Name: Meerschweinchen-Rundfenstermembran-Explantation für Ex-vivo-Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Lernen Sie die Explantation der Rundfenstermembran aus Meerschweinchen-Schädeln für ex vivo Studien zur Arzneimittelentwicklung im Innenohr. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen von Wirkstofftransportmechanismen.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIDCD-Zuschüsse Nr. 1K08DC020780 und 5T32DC000027-33 sowie den Rubenstein Hearing Research Fund unterstützt.

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (GP18M226) genehmigt. Hartley-Albino-Meerschweinchen (sowohl männlich als auch weiblich, mit einem Gewicht von 500-700 g) wurden in der vorliegenden Studie verwendet.
1. Einrichtung und Vorbereitung des Verfahrens
<ol><li>Sterilisieren Sie alle Instrumente mit Ethylenoxid, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.</li>
	<li>Euthanasieren Sie die Tiere gemäß dem institutionell genehmigten Protokoll. HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde eine nicht vorgeladene Kammer verwendet, um 100 % Kohlendioxid (CO2) aus einer handelsüblichen Flasche freizusetzen. Ein Inline-Restriktor wurde verwendet, um den Gasfluss zu regulieren und ihn gemäß den AVMA-Richtlinien2020 11 im Bereich von 30 % bis 70 % des Kammervolumens pro Minute zu halten.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in die Kammer und geben Sie 5 Minuten lang Kohlendioxid ab. Der CO2 -Fluss wird nach dem Atemstillstand 1 Minute lang aufrechterhalten.</li>
	<li>Führen Sie eine Enthauptung nach einem Atemstillstand durch, um die Euthanasie sicherzustellen.</li>
</ol>2. Chirurgischer Ansatz und Explantation
<ol><li>Extrahieren Sie das Schläfenbein auf die übliche Weise aus dem Meerschweinchenschädel12. Entfernen Sie das überschüssige Weichgewebe mit einem Rongeur. Identifizieren Sie den äußeren Gehörgang, die Schläfenblase und den Gesichtskanal13 (Abbildung 1).</li>
	<li>Bohren Sie die ventralen Aspekte der Schläfenblase mit einem 6-mm-Diamantbohrer weg (siehe Materialtabelle) und legen Sie den Mittelohrraum und den äußeren Gehörgang umlaufend frei.</li>
	<li>Entfernen Sie mit Rongeuren vorsichtig den äußeren Gehörgang und den Paukenring und trennen Sie gleichzeitig das Incudomalleolargelenk. Identifizieren Sie den Incus, das Incudostapedialgelenk, die Cochlea, den horizontalen Bogengang und den Gesichtskanal13 (Abbildung 2A).</li>
	<li>Trennen Sie das Incudostapedialgelenk und entfernen Sie den Incus mit einer Pinzette. Identifizieren Sie die knöcherne Nische des runden Fensters.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 6-mm-Diamantbohrer, um die knöcherne Lamina wegzubohren, die die Cochlea mit der medialen Wand der Paukenhöhle in Richtung des Tensor-Paukenkanals verbindet. Den knöchernen Kanal des Tensor-Paukenspiels vorsichtig dekomprimieren und den Tensor-Paukenmuskel mit einer 28-G-Nadel entfernen. HINWEIS: Die mediale Wand der Fossa tensor tympani verbindet sich direkt mit dem Cochlea-Knochen um das RWM herum, und es wird darauf geachtet, keine Frakturen zu verursachen, die sich bis zum runden Fenster erstrecken können.</li>
	<li>Bohren Sie die knöcherne Lamina, die die Cochlea mit der unteren Wand der Paukenhöhle verbindet, weg, bis noch 1 mm knöcherne Kante an der Cochlea anliegt (Abbildung 2B).</li>
	<li>Führen Sie mit einem 2-mm-Diamantbohrer (siehe Materialtabelle) eine Cochleostomie an der basalen Drehung der Cochlea durch, wobei ca. 2 mm Knochen bis zum runden Fenster verbleiben. Setzen Sie die Cochleostomie in einer Ebene parallel zur runden Fenstermembran fort, um die Basis von der Spitze der Cochlea zu trennen.</li>
	<li>Verlängern Sie den Cochleostomieschnitt durch die Schädelbasis, die viel dichter ist, was zu einer Querschnittsansicht der basalen Drehung der Cochlea führt. HINWEIS: Wenn Sie den Bohrer auf den Meatus des inneren Gehörgangs richten, erhalten Sie eine Flugbahn, die den Knochenabtrag maximiert und gleichzeitig eine zu nahe Traversierung am runden Fenster vermeidet.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Probe von der Seite der Schädelbasis und identifizieren Sie, falls noch nicht geschehen, den inneren Gehörgang und bohren Sie bis zur Cochlea-Öffnung. Entfernen Sie den Cochlea-Nerv mit einer 28-G-Nadel.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Probe von der intracochleären Seite. Identifizieren und entfernen Sie die knöcherne Spirallamina in der basalen Drehung und den verbleibenden Modiolus mit einer Pinzette oder einer 28-G-Nadel.</li>
	<li>Spülen Sie die vereinheitlichte Scala tympani-scala vestibuli-Höhle reichlich, um Schmutz zu entfernen. Das runde Fenster sollte von der Cochektomie aus gut sichtbar sein, ohne dass darüber liegende Trümmer vorhanden sind (Abbildung 2C).</li>
	<li>Untersuchen Sie als Nächstes die Probe von der Mittelohrseite. Bohren Sie den seitlichen Bogengang und den Gesichtskanal bis zur Höhe des ovalen Fensters. Entfernen Sie die Steigbügel vorsichtig mit einer Pinzette und legen Sie die ovale Fensternische frei. Bemerkenswert ist, dass es eine knöcherne Brücke zwischen der Crura des Steigbügels gibt, die als Crista stapedis bekannt ist.</li>
	<li>Öffnen Sie das Vestibül mit einem 1-mm-Diamantbohrer (siehe Materialtabelle) weiter, indem Sie das ovale Fenster entlang der Vorderseite des runden Fensters verlängern und darauf achten, dass 1-2 mm Cochlea-Knochen an der runden Fensternische anliegen (Abbildung 2D).</li>
	<li>Schließen Sie die Schläfenknochenschnitte ab, indem Sie die ovalen Fensterschnitte mit den Cochlektomieschnitten auf jeder Seite des runden Fensters verbinden. HINWEIS: Aufgrund der Zerbrechlichkeit des Cochlea-Knochens trägt die Erhaltung der Fossa tensor tympani in der Probe und die Vermeidung von Schnitten dazu bei, Cochlea-Knochenbrüche zu vermeiden, die sich bis zum RWM erstrecken und seine Integrität beeinträchtigen.</li>
	<li>Nehmen Sie die letzten Befestigungen am dichten Knochen der Schädelbasis neben dem inneren Gehörgang vor und rasieren Sie sie vorsichtig ab, um eine herausgeschnittene RWM-Probe zu erhalten (Abbildung 3A).</li>
</ol>

