist es derzeit schwierig, konsistent reine Zielzellen zu gewinnen. Um eine hochsichere regenerative Medizin zu erreichen, ist es von entscheidender Bedeutung, proliferative Zellen und undifferenzierte Stammzellen in therapeutischen Zellen zu eliminieren, und eine fortschrittliche Reinigungstechnologie für Zielzellen ist unerlässlich 5,6,7.
Ein Zellsortierer ist ein Gerät, das einzelne Zellen sofort analysiert und lebende Zellen von Interesse basierend auf den Fluoreszenzsignalstärken sortiert und damit eine vielversprechende Lösung bietet. Dies kann durch die Antikörperfärbung von zelltypspezifischen Oberflächenmarkern oder durch die Verwendung zelltypspezifischer Reportergenexpressionen erreicht werden. Unter Verwendung dieser Technik gibt es mehrere Berichte über Methoden zur Reinigung von aus pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten 8,9,10 und Hepatozyten11,12. Hattori et al. entwickelten ein innovatives mitochondriales Aufreinigungsverfahren unter Verwendung eines Zellsortierers13. Unter Ausnutzung der Tatsache, dass Kardiomyozyten durch mitochondriale Aktivität einen hohen Energiebedarf haben, kann die Färbung der Zellen mit dem lebenden Mitochondrien-indikativen Farbstoff TMRM (Tetramethylrhodaminmethylester) zur Markierung und hochreinen Kardiomyozyten mittels FACS aus humanen ES-Zell-abgeleiteten Embryoidkörpern mit verschiedenen Zelltypen verwendet werden. Das Fehlen von Tumorigenität wurde durch Teratombildungsassays mit den gereinigten Kardiomyozyten bestätigt. Darüber hinaus entdeckten Yamashita et al. unerwartet eine Methode zur Reinigung von Hepatozyten aus humanen ES-Zell-abgeleiteten Embryoidkörpern durch Isolierung von Fraktionen mit hoher mitochondrialer Aktivität und ALCAM-positiver Expression14. Die Begründung für diese Methode ist, dass Hepatozyten aufgrund ihres hohen Verbrauchs an ATP für den Nährstoffstoffwechsel und die Entgiftung auch eine relativ hohe Anzahl von Mitochondrien aufweisen15, und Hepatozyten exprimieren ALCAM, ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, das eine Rolle bei der Zelladhäsion und -migration spielt16.
Frühere hochaufreinigende Methoden für aus pluripotenten Stammzellen gewonnene Hepatozyten erforderten genetische Modifikationen, und nicht-genetische Aufreinigungsmethoden wiesen eine geringe Effizienz auf17. Die mitochondriale nicht-genetische Methode zeichnet sich dadurch aus, dass sie eine hohe Reinheit erreicht. Wenn hepatische Vorläuferzellen benötigt werden, können CD133- und CD13- oder Dlk1-basierte Methoden18,19 gewählt werden. Obwohl die Genauigkeit der Genom-Editing-Technologie fortgeschritten ist, kann das potenzielle Risiko unvorhergesehener genomischer Veränderungen (z. B. Karzinogenese) nicht vollständig ausgeschlossen werden. Methoden, die auf mitochondrialer Aktivität basieren, ohne genetische Veränderungen zu beinhalten, können frei von solchen Risiken sein.
Als Ergebnis der Untersuchung verschiedener mitochondrialer Indikatoren in neonatalen Kardiomyozyten von Ratten wurde beobachtet, dass TMRM innerhalb von 24 Stunden vollständig verschwand, während andere Farbstoffe mindestens 5 Tage lang blieben13. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass TMRM und JC-1 die Zellviabilität nicht beeinflussten, wenn sie mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet wurden, während andere Farbstoffe unterschiedliche Auswirkungen auf die Zellviabilität zeigten13. TMRM weist eine höhere Sicherheit auf.
Bisher wurden mehrere zweidimensionale (2D) Differenzierungsmethoden entwickelt, die im Vergleich zur dreidimensionalen (3D) Embryoidkörperbildung effizientere Ansätze zur Induktion der Differenzierung darstellen. Dies liegt daran, dass differenzierungsinduzierende Verbindungen oder Zytokine den Zellen einheitlich auf einer 2D-Ebene und nicht in einem 3D-Raum verabreicht werden können. In dieser Studie wurde die zuvor beschriebene Methode20 modifiziert, um die Differenzierung in humane iPS-Zell-abgeleitete Hepatozyten zu induzieren. Im Folgenden werden die Verfahren zur zeitgemäßen 2D-Differenzierung und -Reinigung von Hepatozyten, die aus humanen iPS-Zellen gewonnen werden, detailliert beschrieben.

