Entwicklung von Multiplex-Real-Time-RT-qPCR-Assays zum Nachweis von SARS-CoV-2, Influenza A/B und MERS-CoV

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, einen Multiplex-Ansatz für den gleichzeitigen Nachweis von häufig zirkulierenden Atemwegsviren wie SARS-CoV-2, MERS, Influenza A und Influenza B zu verwalten. Zu den vorherrschenden Technologien, die die Fortschritte in unserem Bereich vorantreiben, gehören CRISPR, Lateral-Flow-Amino-Assays, papierbasierte biomolekulare Sensoren, Sherlock-Tests in einem Topf, DNA-Aptamere und Multiplex-RT-qPCR, die in eine schleifenvermittelte isotherme Amplifikation integriert sind. LAMPE. Die Multiplex-RT-qPCR ist jedoch die empfindlichste, gebräuchlichste und der Goldstandard für die Diagnose verschiedener Viren. Die aktuelle experimentelle Herausforderung besteht darin, ein Protokoll zu etablieren, mit dem RNA-Kopien von nur 10 Kopien nachgewiesen werden können.

Für den Assay haben wir ein hauseigenes RT-qPCR-Kit verwendet, das zeit- und kosteneffizient ist. Bereiten Sie zunächst den 2x Puffer für die RT-qPCR in DNAs/RNAs-freiem Wasser vor Lagern Sie den Puffer bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Mischen Sie anschließend die Primer und die Sonden in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Füllen Sie das Volumen mit Elutionspuffer auf und lagern Sie das Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Enzymmischung mit Taq-Polymerase und MMLV-RT in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis vor. Füllen Sie das Volumen mit Taq-Polymerase-Speicherpuffer auf.

Resuspendieren Sie nun die viralen synthetischen RNAs in separaten Röhrchen mit 100 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer, um Vorräte von 10 bis zur sechsten RNA-Kopie pro Mikroliter herzustellen. Zum Mischen der Virusbestände werden je fünf Mikroliter SARS-CoV-2, Influenza A und B auf 50 Mikroliter Tris-EDTA-Puffer gegeben. Mischen Sie auf ähnliche Weise SARS-CoV-2 und MERS-CoV, um einen zweiten Virusmix zu erhalten.

Verdünnen Sie beide Mischungen um das Zehnfache, um eine endgültige Verdünnung von 10 RNA-Kopien pro Mikroliter zu erhalten. In jede Vertiefung einer 96-Well-Platte pipettieren Sie 2x Puffer, Primer, Enzym, DNAs/RNAs-freies Wasser und die entsprechenden RNA-Mischungen. Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebeplatte.

Zentrifugieren Sie dann die Platte eine Minute lang, um die Flüssigkeit am Boden der Vertiefung zu sammeln. Als nächstes programmieren Sie das PCR-Gerät so, dass es den schnellen 96-Well-Blocktyp akzeptiert, wobei der experimentelle Typ auf die Standardkurve eingestellt ist. Legen Sie die Reagenzien auf TaqMan-Reagenzien fest, und wählen Sie die Standardlaufeigenschaften aus.

Definieren Sie die Genziele und den Reporterfarbstoff. Definieren Sie dann die Probennamen für jede zu testende Reaktion und ordnen Sie dem Plattenlayout Ziele und Proben zu. Geben Sie nun das Zyklusprogramm in das Gerät ein.

Übertragen Sie die Platte in der richtigen Ausrichtung an die Echtzeit-QPCR-Maschine und drücken Sie Lauf, um den Zyklus zu starten. Wählen Sie den Dateispeicherort aus, an dem die experimentellen Daten gespeichert werden sollen. Untersuchen Sie dann die Amplifikationsdiagramme, die vom QPCR-Programm bereitgestellt werden.

Die beiden entwickelten Kits waren in der Lage, alle drei Zielgene gleichzeitig erfolgreich zu amplifizieren, mit nur 10 RNA-Kopien pro Reaktion. Die Amplifikationseffizienzen für alle viralen Titrationen lagen bei über 99%