Name: Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Erfahren Sie zwei komplementäre Methoden zur quantitativen Analyse des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse mittels Durchflusszytometrie. Diese Techniken ermöglichen präzise Einblicke in die mitochondriale Qualitätskontrolle und deren Bedeutung für die Diabetesforschung.

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E.L-D. dankt der Unterstützung durch die NIH (T32-AI007413 und T32-AG000114). SAS bedankt sich für die Unterstützung durch die JDRF (COE-2019-861), die NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), das Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), die Familie Brehm und die Familie Anthony.

Die in diesem Protokoll vorgestellten Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Michigan geprüft und genehmigt. Für diese Studie wurden zwanzig Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die entweder eine 15-wöchige normale Fettdiät (RFD) oder eine fettreiche Diät (HFD) erhielten.
1. Beurteilung der Mitophagie mit dem farbstoffbasierten MtPhagy-Ansatz (Methode 1)
<ol><li>Aufbereitung und Behandlung von Mäuseinseln<ol><li>Führen Sie die Inselkultur und die Valinomycin-Exposition durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Isolierung von Inselzellen aus Mäusen mit normaler Fettdiät (RFD) oder fettreicher Diät (HFD, 60 kcal% Fett19) nach den zuvor beschriebenen Methoden 2,10.</li>
			<li>Kulturinselproben über Nacht bei 37 °C in RPMI-Medium, ergänzt mit 100 Einheiten/ml Antimykotikum-Antibiotikum, 50 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES und 10 % fötalem Kälberserum (FBS) (siehe Materialtabelle). Dieses Medium wird als "Inselmedium" bezeichnet.</li>
			<li>Mit einer Pipette 100 Inselchen pro Zustand in 6 cm Petrischalen in 2 ml Inselmedium entnehmen. ANMERKUNG: Für dieses Protokoll verwendete Bedingungen: (1) Ungefärbte Kontrolle: ungefärbte RFD-Inseln; (2) Nur DAPI-Kontrolle: RFD-Inseln, die mit DAPI gefärbt sind; (3) Nur Fluozin-3-AM-Kontrolle: RFD-Inseln, die mit Fluozin-3-AM gefärbt wurden; (4) Nur MtPhagy-Kontrolle: RFD-Inseln, die mit MtPhagy gefärbt sind; (5) Nur TMRE-Kontrolle: RFD-Inseln, die mit TMRE gefärbt wurden; (6) RFD unbehandelt: RFD-Inseln, gefärbt mit MtPhagie, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI; (7) Valinomycin-exponierte RFD-Inseln: RFD-Inseln, die Valinomycin ausgesetzt und mit MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI gefärbt wurden; (8) HFD unbehandelt: HFD-Inseln, gefärbt mit MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI; (9) Valinomycin-exponierte HFD-Inseln: HFD-Inseln, die Valinomycin ausgesetzt und mit MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI gefärbt wurden.</li>
			<li>Bei Bedingungen (7) und (9) (siehe ANMERKUNG oben), die Valinomycin ausgesetzt sind, werden 2 μl 250 nΜ Valinomycin-Stamm (siehe Materialtabelle) 3 h lang auf Inseln in der Petrischale gegeben, um die Mitophagie zu induzieren.</li>
		</ol></li>
		<li>Führen Sie eine Einzelzelldissoziation durch.<ol><li>Nach 3-stündiger Valinomycin-Exposition werden 100 Inseln aus jeder Bedingung mit einer Pipette in separate Mikrozentrifugenröhrchen entnehmen.</li>
			<li>Inselchen werden bei 350 x g 1 min bei 10 °C geschleudert und der Überstand mit einer Pipette entsorgt.</li>
			<li>Waschen Sie die Proben 2x mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), mit Schleuderschritten (350 x g/1 min, 10 °C) zwischen jedem Waschgang. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Waschgang mit einer Pipette.</li>
			<li>Um Inseln in einzelne Zellen zu dissoziieren, geben Sie 500 μl 0,05%iges Trypsin (vorgewärmt auf 37 °C) in das Mikrozentrifugenröhrchen einer Probe, um eine Überverdauung der Inselzellen zu verhindern. Pipettieren Sie wiederholt auf und ab, bis die Inseln sichtbar verteilt sind.</li>