Meerschweinchen-Membran-Explantation mit rundem Fenster

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</ol>

Die Autoren haben keine Angaben zu machen.

Bei der lokalen Verabreichung von Medikamenten an das Ohr ist das RWM der primäre Durchgangsweg für Therapeutika, um das Innenohr zu erreichen. Ein genaues und zuverlässiges Tischmodell ist erforderlich, um Transportmechanismen und Permeabilität in neuartigen Verabreichungsvehikeln und für die Arzneimittelentwicklung besser zu verstehen. In dieser Studie zeigen wir, dass die RWM-Explantation von Meerschweinchen ein praktikables und zuverlässiges Verfahren ist, um systematische Untersuchungen von Arzneimittel-Membran-Wechselwirkungen zu ermöglichen. Lundman et al. und Kelso et al. beschrieben zuvor unter Verwendung eines ähnlichen RWM-Permeabilitätsmodells 2,16; Die spezifischen Schritte der chirurgischen Extraktion wurden jedoch bisher nicht detailliert beschrieben, und die Zerbrechlichkeit des Cochlea-Knochens und die komplexe Anatomie stellten eine Herausforderung für die konsistente En-bloc-Entnahme intakter RWMs dar.
Das Meerschweinchen RWM befindet sich am Ende der Scala tympani der Cochlea und ist von einer dünnen Schicht Cochlea-Knochen umgeben. Ein Bruch dieser knöchernen Struktur während des Explantationsprozesses kann zu einer unbrauchbaren Probe führen, da das RWM dazu neigt, wegzureißen, wenn der umgebende Cochlea-Knochen nicht intakt bleibt. Unsere Gruppe stellte fest, dass Frakturen am häufigsten beim Bohren in der Nähe der Verbindung zwischen dem hochdichten Schädelbasisknochen und der brüchigen Cochlea auftraten, da der Übergang in der Knochendichte die Wahrscheinlichkeit einer Frakturausbreitung durch das runde Fenster erhöhte. Aus diesem Grund wird vermutet, dass die Beibehaltung des dichteren Knochens der Fossa tensor tympani, der in unmittelbarer Nähe des RW an der Cochlea befestigt ist, den Ertrag der Probenernte erhöht, insbesondere bei älteren Tieren. Eine Störung des Knochens kann auch während der Entfernung des Cochlea-Inhalts auftreten. Es muss darauf geachtet werden, dass die knöcherne Spirallamina mit minimaler Manipulation des umgebenden Cochlea-Knochens sanft entfernt wird.
Ein wichtiges Detail, das bei diesem Modell zu berücksichtigen ist, ist die Lebensfähigkeit des RWM nach der Explantation. Frühere Gruppen haben vorgeschlagen, dass die RWM von Säugetieren nach der Extraktion 24-48 Stunden lang lebensfähig bleibt17. Die vorliegende Studie hat diese Ergebnisse widergespiegelt; konsistente Transportstudien und histologische Analysen, die intakte Zellstrukturen nachweisen (Abbildung 2A), haben beide die Lebensfähigkeit des Meerschweinchen-RWM zum Zeitpunkt der Experimente unterstützt. Um die allgemeine Gesundheit der entnommenen Probe zu erhalten, wird das RWM extrahiert und innerhalb von 3 Stunden nach der Euthanasie eingebettet.
Bei der Untersuchung der Arzneimittelpharmakokinetik über das RWM in vivo gibt es nach wie vor erhebliche technische Schwierigkeiten bei der Messung der perilymphatischen Verteilung und Konzentration1. Änderungen der intratympanalen Verabreichungsmethoden und der applizierten Menge haben zu unterschiedlichen therapeutischen Ergebnissen geführt. Diese Schwierigkeiten werden durch die komplexe Strömungsdynamik innerhalb des Labyrinths sowie durch den unregelmäßigen Austritt von injiziertem Material durch die Eustachische Röhre noch verschärft. Die beschriebene Explantationsmethode ermöglicht die isolierte Untersuchung des RWM und der Faktoren, die seine Permeabilität als ex vivo-Modell beeinflussen. Darüber hinaus ermöglicht das Explantat auch die direkte Abfrage und Visualisierung verschiedener Verfahren, die derzeit zur Erhöhung der RWM-Permeabilität eingesetzt werden, wie z. B. Ultraschall-Mikrobläschen18 und chemisch induzierte junktionale Modulation19. Zukünftige Studien zu spezifischen Endozytosemechanismen, die an der Verabreichung von Medikamenten beteiligt sind, würden ebenfalls von diesem Tischmodell profitieren.

