Untersuchung der Initiierung des Zelltods mit einem digitalen Mikroskop
10. November 2023
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der Rate der programmierten Zelltodinitiierung vor, indem wir inokulierte Blätter nach der Induktion des Zelltods kontinuierlich abbilden.
Zu Beginn werden die virusinfizierten Kartoffelpflanzen in eine Wachstumskammer bei 22 Grad Celsius gebracht. Wählen Sie eine Pflanze für die Beobachtung aus und verwenden Sie Klebeband, um das zweite inokulierte Blatt vollständig zu immobilisieren. Schließen Sie als Nächstes das Digitalmikroskop an den Computer an und starten Sie die Bilderfassungssoftware.
Legen Sie das Blatt unter das Mikroskop. Fokussieren Sie dann mit dem Einstellrad auf die Oberfläche des Blattes. Um die Kameraeinstellungen anzupassen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Einstellungen".
Stellen Sie nun die Helligkeit auf 64, den Kontrast auf 14 und den Farbton auf Null. Passen Sie als Nächstes den Weißabgleich an und stellen Sie dann die Sättigung auf 47, die Schärfe auf Null und das Gamma auf Fünf. Klicken Sie auf das Symbol für die Bildaufnahme und wählen Sie die Option Zeitraffervideo.
Legen Sie als Nächstes die Bilderfassung für insgesamt 24 Stunden alle 15 Minuten fest. Drücken Sie die Starttaste, um die Bildaufnahme zu starten. Um die aufgenommenen Bilder zu speichern, wählen Sie alle Bilder aus und klicken Sie auf das Symbol "Speichern".
Wählen Sie nun die Exportoptionen aus und stellen Sie dann die Punkte pro Zoll auf das Maximum ein. Löschen Sie nach dem Speichern alle Bilder aus dem Programm. Um die Bilder zu bearbeiten, starten Sie eine Bearbeitungssoftware wie ImageJ.
Klicken Sie auf Datei, wählen Sie dann Importieren und wählen Sie Bildsequenz, um die Zeitsequenzen von Bildern aus einem einzelnen Sichtfeld zu importieren. Fügen Sie den Pfad des Verzeichnisses der gespeicherten Bilder ein und drücken Sie OK. Sobald die Konvertierung abgeschlossen ist, startet ImageJ automatisch einen internen Videoplayer, der das fertige Video anzeigt.
Klicken Sie auf Datei, speichern Sie unter und wählen Sie das AVI-Format aus, um die Videodatei zu exportieren. Wenn sich ein kleines Fenster öffnet, stellen Sie die Bildrate auf 0,3 FPS ein und drücken Sie dann OK, um das Video als AVI-Datei zu speichern. Drei bis vier Wochen alte inokulierte Kartoffelpflanzen mit mindestens drei bis vier voll entwickelten Blättern wurden für die digital-mikroskopische Analyse verwendet.
Derselbe Bereich auf dem inokulierten Blatt wurde in 15-Minuten-Intervallen beobachtet, um das Auftreten und die Ausdehnung der Läsion im Laufe der Zeit zu bestimmen. Nach 14 Stunden Beobachtung war keine Läsion sichtbar. Etwa 90 Minuten später wurde eine sichtbare Läsion aufgezeichnet.
Die Läsion begann sich zwei Stunden später auszudehnen und dehnte sich in den nächsten achteinhalb Stunden weiter aus.
Übersicht
Diese Studie untersucht die Rate der Einleitung des programmierten Zelltods in Kartoffelpflanzen mithilfe eines kontinuierlichen Bildgebungsprotokolls zur Beobachtung inoculierter Blätter. Die Methode ermöglicht eine präzise Bestimmung des Zeitpunkts der Läsionenbildung und liefert Erkenntnisse über die Dynamik der verdeckten Hypersensitiven Antwort als Resistenzmechanismus.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Einleitung des Zelltods
- Überempfindliche Reaktion
- Pflanzenbiologie
Hintergrund
- Programmierter Zelltod ist ein lebenswichtiger Abwehrmechanismus bei Pflanzen.
- Die Studie nutzt Kartoffelpflanzen als Modellsystem.
- Die Bestimmung des Zeitpunkts des Zelltods kann das Verständnis der Pflanzenimmunität verbessern.