			<li>Sofort 1 ml vorgewärmtes Inselmedium hinzufügen, um Trypsin zu neutralisieren. Wiederholen Sie die Trypsinisierung und Neutralisation für jede Probe, eine nach der anderen.</li>
			<li>Schleudern Sie die Proben bei 500 x g für 5 min bei 10 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. HINWEIS: Das Pellet ist für Proben, die Valinomycin ausgesetzt sind, empfindlich.</li>
			<li>Waschen Sie die Proben 2x mit RPMI-Medium, kein Phenolrot, ergänzt mit 100 Einheiten/ml Antimykotikum-Antibiotikum, 50 Einheiten/ml Penicillin-Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES und 10% Rinderserumalbumin (BSA). Dieses Medium wird als "Inselflussmedium" bezeichnet. Zwischen jedem Waschgang Schleuderschritte (350 x g/1 min, 10 °C) einplanen. Entsorgen Sie den Überstand nach jedem Waschgang mit einer Pipette.</li>
		</ol></li>
		<li>Färben Sie Zellen mit MtPhagy, TMRE, Fluozin-3-AM und DAPI, um sich auf die Durchflusszytometrie vorzubereiten.<ol><li>Resuspendieren Sie Inselzellenproben in 500 μl Inselflussmedium.</li>
			<li>0,25 μl 100 μM MtPhagy-Stamm (siehe Materialtabelle) in Röhrchen geben, die den MtPhagy-Farbstoff erhalten (Bedingungen 4, 6, 7, 8 und 9, HINWEIS zu Schritt 1.1.1).</li>
			<li>0,25 μl 100 μM TMRE-Material (siehe Materialtabelle) in Röhrchen geben, die TMRE-Farbstoff erhalten (Bedingungen 5, 6, 7, 8 und 9).</li>
			<li>0,25 μl 1 mM Fluozin-3-AM-Stamm (siehe Materialtabelle) in Röhrchen geben, die den Fluozin-3-AM-Farbstoff erhalten (Bedingungen 3, 6, 7, 8 und 9).</li>
			<li>Vortex-Rohre mit niedriger Geschwindigkeit für 5 s mischen.</li>
			<li>Mikrozentrifugenröhrchen zum Schutz vor Licht in Aluminiumfolie wickeln und bei 37 °C 30 min inkubieren. Nach der Hälfte der Inkubation Wirbelrohre mit niedriger Geschwindigkeit für 5-10 s mischen.</li>
			<li>Nach der Inkubation zentrifugieren die Proben bei 350 x g für 1 min bei 10 °C. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
			<li>Resuspendieren Sie die Proben in einem 500-μl-Inselflussmedium. 0,2 μg/ml DAPI (siehe Materialtabelle) zu den Bedingungen 2, 6, 7, 8 und 9 hinzufügen.</li>
			<li>Schleudern Sie die Proben bei 350 x g für 1 Minute bei 10 °C. Überstand mit einer Pipette verwerfen und in 500 μl Inselflussmedium resuspendieren.</li>
			<li>Proben auf Eis legen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Durchflusszytometrie<ol><li>Starten Sie das Gerät (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Jedes Durchflusszytometer mit den entsprechenden Filtern funktioniert. Die folgenden Filter wurden in dieser Studie verwendet: (1) VL1 für DAPI: Anregung/Emission - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 für Fluozin-3-AM: Anregung/Emission - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) BL2 für MtPhagy-Farbstoff: Anregung/Emission - 488 nm/590 nm (40 nm); (4) YL1 für TMRE: Anregung/Emission - 561 nm/585 nm (16 nm).</li>
		<li>Passen Sie die Spannungen für Durchlass- (FSC) und Seitenstreuung (SSC) an, um sicherzustellen, dass sich die Zellpopulationen in der Mitte des Streudiagramms befinden. Für dieses Protokoll wurden Spannungen von 120 V für FSC und 260 V für SSC verwendet, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig innerhalb des FSC-A-Wertes fallen. SSC-A-Diagramm (Abbildung 1A).</li>
		<li>Um Nicht-Einzelzellen auszuschließen, fügen Sie ein rechteckiges Gatter auf FSC-H vs. FSC-W gefolgt von SSC-H vs. SSC-W (Abbildung 1B,C).</li>
		<li>Passen Sie die Spannungen und die Kompensation für DAPI an, um nach aktiven β-Zellen zu filtern. Setzen Sie Fluoreszenzgatter für jedes verwendete Fluorophor auf der Grundlage der ungefärbten RFD-Probe (Abbildungen 1D-F). HINWEIS: Verwendete Spannungen für jeden Kanal: (1) VL1: 320-360 V; (2) BL1: 300-340 V; (3) BL2: 260-300 V; (4) YL1: 300-340 V.</li>
		<li>Sobald Gatter eingerichtet sind, erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe. ANMERKUNG: Unter Verwendung dieses Gating-Ansatzes wurden die Mitophagie-Spiegel unter basalen Bedingungen und nach Valinomycin-Induktion sowohl in RFD- als auch in HFD-Inselzellen beurteilt (Abbildung 2).</li>