<table><tbody><tr><td>253G1 humane iPS-Zelllinie</td><td>RIKEN BioResource Research Center</td><td>HPS0002</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A Lösung, human, rekombinant</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>18585</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nuclei Antikörper, Klon 235-1</td><td>Chemicon</td><td>MAB1281</td><td>Antikörper gegen humanes nukleäres Antigen</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), serumfrei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Zellsortierer</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporin A</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>035-18961</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembran-Matrix</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Gel-artige Basalmembran-Matrix</td></tr><tr><td>CultureSure Y-27632</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>036-24023 ROCK-Inhibitor</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-18863</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>047-29353</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziegen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb Schnappkappe</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Biowest</td><td>51820-500</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin</td></tr><tr><td>Mensch/Maus/Ratte/Hund ALCAM/CD166 Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>AF1172</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison 21-Hemisuccinat-Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 Seide</td><td>Nippi</td><td>892021</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoBlock</td><td>KAC</td><td>CTKN001</td><td>Blockierungslösung</td></tr><tr><td>ITS-G Ergänzung(&mal; 100)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>090-06741</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15</td> Medium <td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>128-06075</td><td></td></tr><tr><td>N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amid (Dihexa)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>H293745</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonales Kaninchen-Anti-Human-Albumin</td><td>Dako</td><td>A0001</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen-Sorbitan Monolaurat (Tween 20)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28353-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-L-Ascorbat</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>03422-32</td><td></td></tr><tr><td>StemFit AK02N</td><td>REPROCELL</td><td>RCAK02N</td><td></td></tr><tr><td>TBS (10x)</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>12748-31</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin, Methylester (TMRM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>28229-25</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung</td><td>NACALAI TESQUE, INC.</td><td>20577-34</td><td></td></tr><tr><td>TRYPSIN 250</td><td>Difco</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Tryptosephosphat-Bouillon Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8159</td><td></td></tr></tbody></table>

anwendung der färbung lebender mitochondrien bei der zellsortierung zur aufreinigung von hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten stammzellen gewonnen wurden

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Humane embryonale Stammzellen (ES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) haben aufgrund ihrer unbegrenzten Proliferation und pluripotenten Eigenschaften potenzielle Anwendungen in der zellbasierten regenerativen Medizin zur Behandlung schwer erkrankter Organe. Die Differenzierung von humanen ES/iPS-Zellen in 100 % reine Zielzelltypen ist jedoch aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber der Umwelt eine Herausforderung. Die Tumorgenese nach einer Transplantation wird durch kontaminierte, proliferierende und undifferenzierte Zellen verursacht, so dass die Hochreinigungstechnologie für die sichere Realisierung der regenerativen Medizin unerlässlich ist. Um das Risiko der Tumorentstehung zu verringern, wurde eine Hochreinigungstechnologie für aus humanen iPS-Zellen gewonnene Hepatozyten entwickelt. Das Verfahren verwendet FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) unter Verwendung einer Kombination aus hohem mitochondrialem Gehalt und dem Zelloberflächenmarker ALCAM (aktiviertes Leukozytenzelladhäsionsmolekül) ohne genetische Veränderung. 97% ± 0,38% (n = 5) der gereinigten Hepatozyten mit dieser Methode zeigten eine Albuminproteinexpression. In diesem Artikel sollen detaillierte Verfahren für diese Methode vorgestellt werden, wie sie auf die aktuellste zweidimensionale Differenzierungsmethode für humane iPS-Zellen in Hepatozyten angewendet wird.