Verwendete Methoden
- Kontinuierliche Bildgebung von inoculierten Blättern
- Verwendung von Kartoffelpflanzen als biologisches Modell
- Mikroskopische Analyse zur Echtzeitbeobachtung der Läsionsentwicklung
Hauptergebnisse
- Die Läsionen wurden etwa 90 Minuten nach der ersten Inokulation sichtbar.
- Die Ausbreitung der Läsionen wurde über einen Zeitraum von 8,5 Stunden verfolgt.
- Die Methode ermöglicht eine zeitraffende Aufzeichnung des Krankheitsverlaufs mit hoher Auflösung.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht eine effektive Quantifizierung der Zelltod-Initiierungsrate bei Kartoffelpflanzen.
- Es bietet ein wertvolles Werkzeug für zukünftige Forschungen zu Pflanzenabwehrmechanismen gegen Pathogene.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine präzise Quantifizierung des Zelltodbeginns in Pflanzensystemen ermöglicht eine robuste Hypothesenprüfung für genetische und molekulare Determinanten der hypersensitiven Reaktion. Die hochauflösende digitale Mikroskopie trägt zu einer verlässlichen Identifizierung von Komponenten bei, die den programmierten Zelltod modulieren, und beeinflusst damit direkt die frühe Entdeckung und Zielvalidierung in der Pflanzenbiotechnologie. Diese Fähigkeit stärkt Portfolioentscheidungen, indem sie eine schnelle und reproduzierbare Bewertung der Funktion von Kandidatengenen in krankheitsrelevanten Systemen ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung genetischer und molekularer Faktoren, die die Einleitung des Zelltods beeinflussen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Resistenzgenen und Bestandteilen von Signalwegen.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem genetische Störungen mit phänotypischen Ergebnissen verknüpft werden.
- Steigert die Vorhersagesicherheit bei der Weiterentwicklung von Kandidatenzielen in Pipelines zur pflanzlichen Krankheitsresistenz.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte, quantitative Bildgebungsdaten für die Assay-Entwicklung.
- Ermöglicht reproduzierbare Messung der Läsionsinitiierung und Expansionsraten.
- Unterstützt Skalierbarkeit und Plattformwiederverwendung über verschiedene Pathosysteme hinweg mit geringen Protokollanpassungen.
- Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Wirkstoff- oder genetische Screens vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt phänotypische Messgrößen mit krankheitsrelevanten Mechanismen des programmierten Zelltods.
- Stellt eine lückenlose Übertragung von genetischen Entdeckungen bis zur präklinischen Validierung in Pflanzenmodellen sicher.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Resistenzmerkmalen oder Genveränderungen in Züchtungsprogrammen.
- Liefert mechanistische Erkenntnisse für die translationale Biomarkerentwicklung in der Forschung zur Pflanzenabwehr.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses digitale Mikroskopieprotokoll integriert sich in den frühen Kontinuum von der Entdeckung bis zur Validierung und ermöglicht eine schnelle Hypothesenprüfung sowie funktionelle Bewertung von Kandidatengenen oder Behandlungen in Pflanzensystemen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Überprüfung der Nullhypothese zur Genfunktion bei der Einleitung des Zelltods.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Daten zur Läsionsentstehung und -ausbreitung für die Bereitschaft des Assays.
- Analytik: Bietet zeitlich aufgelöste Messungen zum Vergleich genetischer oder behandelungsbedingter Zustände.
- Translationale Forschung: Verbindet Entdeckungen mit der präklinischen Validierung in krankheitsrelevanten Pflanzenmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen flexiblen, kosteneffizienten Bildgebungsworkflow, der an verschiedene Pathosysteme angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten bei der Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, skalierbare und reproduzierbare Bildgebungsdaten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffiziente Weiterentwicklung des Portfolio.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung genetischer oder molekularer Eingriffe in der Pflanzenforschung und -entwicklung.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Pflanzengewebekultur und der Bedienung digitaler Mikroskopie.
- Benötigt Zugang zu kontrollierten Wachstumskammern und Einrichtungen für Zeitrafferaufnahmen.
- Erfordert die Standardisierung von Bildaufnahmeintervallen und Analyseparametern über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann mit geringen Protokollanpassungen auf verschiedene Pflanzenarten und Pathosysteme übertragen werden.
- Hängt von konstanten Umweltbedingungen für reproduzierbare Ergebnisse ab.