		<li>Speichern Sie die Daten zur Analyse als FCS-Dateien.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Beurteilung der Mitophagie mit dem genetisch kodierten mt-Keima-Reporter (Methode 2)
<ol><li>Präparation von Mäuseinseln und Einzelzelldissoziation<ol><li>Führen Sie die Inselkultur und die Valinomycin-Exposition durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Isolierung von Pankreasinseln aus Wildtyp- (WT) und mt-Keima/+ (mt-Keima) Mäusen6. Bei dieser Methode wurden 20 Wochen alte männliche WT- oder mt-Keima/+-gefütterte RFD-Mäuse verwendet.</li>
			<li>Kulturinselproben über Nacht bei 37 °C in Inselmedium.</li>
			<li>Entnehmen Sie mit einer Pipette 100 Inselchen pro Zustand in 6 cm Petrischalen mit 2 ml Inselmedium. ANMERKUNG: Für dieses Protokoll verwendete Bedingungen: (1) Ungefärbte Kontrolle: Ungefärbte WT-Inseln; (2) Nur DAPI-Kontrolle: WT-Inseln, die mit DAPI gefärbt sind; (3) Nur Fluozin-3-AM-Kontrolle: WT-Inseln, die mit Fluozin-3-AM gefärbt wurden; (4) Nur mt-Keima-Kontrolle: Ungefärbte mt-Keima/+-Inseln; (5) Unbehandelt: mt-Keima/+-Inseln, gefärbt mit Fluozin-3-AM und DAPI; (6) Valinomycin: mt-Keima/+-Inseln, die Valinomycin ausgesetzt und mit Fluozin-3-AM und DAPI gefärbt wurden.</li>
			<li>Bei Bedingung (6) mit Valinomycin-Exposition 2 μl 250 nM Valinomycin-Brühe für 3 h auf Inseln in der Petrischale geben, um eine Mitophagie zu induzieren.</li>
		</ol></li>
		<li>Führen Sie eine Einzelzelldissoziation durch.<ol><li>Führen Sie die Dissoziationsschritte für einzelne Zellen durch, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben.</li>
		</ol></li>
		<li>Färben Sie Zellen mit Fluozin-3-AM und DAPI.<ol><li>Resuspendieren Sie Inselzellenproben in 500 μl Inselflussmedium.</li>
			<li>0,25 μl 1 mM Fluozin-3-AM-Stammstoff in Röhrchen geben, die den Fluozin-3-AM-Farbstoff erhalten (Bedingungen 3, 5 und 6).</li>
			<li>Die Zellen werden bei 37 °C inkubiert und mit der DAPI-Behandlung fortgefahren, wie in den Schritten 1.1.3.5-1.3.10 beschrieben.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Durchflusszytometrie<ol><li>Starten Sie das Instrument. Jedes Durchflusszytometer mit den entsprechenden Filtern funktioniert. ANMERKUNG: In dieser Studie wurden die folgenden Filter verwendet: (1) VL1 für DAPI: Anregung/Emission - 405 nm/440 nm (50 nm); (2) BL1 für Fluozin-3-AM: Anregung/Emission - 488 nm/530 nm (30 nm); (3) VL3 für mt-Keima neutral: Anregung/Emission - 405 nm/603 nm (48 nm); (4) YL2 für mt-Keima-Säure: Anregung/Emission - 561 nm/620 nm (15 nm).</li>
		<li>Stellen Sie die FSC- und SSC-Spannungen ein und schließen Sie einzelne Zellen aus, wie in den Schritten 1.2.2 bis 1.2.3 beschrieben (Abbildungen 3A-C).</li>
		<li>Passen Sie die Spannungen und die Kompensation für DAPI, Fluozin-3-AM und mt-Keima unter Verwendung von ungefärbten und einfach-positiven Kontrollen (Bedingungen 1-4) an, um sicherzustellen, dass fluoreszenzpositive Zellpopulationen von ungefärbten Zellen unterschieden werden können. Sobald die entsprechende Kompensation auf jeden Kanal angewendet wurde, richten Sie das negative DAPI-Gatter und das positive Fluozin-3-AM-Gatter ein, um nach lebenden β-Zellen zu filtern (Abbildungen 3D-E).</li>
		<li>Richten Sie ein Dreiecks-Gating-Schema mit der mt-Keima-positiven Probe (Bedingung 4) ein, um saure und neutrale Zellpopulationen zu identifizieren (Abbildung 3F). HINWEIS: Normalerweise verwendete Spannungen für jeden Kanal: (1) VL1: 320-340 V; (2) BL2: 260-280 V; (3) VL3: 280-300 V; (4) YL2: 280-300 V.</li>
		<li>Sobald Gatter eingerichtet sind, erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe. Die Anschnittschemata für die Bedingungen 5 und 6 sind in Abbildung 3A-G dargestellt.</li>
		<li>Speichern Sie die Daten zur Analyse als FCS-Dateien.</li>
	</ol></li>
</ol>