Für die Behandlung von Schallempfindungsschwerhörigkeit sind neuartige Klassen von Therapeutika entstanden. Die Translation dieser Therapeutika in klinische Populationen ist durch sichere und wirksame Transportwege in das Innenohr begrenzt. Aktuelle Methoden der In-vivo-Verabreichung in Tierversuchen beruhen entweder auf der Fenestration in das Innenohr oder auf der Diffusion durch die Rundfenstermembran (RWM), eine nicht-knöcherne Barriere, die den Mittelohrraum von der Cochlea trennt1.
Chirurgische Fenestration und Mikroinjektion in das Innenohr sind beide invasiv und können Risiken für die verbleibende Innenohrfunktiondarstellen 2. Daher ist das RWM ein wichtiger Weg für die lokale Arzneimittelabgabe, und Meerschweinchen sind das primäre präklinische Tiermodell, das zur Untersuchung der lokalen Arzneimittelpharmakokinetik im RWM und im Innenohr für die pharmazeutische Entwicklung verwendet wird 3,4. Obwohl das Meerschweinchen-RWM dünner ist als das menschliche RWM, hat es eine identische dreischichtige Struktur. Es hat einen Durchmesser von etwa 1 mm, eine Dicke von 15 bis 25 μm und besteht aus zwei Epithelzellschichten, die eine Bindegewebsschicht5 umgeben. Die dem Mittelohr zugewandte Epithelschicht ist dicht gepackt und über Tight Junctions verbunden, während die dem Innenohr und der Scala tympani zugewandte Schicht eine lockerere Architektur aufweist und keine signifikanten interzellulären Adhäsionen aufweist.
Aktuelle präklinische Studien zur Untersuchung der Arzneimittelpermeabilität beim Meerschweinchen-RWM beruhen auf In-vivo-Mittelohrinjektionen mit anschließender Probenahme der Perilymphflüssigkeit im Innenohr, was eine spezifische Untersuchung des RWM-Transports nicht zulässt 6,7. Fragmente von RWM-Explantaten wurden in präklinischen Studien verwendet, sind jedoch aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit und geringen Größe nicht für systematische, mikrofluidische Untersuchungen des Arzneimittel- und Fahrzeugtransports geeignet, die eine wasserdichte Abdichtung über das RWM2 erfordern. Andere Gruppen haben In-vitro-Modelle mit kultivierten menschlichen Epithelzellen verwendet, um sich dem RWM 8,9,10 anzunähern. Die meisten dieser Konstrukte konzentrieren sich jedoch ausschließlich auf die äußere Epithelschicht und erfassen nicht die Komplexität der nativen Gewebearchitektur. Für ein detaillierteres Verständnis der Transportmechanismen im RWM sind gezielte Ex-vivo-Studien erforderlich.
In dieser Studie demonstrieren wir die Explantation eines Meerschweinchen-RWM mit umgebender knöcherner Unterstützung, um die Membranintegrität zu erhalten, und veranschaulichen ihre Verwendung in einem experimentellen Paradigma, das für die spezifische Untersuchung des RWM-Transports von Medikamententrägerfahrzeugen entwickelt wurde.

<table><tbody><tr><td>1 mm Diamant-Kugelbohrer</td><td>Anspach</td><td>1SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diamant-Kugelbohrer</td><td>Anspach</td><td>2SD-G1</td><td></td></tr><tr><td>6 mm Diamant-Kugelbohrer</td><td>Anspach</td><td>6D-G1</td><td></td></tr><tr><td>ANSPACH EMAX 2 Plus System</td><td>Anspach</td><td>EMAX2PLUS</td><td>Jedes Bohrsystem zum Knochenschneiden funktioniert</td></tr><tr><td>BD Eclipse Nadel 27 G x 1/2 Zoll mit abnehmbarer 1 mL BD Luer-Lok Spritze</td><td>Becton, Dickinson und Co.&nbsp;</td><td>382903057894</td><td>beliebiger 27-28 g Nadel</td></tr><tr><td>Gorilla Epoxy</td><td>Gorilla</td><td>4200101</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-CAST</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr></tbody></table>