Die Zeitleiste der Prozesse, die humane iPS-Zellen dazu veranlassen, sich durch 2D-Kultur (Abbildung 1A) und repräsentative Zellmerkmale (Abbildung 1B) in Hepatozyten zu differenzieren, wird gezeigt. Ungefähr am 12. Tag der Differenzierung begannen die Zellen polygonale Zellformen und runde Zellkerne zu zeigen, die für Hepatozyten charakteristisch sind. Einige Hepatozyten zeigten auch eine Mehrkernigkeit.
Die FACS-Analyse wurde mit de...

Hepatozyten, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, können durch Zellsortierung aufgereinigt werden, wobei eine Kombination aus mitochondrialer und aktivierter Leukozytenzelladhäsionsmolekülfärbung (ALCAM, auch bekannt als CD166) verwendet wird.

Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...

Der Umfang unserer Forschung besteht in der Reinigung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hepatozyten ohne genetische Veränderung. Unser Ziel ist es, das Problem des tumorigenen Risikos zu lösen, das mit undifferenzierten Zellen verbunden ist, die von humanen iPS-Zellen differenziert sind. Eine der aktuellen experimentellen Herausforderungen ist eine geringe Zellreinheit, bedingt durch die mechanische Lagerung der Sortierung.Wir entwickeln eine neue Reinigungsmethode, die die einzigartigen Stoffwechseleigenschaften von Hepatozyten für eine großflächige Reinigung nutzt. Eine Nicht-Zellsortiermethode für hepatische Vorläuferzellen kann keine reinen Hepatozyten gewinnen. Eine andere für reife Hepatozyten kann aufgrund der begrenzten Expression des Markerproteins nur einen kleinen Teil der Hepatozyten behandeln.Im Gegensatz dazu kann unser Ansatz Hepatozyten in unterschiedlichen Reifungsgraden mit einem höheren Eve erhalten. Aus humanen iPS-Zellen gewonnene Hepatozyten sind extrem unreif und zeigen nach der Aufreinigung eine verminderte Hepatozyten-Makroexpression. Unser zukünftiges Ziel ist es, die Hepatozytenmodulation mithilfe der organoiden Technologie und der täglichen Fortschritte in der regenerativen Medizin und Wirkstoffforschung zu verbessern.

application-live-mitochondria-staining-cell-sorting-to-purify

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Studie zeigt die Reprogrammierung somatischer Zellen in vivo in Richtung Pluripotenz ohne die Erzeugung von Teratomen. Wir verwendeten eine hydrodynamische Schwanzveneninjektion von Plasmid-DNA, die für die Yamanka-Faktoren kodiert, um die in vivo Reprogrammierung von adulten Hepatozyten in Zellen mit erhöhter Pluripotenz zu induzieren.

im lebenden Organismus Reprogrammierung adulter somatischer Zellen zur Pluripotenz durch Überexpression von Yamanaka-Faktoren

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll für die Ableitung menschlicher Kardiomyozyten, das die modulierte kardiale Differenzierung kleiner Moleküle und die durch Glukoseentzug vermittelte Kardiomyozytenreinigung kombiniert und die Produktion von gereinigten Kardiomyozyten für die Zwecke der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Wirkstoffscreenings ermöglicht.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Das Ziel dieses Protokolls ist, hohe Wirtschaftlichkeit und hohe Ausbeute von Hepatozyten und sinusförmigen endothelial Zellen von Leber zu erhalten. Dies geschieht durch die Vorrichtung der Leber mit einer Typ IV Kollagenase Lösung über die Pfortader, gefolgt von differentielle Zentrifugation, Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen zu erhalten.

Reinigung von Hepatozyten und sinusförmigen Endothelzellen aus Maus Leber Perfusion

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.

Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung

Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.

Halbautomatische Herstellung von Hepatozyten wie Zellen aus pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine monolayer, serumfreie Methode zur effizienten Erzeugung von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 18 Tagen. Dies beinhaltet sechs Schritte, da hPSCs sequenziell in zwischengeschaltete Zelltypen wie den Primitivstreifen, das definitive Endoderm, das hintere Vorgut und die Leberknospenvorläufer differenzieren, bevor hepatozytenähnliche Zellen gebildet werden.

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Erfahren Sie die Aufreinigung von Hepatozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen mittels FACS-Sortierung ohne genetische Modifikation. Diese Methode erreicht 97% Reinheit und verbesserte Zellviabilität für regenerative Medizin.

Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden (Video) | JoVE Journal

Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden

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