Quantitative Analyse der Mitophagie in murinen Pankreas-β-Zellen

<ol><li>Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+%CE%B2-cell+function%3A+maintaining+the+momentum+for+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release.</a> Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).</li>
<li>Soleimanpour, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes+susceptibility+gene+Clec16a+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy.</a> Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).</li>
<li>Pearson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clec16a%2C+Nrdp1%2C+and+USP8+form+a+ubiquitin-dependent+tripartite+complex+that+regulates+%CE%B2-cell+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy.</a> Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).</li>
<li>Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+by+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation by mitophagy.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).</li>
<li>Berezhnov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+modulates+autophagy+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li>
<li>McWilliams, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mito-QC+illuminates+mitophagy+and+mitochondrial+architecture+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).</li>
<li>Aoyagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+beta+cell-specific+mitophagy+reporter+mouse+shows+that+metabolic+stress+leads+to+accumulation+of+dysfunctional+mitochondria+despite+increased+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy.</a> Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).</li>
<li>Ma, X., Ding, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+imaging+based-assay+to+monitor+mitophagy+in+cultured+hepatocytes+and+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Research%22%5BJournal%5D)">A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver.</a> Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).</li>
<li>Sidarala, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+protects+%CE%B2+cells+from+inflammatory+damage+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes.</a> JCI Insight. 5 (24), 141138(2020).</li>
<li>Gingerich, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsically+disordered+protein+region+encoded+by+the+human+disease+gene+CLEC16A+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy.</a> Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).</li>
<li>Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+imaging+method+to+measure+in+vitro+and+in+vivo+mitophagy+using+mt-Keima%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima.</a> Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).</li>
<li>Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc+indicator+FluoZin-3+is+not+perturbed+significantly+by+physiological+levels+of+calcium+or+magnesium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium.</a> Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).</li>
<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).</li>
<li>Thapa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+%CE%B2-cell+function+using+a+zinc-responsive+MRI+contrast+agent+may+identify+first+responder+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 12, 809867(2022).</li>
<li>Iwashita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+mitochondrial+autophagy+with+a+novel+fluorescent+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).</li>
<li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361(2016).</li>
<li>Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+intracellular+K%28%2B%29+homeostasis+with+valinomycin+promotes+cell+death+by+mitochondrial+swelling+and+autophagic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes.</a> Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).</li>
<li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+TLR2+and+TLR4+block+the+replication+of+pancreatic+%CE%B2+cells+in+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity.</a> Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).</li>
<li>Sauvat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cellular+viability+by+automated+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry.</a> Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).</li>
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</ol>

SAS hat Zuschüsse von Ono Pharmaceutical Co., Ltd. erhalten und ist als Berater für Novo Nordisk tätig.