meerschweinchen-rundfenstermembran-explantation für ex-vivo-studien

Guinea Pig Round Window Membrane Explantation for Ex Vivo Studies

Die effiziente und minimalinvasive Verabreichung von Medikamenten an das Innenohr ist eine große Herausforderung. Die runde Fenstermembran (RWM) ist als einer der wenigen Eintrittspunkte in das Innenohr zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt geworden. Aufgrund der Komplexität der Isolierung des RWM bleibt unser Verständnis seiner Pharmakokinetik jedoch begrenzt. Das RWM besteht aus drei verschiedenen Schichten: dem äußeren Epithel, der mittleren Bindegewebsschicht und der inneren Epithelschicht, die jeweils potenziell einzigartige Verabreichungseigenschaften besitzen.
Aktuelle Modelle zur Untersuchung des Transports durch das RWM verwenden In-vivo-Tiermodelle oder Ex-vivo-RWM-Modelle, die auf Zellkulturen oder Membranfragmenten basieren. Meerschweinchen dienen als validiertes präklinisches Modell für die Untersuchung der Arzneimittelpharmakokinetik im Innenohr und sind ein wichtiges Tiermodell für die translationale Entwicklung von Verabreichungsvehikeln an die Cochlea. In dieser Studie beschreiben wir einen Ansatz zur Explantation eines Meerschweinchen-RWM mit umgebendem Cochlea-Knochen für Experimente zur Medikamentenverabreichung auf dem Labortisch. Diese Methode ermöglicht die Beibehaltung der nativen RWM-Architektur und kann eine realistischere Darstellung von Transporthindernissen liefern als aktuelle Tischmodelle.

