ABCG5/G8-Kristallisation in einer lipidischen Bizellenumgebung für die Röntgenkristallographie
August 25th, 2023
Dieses Protokoll beschreibt einen Aufbau für die Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8. ABCG5/G8 wird für die Hängetropfenkristallisation in Bizellen rekonstituiert. Das Protokoll erfordert keine speziellen Materialien oder Substrate, so dass es in jedem Labor zur Bestimmung der Proteinstruktur durch Röntgenkristallographie zugänglich und einfach angepasst werden kann.
Hallo, mein Team untersucht die Art des Proteinverlusts über die Zellmembran, und wir schauen uns die Beziehung zur Medizin und Biologie an. Konkret betrachten wir ein bestimmtes Protein, das ATP benötigt, um seine Funktion zu steuern, und dann wird es ATP-bindender Kassettentransporter genannt. Insbesondere untersuchen wir ihre grundlegende Struktur-Funktions-Beziehung und nutzen diese dann, um viele chronische Krankheiten, insbesondere Herz-Kreislauf-Erkrankungen, zu verstehen.
Aufgrund der Komplexität der Reinigung der Membranproteine und ihrer Stabilität bei nativen Temperaturen ist die Gewinnung von 3D-Proteinkristallen die größte Herausforderung auf diesem Gebiet und schränkt auch die Anwendungen in der Wirkstoffforschung ein. Unser Team hat Methoden in der Kryo-EM und Röntgenkristallographie für die Strukturuntersuchung von Membrantransporterproteinen etabliert. Und zuvor hat unser Labor auch die Kristallstruktur des ersten humanen ABCG5/G8-obligaten Heterodimers aufgeklärt, sowohl im apo- als auch im cholesteringebundenen Zustand.
Unsere Ergebnisse können einen Durchbruch in der niedermolekularen Wirkstoffforschung oder der Umwidmung von Medikamenten bedeuten. Die Gewinnung von 3D-Proteinkristallen kann auch Soaking-Experimente zur Kokristallisation von Protein- und Ligandenkomplexen ermöglichen. Unser Labor zielt darauf ab, die molekularen Grundlagen der Lipiderkennung und -translokation durch ATP-abhängige Lipidtransporterproteine zu bestimmen.
Und wir wollen auch neue Methoden in der Wirkstoffentwicklung etablieren, um die molekulare Dynamik und strukturelle Aspekte von ABC-Transportern zu untersuchen.
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8 unter Verwendung von Bicellen für die Kristallisation mittels hängendem Tropfen. Der Ansatz ist so konzipiert, dass er unkompliziert und für verschiedene Laborumgebungen anpassbar ist und die Strukturbestimmung von Proteinen mittels Röntgenkristallographie erleichtert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Strukturbiologie
- Membrantransportproteine
Hintergrund
- ABCG5/G8 ist ein ATP-bindendes Kassettentransporter, der am Lipidtransport beteiligt ist.
- Das Verständnis seiner Struktur ist entscheidend für Erkenntnisse über chronische Krankheiten, insbesondere Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
- Herausforderungen bei der Reinigung von Membranproteinen behindern die Wirkstoffentdeckung.
- Frühere Studien haben die Kristallstruktur von ABCG5/G8 in verschiedenen Zuständen aufgeklärt.
Zweck der Studie
- Um die strukturelle Grundlage der Lipiderkennung und -translokation durch ABC-Transporter zu untersuchen.
- Um neue Methoden für die Wirkstoffentdeckung im Zusammenhang mit Membrantransportproteinen zu entwickeln.
- Um Kokristallisationsexperimente zum Studium von Protein-Ligand-Interaktionen zu ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Chemische Modifikation von Proteinfraktionen durch reduktive Methylierung.
- Verwendung von Nickel-NTA-Säulen zur Proteinreinigung.
- Vorbereitung einer B-Zell-Stammlösung für die Kristallisation.
- Hängende Tropfen-Dampfdiffusionsmethode für den Kristallisationsaufbau.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kristallisation von ABCG5/G8 innerhalb von ein bis zwei Wochen beobachtet.
- Kristalle, die für die Datenerfassung geeignet sind, maßen typischerweise 50 Mikrometer mal 100 Mikrometer mal 2 Mikrometer.
- Die Methodik ermöglicht weitere Studien zu Lipidinteraktionen und Arzneimittelentwicklung.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung von ABC-Transportern bei.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Struktur von ABCG5/G8.
- Die Erkenntnisse können Fortschritte in der Wirkstoffentdeckung für verwandte Krankheiten erleichtern.
- Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Erforschung der Dynamik von Lipidtransportmechanismen konzentrieren.