Dieses Protokoll beschrieb zwei komplementäre Methoden zur Quantifizierung des Mitophagieflusses in dissoziierten primären Mausinseln. Mit der mt-Keima-Methode wurde ein Anstieg der Mitophagie als erhöhtes Verhältnis von sauren (561 nm) / neutralen (405 nm) Zellen quantifiziert, während in der MtPhagy-Methode ein erhöhter Mitophagiefluss als Anstieg der niedrigen Zellpopulation mit Fluozin-hohemMtPhagy-hohem TMRE-Wert quantifiziert wurde. Diese Methoden ermöglichen eine schnelle, quantita...

β-Zellen der Bauchspeicheldrüse produzieren und sezernieren Insulin, um den Stoffwechselbedarf zu decken, und β-Zell-Dysfunktion ist für Hyperglykämie und das Auftreten von Diabetes sowohl bei Typ-1- als auch bei Typ-2-Diabetes verantwortlich. β-Zellen koppeln den Glukosestoffwechsel mit der Insulinsekretion über die mitochondriale Energetik und die Stoffwechselleistung, die von einer Reserve an funktioneller mitochondrialer Masse abhängen 1,2,3. Um eine optimale β-Zell-Funktion aufrechtzuerhalten, verlassen sich β-Zellen auf mitochondriale Qualitätskontrollmechanismen, um gealterte oder beschädigte Mitochondrien zu entfernen und die funktionelle mitochondriale Masse zu erhalten4. Die selektive mitochondriale Autophagie, auch bekannt als Mitophagie, ist eine Schlüsselkomponente des mitochondrialen Qualitätskontrollwegs.
Die Beurteilung der Mitophagie in lebenden Zellen beruht oft auf Veränderungen des mitochondrialen pH-Werts, die während der Mitophagie auftreten. Mitochondrien haben einen leicht alkalischen pH-Wert, und gesunde Mitochondrien befinden sich normalerweise im pH-neutralen Zytosol. Während der Mitophagie werden beschädigte oder dysfunktionale Mitochondrien selektiv in Autophagosomen eingebaut und schließlich in sauren Lysosomen abgebaut5. Mehrere in vivo transgene Mitophagie-Reportermausmodelle, wie mt-Keima6, mitoQC7 und CMMR8, sowie transfektierbare Mitophagiesonden, wie das Cox8-EGFP-mCherry-Plasmid9, nutzen diese pH-Änderung, um quantitative Bewertungen der Mitophagie zu ermöglichen. Die Verwendung transgener Mäuse, die die pH-sensitive ratiometrische Sonde mt-Keima exprimieren, wurde für die Beurteilung der Mitophagie in Inselzellen und β-Zellen mittels Durchflusszytometrie optimiert10,11. Das Verhältnis von sauren zu neutralen mt-Keima-Wellenlängen (das Verhältnis von saurer 561 nm zu neutraler 480 nm Anregung) kann verwendet werden, um die Mitophagie robust zu quantifizieren 6,12.
Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Ansatz zur Bestimmung des Mitophagieflusses in primären Inselzellen und β-Zellen, die aus mt-Keima-transgenen Mäusen isoliert wurden10,11. Obwohl mt-Keima eine hochempfindliche Sonde ist, erfordert sie entweder komplizierte Tierzuchtschemata oder die Transfektion von Zellen, was in Kombination mit anderen genetischen Modellen oder mit primären menschlichen Inseln oft eine Herausforderung darstellen kann. Darüber hinaus kann die Verwendung mehrerer Fluoreszenzlaser und -detektoren zur Identifizierung neutraler und saurer Zellpopulationen die kombinatorische Verwendung anderer fluoreszierender Reporter einschränken.
Um diese Herausforderungen zu meistern, beschreibt dieses Protokoll auch eine komplementäre, farbstoffbasierte Methode mit einem einzigen fluoreszierenden Kanal für den robusten Nachweis von Mitophagie in β-Zellen von isolierten Mäuseinseln. Dieser Ansatz, der als MtPhagy-Methode bezeichnet wird, verwendet eine Kombination aus drei zellpermeablen Farbstoffen, um nach β-Zellen zu selektieren, die Zellpopulationen zu quantifizieren, die aktiv der Mitophagie unterzogen werden, und gleichzeitig das mitochondriale Membranpotenzial (MMP oder Δψm) zu bewerten.