Wie in Abbildung 3A gezeigt, ermöglicht diese Methode die Explantation der intakten Meerschweinchen-Rundfenstermembran mit einem umgebenden Ring aus starrem Knochen. Das RWM sollte umlaufend vollständig mit dem knöchernen Anulus verbunden sein. Frakturen des Cochlea-Knochens sollten nicht geschätzt werden. Im Vergleich zu menschlichen Rundfensterproben hat Meerschweinchen-RWM keine darüber liegende Pseudomembran. Darüber hinaus gibt es im Gegensatz zum Menschen eine knöcherne Brücke zwischen der Krura des Meerschweinchen-Steigbügels, die vor der Extraktion des Steigbügelaufbaus gebrochen und entfernt werden muss. Die histologische Analyse (Abbildung 3B) des repräsentativen RWM zeigt eine klare dreischichtige Epithelstruktur mit einer angrenzenden, intakten runden Fensternische.
Aus technischer Sicht gibt es zwei entscheidende Schritte. Erstens ist es bei der Cochektomie in Schritt 2.7 wichtig, den Äquator des Bohrers anstelle der Spitze zu verwenden, um den Schnitt durchzuführen, da Zittern an der Gratspitze zu traumatischen Frakturen im Cochlea-Knochen führen kann, die sich bis zur runden Fenstermembran erstrecken können. Zweitens ist es wichtig, den inneren Gehörgang vollständig aufzubohren, da dies die vollständige Entfernung des Cochlea-Nervs und eine einfachere Dissektion der knöchernen Spirallamina ermöglicht, was zu einem einheitlichen Hohlraum auf der intracochleären Seite für die experimentelle Probenentnahme führt (Abbildung 2C).
Nach erfolgreicher Extraktion des RWM nutzte unsere Gruppe eine modifizierte Ussing-Kammer, um die pharmakokinetischen Eigenschaften der Membran zu bewerten. Die modifizierte Ussing-Kammer wurde von anderen Gruppen in Trommelfell- und Rundfenstermembranen sowie Netzhautgewebe validiert, um die Transporteigenschaften von Epithelmembranen zu bewerten14,15. Dieses 3D-gedruckte Gerät wurde mit Poly-Jet Vero konstruiert und besteht aus zwei dreieckigen Basisstücken mit jeweils einer 400-μl-Flüssigkeitskammer (Abbildung 3). Der knöcherne Rand des RWM wird mit 2-komponentigem Epoxidharz (Gorilla, siehe Materialtabelle) an der Basis befestigt, gefolgt von Silikondichtmittel (siehe Materialtabelle), um eine wasserdichte Abdichtung zu gewährleisten (Abbildung 4). Es wird sorgfältig darauf geachtet, dass kein Epoxid oder Dichtmittel mit der Membran in Kontakt kommt. Nachdem das RWM eingeklemmt ist, werden die beiden Sockel dann mit Epoxidharz zusammengeklebt. Während der Transportexperimente wird die Beladung (Mittelohr zugewandt) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt, die das Verabreichungsvehikel (oder ein beliebiges Molekül) enthält, und die Probenahmekammer (Scala tympani zugewandt) wird nur mit PBS gefüllt. In regelmäßigen Zeitabständen wird Flüssigkeit aus der Probenahmekammer vollständig abgesaugt und durch frisches PBS ersetzt.
Während jedes Experiments werden Qualitätskontrollmaßnahmen ergriffen, um sicherzustellen, dass sowohl eine wasserdichte Abdichtung um die Probe innerhalb der Apparatur als auch eine vollständig intakte Membran ohne Mikroperforationen vorhanden ist. Repräsentative Ergebnisse mit einer braunen Nanopartikellösung mit Eisenkern sind unten dargestellt. Die quantitative Überprüfung einer wasserdichten Versiegelung erfolgt durch Ansaugen des gesamten Volumens der Probenahmekammer während jedes Probenahmeintervalls; Wenn Flüssigkeit aus der Probenahmekammer austritt, würde dies zu weniger als dem vollen Aspirationsvolumen führen. Am Ende jedes Versuchs sollte auch das Flüssigkeitsvolumen in der Ladekammer gleich bleiben. Da unsere Zielflüssigkeit eine braune Farbe hat, ist sie im Falle eines Lecks auch gut sichtbar.
