ABCG5/G8-Kristallisation in einer lipidischen Bizellenumgebung für die Röntgenkristallographie
25. August 2023
Dieses Protokoll beschreibt einen Aufbau für die Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8. ABCG5/G8 wird für die Hängetropfenkristallisation in Bizellen rekonstituiert. Das Protokoll erfordert keine speziellen Materialien oder Substrate, so dass es in jedem Labor zur Bestimmung der Proteinstruktur durch Röntgenkristallographie zugänglich und einfach angepasst werden kann.
Hallo, mein Team untersucht die Art des Proteinverlusts über die Zellmembran, und wir schauen uns die Beziehung zur Medizin und Biologie an. Konkret betrachten wir ein bestimmtes Protein, das ATP benötigt, um seine Funktion zu steuern, und dann wird es ATP-bindender Kassettentransporter genannt. Insbesondere untersuchen wir ihre grundlegende Struktur-Funktions-Beziehung und nutzen diese dann, um viele chronische Krankheiten, insbesondere Herz-Kreislauf-Erkrankungen, zu verstehen.
Aufgrund der Komplexität der Reinigung der Membranproteine und ihrer Stabilität bei nativen Temperaturen ist die Gewinnung von 3D-Proteinkristallen die größte Herausforderung auf diesem Gebiet und schränkt auch die Anwendungen in der Wirkstoffforschung ein. Unser Team hat Methoden in der Kryo-EM und Röntgenkristallographie für die Strukturuntersuchung von Membrantransporterproteinen etabliert. Und zuvor hat unser Labor auch die Kristallstruktur des ersten humanen ABCG5/G8-obligaten Heterodimers aufgeklärt, sowohl im apo- als auch im cholesteringebundenen Zustand.
Unsere Ergebnisse können einen Durchbruch in der niedermolekularen Wirkstoffforschung oder der Umwidmung von Medikamenten bedeuten. Die Gewinnung von 3D-Proteinkristallen kann auch Soaking-Experimente zur Kokristallisation von Protein- und Ligandenkomplexen ermöglichen. Unser Labor zielt darauf ab, die molekularen Grundlagen der Lipiderkennung und -translokation durch ATP-abhängige Lipidtransporterproteine zu bestimmen.
Und wir wollen auch neue Methoden in der Wirkstoffentwicklung etablieren, um die molekulare Dynamik und strukturelle Aspekte von ABC-Transportern zu untersuchen.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8 unter Verwendung von Bicellen für die Hänge-Tropfen-Kristallisation. Der Ansatz ist so konzipiert, dass er einfach und an verschiedene Laborbedingungen anpassbar ist, um die Proteinstrukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie zu erleichtern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Strukturbiologie
- Membrantransportproteine
Hintergrund
- ABCG5/G8 ist ein ATP-bindendes Kassetten-Transportprotein, das an dem Lipidtransport beteiligt ist.
- Das Verständnis seiner Struktur ist entscheidend für Einblicke in chronische Erkrankungen, insbesondere kardiovaskuläre Erkrankungen.
- Herausforderungen bei der Reinigung von Membranproteinen behindern Bemühungen um Arzneimittelentdeckung.
- Frühere Studien haben die Kristallstruktur von ABCG5/G8 in verschiedenen Zuständen aufgeklärt.
Zweck der Studie
- Untersuchung der strukturellen Grundlagen der Lipiderkennung und -translokation durch ABC-Transporter.
- Entwicklung neuer Methoden für die Wirkstoffforschung im Zusammenhang mit Membrantransportproteinen.
- Ermöglichung von Cokristallisationsexperimenten zur Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen.
Verwendete Methoden
- Chemische Modifizierung von Proteinfraktionen durch reduktive Methylierung.
- Verwendung von Nickel-NTA-Säulen zur Proteinreinigung.
- Herstellung einer B-Zell-Stammlösung zur Kristallisation.
- Hängende-Tropfen-Verdampfungs-Diffusionsmethode zur Kristallisation.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Kristallisation von ABCG5/G8 wurde innerhalb von einer bis zwei Wochen beobachtet.
- Kristalle, die für die Datensammlung geeignet waren, wiesen typischerweise Maße von 50 Mikrometern mal 100 Mikrometern mal 2 Mikrometern auf.
- Die Methodik ermöglicht weitere Untersuchungen zu Lipid-Wechselwirkungen und der Arzneimittelentwicklung.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehung von ABC-Transportern bei.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Struktur von ABCG5/G8.
- Die Ergebnisse könnten Fortschritte bei der Arzneimittelentwicklung für verwandte Erkrankungen fördern.
- Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Erforschung der Dynamik von Lipidtransportmechanismen konzentrieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die hochauflösende Strukturaufklärung von ABCG5/G8 in einem lipidären Bikell-Milieu löst einen kritischen Engpass in der Arzneimittelforschung an Membranproteinen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung und unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken in portfoliobasierten Transporterprojekten. Eine zuverlässige Kristallisation von ABC-Transportern ermöglicht die strukturbasierte Ligandenentwicklung und beschleunigt Entscheidungen in der frühen Screening-Phase.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von ATP-abhängigen Lipidtransportmechanismen in atomarer Auflösung.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung, indem die native Proteinstruktur in Bicell-Umgebungen erhalten bleibt.
- Erleichtert die mechanistische Ent风险bewertung für Transporter-Ziele, die mit chronischen Erkrankungen assoziiert sind.
- Liefert strukturelle Vorlagen für eine hypothesengeleitete Portfolio-Priorisierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte Proteinkristalle, die für Liganden-Soaking- und Co-Kristallisationsstudien geeignet sind.
- Standardisiert die Membranproteinaufbereitung für reproduzierbare downstream-Screening-Workflows.
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen mittels Röntgenkristallographie.
- Unterstützt die skalierbare Assay-Entwicklung für auf Transporter abzielende Substanzbibliotheken.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Einordnung struktureller Erkenntnisse in die funktionelle Bedeutung von Transportproteinen für kardiovaskuläre Erkrankungen.
- Bietet Kontinuität von der molekularen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von Transportmodulatoren.
- Verringert das Übersetzungsrisiko, indem es biomarker- und mechanismusbasierte Studien unterstützt.
- Ermöglicht die gezielte Entwicklung präklinischer Modelle auf Grundlage der Struktur-Funktions-Beziehungen von Transportproteinen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese auf Bicellen basierende Kristallisationsmethode ist in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Forschung integriert.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen hinsichtlich der Funktion von ABC-Transportern.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare, hochwertige Kristalle für strukturbasierte Screenings und die Bewertung von Liganden.
- Analytik: Ermöglicht quantitative strukturelle Aussagen, um ligandengebundene und apo-Zustände zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Struktur mit krankheitsrelevanten Transporteraktivitäten und der Zuordnung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Kristallisation verschiedener Membranproteine in Wirkstoffentwicklungsprozessen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung von Transporterzielen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Kristallisation von Membranproteinen hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz in auf Transporter ausgerichteten Programmen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Transporterzielen und die Weiterentwicklung strukturgeleiteter Assets.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt Fachkenntnisse in der Reinigung und Kristallisation von Membranproteinen.
- Erfordert Zugang zu analytischer Infrastruktur für Röntgenbeugung und Proteincharakterisierung.
- Erfordert eine Standardisierung der Bicelle-Herstellung und Kristallisationsprotokolle über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Möglicherweise ist eine Anpassung an verschiedene Transporterfamilien oder Lipidzusammensetzungen erforderlich.
- Die Stabilität und Ausbeute des Proteins kann den Durchsatz und die Skalierbarkeit in einigen Systemen begrenzen.