Der erste dieser Farbstoffe ist Fluozin-3-AM, ein zelldurchlässigerZn2+-Indikator mit einem Ex/Em 494/516 nm13. Mäuseinseln bestehen aus einer heterogenen Population funktionell unterschiedlicher Zellen, darunter α-, β-, δ- und PP-Zellen. β-Zellen umfassen etwa 80% der Zellen innerhalb der Mausinsel und können von anderen Inselzelltypen durch ihre hoheZn2+-Konzentration in Insulingranula14,15 unterschieden werden, was die Identifizierung von β-Zellen als Fluozin-3-AM-Population mit hohem Fluozin-3-AM-Gehalt ermöglicht. Der MtPhagy-Farbstoff, ein pH-empfindlicher Farbstoff, der über eine chemische Bindung auf Mitochondrien immobilisiert wird und schwache Fluoreszenz emittiert, wird ebenfalls in diesem Protokoll verwendet16. Bei der Induktion der Mitophagie werden beschädigte Mitochondrien in das saure Lysosom eingebaut, und der MtPhagy-Farbstoff erhöht seine Fluoreszenzintensität in der Umgebung mit niedrigem pH-Wert (Ex/Em 561/570-700 nm).
Darüber hinaus wird Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE), zur Beurteilung von MMP verwendet. TMRE ist ein zellpermeabler, positiv geladener Farbstoff (Ex/Em 552/575 nm), der von gesunden Mitochondrien aufgrund der relativen negativen Ladung, die durch ihr Membranpotential aufrechterhalten wird, sequestriert wird17. Beschädigte oder ungesunde Mitochondrien lösen ihr Membranpotenzial auf, was zu einer verminderten Fähigkeit zur Sequestrierung von TMRE führt. Durch die gemeinsame Verwendung dieser Farbstoffe können β-Zellen, die einer Mitophagie unterzogen werden, mittels Durchflusszytometrie als Fluozin-Populationmit hohemMtPhagy-hohemTMRE-Gehalt identifiziert werden. Da es sich bei der Mitophagie um einen dynamischen und nicht um einen statischen Prozess handelt, wurde dieses Protokoll optimiert, um den Mitophagiefluss mit Valinomycin zu bestimmen, einem K+-Ionophor, der die Mitophagie nach Dissipation von MMP18 induziert. Der Vergleich der Mitophagie in Gegenwart und Abwesenheit von Valinomycin ermöglicht die Beurteilung des Mitophagieflusses in verschiedenen Probengruppen.
Die farbstoffbasierte Natur des derzeitigen Ansatzes ermöglicht die Extrapolation auf menschliche Inseln und andere schwer zu transfizierende Zelltypen und umgeht im Gegensatz zum mt-Keima-Protokoll die Notwendigkeit komplizierter Tierzuchtschemata. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Quantifizierung der Mitophagie in β-Zellen auf Einzelzellebene durch zwei unabhängige, auf Durchflusszytometrie basierende Methoden. Zusammengenommen beschreibt dieses Protokoll zwei leistungsstarke und komplementäre Methoden, die sowohl Präzision als auch Flexibilität bei der quantitativen Untersuchung der mitochondrialen Qualitätskontrolle ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Antibiotikum-Antimykotika</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Durchflusszytometer</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>Fettsäure Freier Hitzeschock BSA-Pulver</td><td>Equitech</td><td>BAH66</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>Fluozin-3AM&nbsp;</td><td>Thermofisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>F24195</td><td>100 &mu; g Fluozin-3AM-Pulver, rekonstituiert in 51 μa; L DMSO und 51 &mu; L Pluronic F-127 erreicht einen Lagerbestand von 1 mM.</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; RPMI 1640 Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MtPhagy Farbstoff</td><td>Dojindo</td><td>MT02-10</td><td>5 &mu; g MtPhagy Pulver, rekonstituiert mit 50 μm; L DMSO auf 100 &mu; M Lagerbestände&nbsp;</td></tr><tr><td>MtPhagy Farbstoff</td><td>Dojindo</td><td>MT02-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>1x Lösung zur Verwendung in Prokotol durch Verdünnung von 1:10 in ddH2O</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>1x Lösung zur Verwendung in Prokotol durch Verdünnung von 1:10 in ddH2O</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100x)</td><td>Leben Technologien</td><td>11360-070</td><td>5 &mu; g MtPhagy Pulver, rekonstituiert mit 50 μm; L DMSO auf 100 &mu; M Lagerbestände&nbsp;</td></tr><tr><td>TMRE [Tetramethylrhodamin, Ethylester, Perchlorat]</td><td>Anaspec</td><td>AS-88061</td><td>TMRE-Pulver in DMSO rekonstituiert, um 100 μm zu erreichen M Lagerbestände.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Valinomycin-Pulver in DMSO rekonstituiert, um einen Lagerbestand von 250 nM zu erreichen.</td></tr></tbody></table>