Um sicherzustellen, dass kein Leck in der Membran auftritt, wurden mehrere Ansätze verfolgt. Zunächst werden alle in dieser Studie verwendeten RWM-Proben sofort extrahiert, und Licht-, Konfokal- und Elektronenmikroskopiebilder bestätigen intakte Zell- und Membranstrukturen ohne Mikroperforationen (Abbildung 3A, B). Zweitens wurden in einer Teilmenge von RWM-Proben absichtlich Mikroperforationen erzeugt, um den Effekt auf die Abgabe von Nanopartikeln zu vergleichen. Die Sichtprüfung des Probenahme- und Laderaumaspirats dient als weitere Bestätigung der Probenintegrität und der wasserdichten Befestigung. Bei RWM mit Perforationen kommt es zu einer schnellen Äquilibrierung der Lade- und Probenahmekammer, die durch einen deutlichen Farbwechsel beobachtet werden kann (Ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der Transport in mikroperforierten RWMs höher war als die maximale Varianz, die in intakten Membranen beobachtet wurde (Ergänzende Abbildung 2). Zusammen dienen diese als Qualitätskontrollmechanismen für die Integrität der wasserdichten Dichtung, die die Probe umgibt, sowie des RWM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig01.jpg"> Abbildung 1: Präoperatives Bild des Schläfenbeins des Meerschweinchens. Die Trommelfellbulla, der äußere Gehörgang und der Gesichtskanal (*) sind in diesem präoperativen Bild des Schläfenbeins des Meerschweinchens dargestellt. Maßstabsleiste = 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig02.jpg"> Abbildung 2: Intraoperative Bilder. Intraoperative Bilder, die die Beziehung zwischen der runden Fenstermembran und dem Incus (*), der Cochlea (**), dem Steigbügel (†) und dem dekomprimierten inneren Gehörgang (‡) zeigen. Schattierte Bereiche zeigen Teile der Probe an, die entfernt werden. (A) Meerschweinchen-Mittelohrhöhle nach Entfernung des Trommelfells und des Gesichtsnervs (Schritt 2.3). (B) Mittelohrhöhle nach Dekompression des Tensor-Trommelfellkanals (Schritt 2.6). (C) Basale Ansicht der RWM nach Cochleostomie und Entfernung des Innenohrinhalts (Schritt 2.11). (D) Ansicht des RWM nach Entfernung des Steigbügels und Identifizierung des Vestibüls (Schritt 2.13). Maßstabsleiste = A,B (1 cm); C,D (5 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig03.jpg"> Abbildung 3: Endgültige RWM-Probe und Histologie. (A) Meerschweinchen-RWM-Bruttoprobe mit knöchernem Anulus. Maßstabsbalken = 1 cm. (B) Die Histologie der explantierten Meerschweinchen-Rundfenstermembran zeigt eine intakte dreischichtige Struktur. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65816/65816fig04.jpg"> Abbildung 4: Mikrofluidische Vorrichtung für Transmembrantransportexperimente. (A) Diagramm der mikrofluidischen Vorrichtung, die für Transmembrantransportexperimente verwendet wird. (B,C) Gedrucktes mikrofluidisches Gerät für die Experimente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/65816fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Beladung und Probenahme des Kammerinhalts über ein 5-stündiges Eisenkern-Nanopartikel-Verabreichungsexperiment. (A) Die Ladekammer mit intaktem RWM zeigt eine allmähliche Abnahme der Farbintensität, wenn die Konzentration der Nanopartikel abnimmt. (B) Die Probenahmekammer des intakten RWM zeigt eine stabile Färbung im Laufe der Zeit, die mit einer geringen Nanopartikelabgabe übereinstimmt. (C) Die Ladekammer aus perforiertem RWM zeigt eine schnelle Abnahme der Farbintensität, wenn sich der Inhalt mit der Probenahmekammer ausgleicht. (D) Die Probenahmekammer aus perforiertem RWM zeigt eine allmähliche Farbzunahme im Laufe der Zeit, die mit einer hohen Nanopartikelabgabe übereinstimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Repräsentative Transportergebnisse für die Abgabe von Nanopartikeln. Repräsentative Transportergebnisse für die Abgabe von Nanopartikeln (Fe3O4 Kern mit Polyethylenglykolbeschichtung, mittlerer Radius von 77 nm) über Meerschweinchen-RWM, sowohl intakt als auch mit Perforationen (Mittelwert ± SD, n ≥ 3 RWM-Experimenten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65816/Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Explantation der Rundfenstermembran aus Schläfenknochen von Meerschweinchen, die eine wertvolle Ressource für Ex-vivo-Studien darstellt.

Meerschweinchen-Rundfenstermembran-Explantation für Ex-vivo-Studien

Efficient and minimally invasive drug delivery to the inner ear is a significant challenge. The round window membrane (RWM), being one of the few entry ...

Unsere Gruppe untersucht Medikamente und Medikamententräger zur Behandlung von Innenohrerkrankungen wie Hörverlust. Die runde Fenstermembran ist die kritische Barriere, die verhindert, dass lokal applizierte Medikamente in die Cochlea gelangen, und wir arbeiten derzeit daran, zu verstehen, wie Nanopartikel-Verabreichungsvehikel so konstruiert werden können, dass sie diese Barriere passieren. Das Verständnis, wie die Rundfenstermembran in Bezug auf den Wirkstofftransport funktioniert, ist entscheidend für die Entwicklung effektiver Strategien zur Verabreichung von Medikamenten an das Ohr.Meerschweinchen ist ein wichtiges präklinisches Tiermodell für die Untersuchung der Arzneimittelabgabe an das Ohr. Die Isolierung dieser fragilen Membran, die nur 17 Mikrometer dick ist, für Studien zum Wirkstofftransport bleibt jedoch eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode zur Extraktion der Meerschweinchen-Rundfenstermembran, die effiziente Laborstudien zum Drogentransport ermöglicht.Aktuelle Untersuchungen zur Wirkstoffabgabe in das innere Jahr stützen sich hauptsächlich auf experimentelle In-vivo-Modelle, gefolgt von Perilymphproben, die keine spezifische und gezielte Untersuchung der Transportmechanismen von Rundfenstermembranen ermöglichen. In dieser Studie demonstrieren wir die Extraktion der Meerschweinchen-Rundfenstermembran mit umgebender knöcherner Unterstützung. Diese Methode bewahrt die Integrität der nativen Gewebearchitektur und ermöglicht präzise und gezielte Untersuchungen der Wirkstoffabgabe über die runde Fenstermembran.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt, wie man chirurgisch behindern das Meerschweinchen ist Ductus endolymphaticus zu endolymphatischen Hydrops zu produzieren.

Chirurgische Induktion von Endolymphatischer Hydrops durch Obliteration des Ductus endolymphaticus

In diesem Video beschreiben wir eine Technik zur Isolierung von Iris- und retinalen Pigmentepithelzellen aus Schweineaugen, um ihre Primärkulturen für in vivo und ex vivo Studien zu erhalten. Diese Pigmentzellen könnten genetisch verändert werden, um regenerative Ansätze zur Behandlung von Augenerkrankungen zu untersuchen.