komplementäre ansätze zur untersuchung des mitophagieflusses in β-zellen der bauchspeicheldrüse

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Die Mitophagie ist ein Qualitätskontrollmechanismus, der für die Aufrechterhaltung einer optimalen Mitochondrienfunktion erforderlich ist. Eine dysfunktionale β-Zell-Mitophagie führt zu einer unzureichenden Insulinausschüttung. Fortgeschrittene quantitative Bewertungen der Mitophagie erfordern oft den Einsatz genetischer Reporter. Das mt-Keima-Mausmodell, das eine auf die Mitochondrien abzielende pH-sensitive ratiometrische Sonde mit doppelter Erregung zur Quantifizierung der Mitophagie mittels Durchflusszytometrie exprimiert, wurde in β-Zellen optimiert. Das Verhältnis von sauren zu neutralen mt-Keima-Wellenlängen kann zur robusten Quantifizierung der Mitophagie verwendet werden. Die Verwendung genetischer Mitophagie-Reporter kann jedoch eine Herausforderung darstellen, wenn mit komplexen genetischen Mausmodellen oder schwer zu transfizierenden Zellen, wie z. B. primären menschlichen Inseln, gearbeitet wird. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige komplementäre farbstoffbasierte Methode zur Quantifizierung der β-Zell-Mitophagie in primären Inselzellen mittels MtPhagy. MtPhagy ist ein pH-empfindlicher, zelldurchlässiger Farbstoff, der sich in den Mitochondrien anreichert und ihre Fluoreszenzintensität erhöht, wenn sich Mitochondrien in Umgebungen mit niedrigem pH-Wert befinden, wie z. B. Lysosomen während der Mitophagie. Durch die Kombination des MtPhagy-Farbstoffs mit Fluozin-3-AM, einemZn2+ -Indikator, der für β-Zellen selektiert, und Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) zur Beurteilung des mitochondrialen Membranpotenzials kann der Mitophagiefluss in β-Zellen mittels Durchflusszytometrie spezifisch quantifiziert werden. Diese beiden Ansätze ergänzen sich in hohem Maße und ermöglichen Flexibilität und Präzision bei der Beurteilung der mitochondrialen Qualitätskontrolle in zahlreichen β-Zell-Modellen.

Beurteilung der Mitophagie mit dem farbstoffbasierten MtPhagy-Ansatz Dieser farbstoffbasierte Ansatz wurde optimiert, um den Mitophagiefluss in primären β-Zellen der Maus zu analysieren, ohne dass ein genetischer Reporter erforderlich ist, wobei Fluozin-3-AM, TMRE und MtPhagy sowie DAPI verwendet wurden, um tote Zellen auszuschließen. Durch die Kombination dieser Farbstoffe mit Valinomycin, um die Mitophagie zu induzieren, skizziert dieses Protokoll eine farbstoffbasierte Methode zur selektiven Messun...

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur quantitativen Analyse der Mitophagie in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse: erstens eine Kombination zellpermeabler Mitochondrien-spezifischer Farbstoffe und zweitens einen genetisch kodierten Mitophagie-Reporter. Diese beiden Techniken ergänzen sich und können je nach Bedarf eingesetzt werden, was Flexibilität und Präzision bei der quantitativen Qualitätskontrolle der Mitochondrien ermöglicht.

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Unser Protokoll beschreibt zwei komplementäre Methoden zur Untersuchung des Betazell-Mitophagieflusses mit Einzelzellauflösung mittels Durchflusszytometrie. Das mt-Keima-Protokoll verwendet einen genetischen Mitophagie-Reporter, während das MtPhagy-Protokoll drei Fluoreszenzfarbstoffe kombiniert, was die Extrapolation auf schwer zu transfizierende Zellen in menschlichen Proben erleichtert. Die Beurteilung der Mitophagie mit traditionellen biochemischen Ansätzen und bildgebenden Verfahren ist sowohl zeitaufwändig als auch herausfordernd.Daher ist es wichtig, neue, robuste und effektive Methoden zu entwickeln, um den Mitophagiefluss in Betazellen zu untersuchen. Sowohl die mt-Keima- als auch die MtPhagy-Methode sind quantitative Beurteilungen, die für die Untersuchung des Mitophagieflusses in Betazellen der Bauchspeicheldrüse effizient sind. Daher konzentriert sich das Soleimanpour-Labor auf die verschiedenen Mechanismen, die das Versagen von Betazellen der Bauchspeicheldrüse und Diabetes vorantreiben.Und wir konzentrieren uns speziell auf die verschiedenen Aspekte des mitochondrialen Lebenszyklus, einschließlich der Mitophagie, um zu verstehen, wie Defekte in der mitochondrialen Funktion die Entwicklung von Diabetes vorantreiben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hierin beschreiben wir detailliert einen Zeitraffer-Videomikroskopie-Ansatz zur Messung der zeitlichen Rekrutierung von EYFP-Parkin während der selektiven Entfernung geschädigter Mitochondrien. Dieser dynamische Prozess der EYFP-Parkin-abhängigen Entfernung geschädigter Mitochondrien kann unter verschiedenen experimentellen Bedingungen als Indikator für die zelluläre Gesundheit verwendet werden.

Zeitraffer-Video-Mikroskopie für die Beurteilung der EYFP-Parkin Aggregation als Marker für Cellular Mitophagie

Mitophagy, den Prozess der Clearing beschädigt Mitochondrien ist für mitochondriale Homöostase und Gesundheit Wartung notwendig. Dieser Artikel stellt einige der neuesten Mitophagy Nachweismethoden in menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegansund Mäuse.

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Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur quantitativen Analyse der Mitophagie-Protein-Komplexbildung speziell in Beta-Zellen aus primären menschlichen Ischenproben. Diese Technik ermöglicht somit die Analyse der Mitophagie aus begrenztem biologischem Material, die in wertvollen menschlichen Betazellproben der Bauchspeicheldrüse entscheidend sind.

Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle. Die Bewertung der Mitophagie in vivo wird jedoch durch das Fehlen zuverlässiger quantitativer Assays behindert. Hier wird ein Protokoll zur Beobachtung der Mitophagie in lebenden Zellen unter Verwendung eines zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs und eines rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs vorgestellt.

Visualisierung der Mitophagie mit Fluoreszenzfarbstoffen für Mitochondrien und Lysosomen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.

Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz

Die Erforschung der Mitophagie durch Elektronenmikroskopie, genetische Sensoren und Immunfluoreszenz erfordert kostspielige Geräte, qualifiziertes Personal und einen erheblichen Zeitaufwand. Hier demonstrieren wir die Wirksamkeit eines kommerziellen Fluoreszenzfarbstoff-Kits bei der Quantifizierung des Mitophagie-Prozesses sowohl in Caenorhabditis elegans als auch in einer Leberkrebszelllinie.

Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

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Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess des Pankreas dissection für virtuelle Scheibe Bildgebung, und die anschließende Quantifizierung aller GFP-markierten Beta-Zellen in der gesamten Bauchspeicheldrüse.

In situ Quantifizierung von Pankreas-Beta-Zellmasse in Mäuse

Erfahren Sie zwei komplementäre Methoden zur quantitativen Analyse des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse mittels Durchflusszytometrie. Diese Techniken ermöglichen präzise Einblicke in die mitochondriale Qualitätskontrolle und deren Bedeutung für die Diabetesforschung.

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

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