Isolierung von IPE- und RPE-Zellen: Eine Technik zur Gewinnung pigmentierter Epithelzellen aus isoliertem Schweineauge

In diesem Video beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren zur Extraktion von bronchiolärem Gewebe aus entnommener Schweinelunge. Das ex vivo bronchioläre Gewebe könnte zur Entwicklung von Infektionsmodellen für die Untersuchung chronischer Lungeninfektionen verwendet werden.

Extraktion von bronchiolärem Gewebe von Schweinen: Ein Verfahren zur Präparierung von bronchiolären Gewebeschnitten aus der Lunge von Schweinen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Induktion der linken Herzkammer Cryoinjury gefolgt von der Implantation eines Herzmuskels Patches, Menschliche iPS-Zellen Herzzellen in einem Meerschweinchen-Modell abgeleitet.

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Dieser Artikel zeigt einen außerduralen Ansatz, um den Meerschweinchen-Endolymphatic-Sac auszulöschen und den endolymphatischen Kanal mit einem feinen Pick zu verletzen, um experimentelle endolymphatische Hydrops zu induzieren.

Ein überarbeiteter chirurgischer Ansatz zur Induzieren von endolymphatischen Hydrops im Meerschweinchen

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Transinfektion primärer Iris- und retinaler Pigmentepithelzellen aus verschiedenen Säugetieren (Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schweine und Rinder) vorgestellt. Die Methode eignet sich ideal, um okuläre Gentherapieansätze in verschiedenen Setups für Ex-vivo-Analysen und auf den Menschen übertragbare In-vivo-Studien zu untersuchen.

Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie

Die subretinale Implantation von retinalem Pigmentepithel (RPE) ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen. Die Leistung präklinischer Studien an großäugigen Tiermodellen bleibt jedoch eine Herausforderung. In diesem Bericht werden Leitlinien für die subretinale Transplantation von RPE auf einem Zellträger in Minischweine vorgestellt.

Subretinale Implantation von RPE auf einem Träger bei Minipigs: Leitlinien für präoperative Vorbereitungen, Operationstechniken und postoperative Versorgung

Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) ist der ideale Marker zur Beurteilung der Nierenfunktion. Die Standardmessmethode mit Inulininjektion mit serieller Blut- und Urinanalyse ist jedoch nicht praktikabel. Dieser Artikel beschreibt eine praktische Methode zur transdermalen Messung der GFR bei Ferkeln.

Transdermale Messung der glomerulären Filtrationsrate bei mechanisch belüfteten Ferkeln

Wir beschreiben eine einfache und effiziente Methode zur Isolierung von Zellen der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) aus den Augen junger pigmentierter Meerschweinchen. Dieses Verfahren ermöglicht molekularbiologische Folgeuntersuchungen am isolierten RPE, einschließlich Genexpressionsanalysen.

Isolierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus Meerschweinchenaugen

Diese Studie stellt eine skalierbare, zuverlässige und reproduzierbare Methode für wiederholte chronische kortikale Aufzeichnungen in einem Schweinemodell vor. Die Methode findet Anwendung in verschiedenen Bereichen der Neurowissenschaften, unter anderem in der Schmerzforschung und in der neurologischen Diagnostik.

Chronische Schädelfenstertechnik für wiederholte kortikale Aufzeichnungen während der Anästhesie bei Schweinen

Hier stellen wir eine detaillierte Methodik zur Isolierung der Netzhaut vom Mausauge für erweiterte ex vivo-Experimente zur Verfügung. Dieses Protokoll unterstreicht die Zugänglichkeit dieses technisch anspruchsvollen Ansatzes für Forscher, die die Forschungsmöglichkeiten nutzen möchten, die sich durch die In-situ-Haltung von retinalen Gliazellen in lebendem Gewebe bieten.

Ein ex vivo Explantatmodell zur Untersuchung von glialen Wechselwirkungen in der Netzhaut der Maus

Lernen Sie die Explantation der Rundfenstermembran aus Meerschweinchen-Schädeln für ex vivo Studien zur Arzneimittelentwicklung im Innenohr. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen von Wirkstofftransportmechanismen.

Meerschweinchen-Rundfenstermembran-Explantation für Ex-vivo-Studien

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