Chemische affinitätsbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Bioflüssigkeiten für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse
27. Oktober 2023
Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.
Wir arbeiten an der Entdeckung von extrazellulären Vesikel-basierten Biomarkern. Ein wichtiger Schritt besteht darin, sie effizient und selektiv zu isolieren. EVtrap, das auf der magnetischen Kügelchen-basierten Trennung basiert, kann uns wirklich helfen, indem es einen hohen Durchsatz bietet, einfach zu bedienen und insbesondere für klinische Anwendungen einfach ist.
Wir haben dieses Protokoll für die Entdeckung von Proteinen und Phosphoprotein-Biomarkern für verschiedene Krankheiten wie Brustkrebs, Nierenkrebs und Parkinson verwendet. Dieser Biomarker wird aus Bioflüssigkeit gewonnen. EVs können potenziell für Flüssigbiopsien verwendet werden, was die klinische Diagnose und die Behandlung weiter verbessern kann.
Derzeit sind die am häufigsten verwendeten Ansätze zur Isolierung extrazellulärer Vesikel die Ultrazentrifugation und die Fällung, aber diese Methoden sind auf die Co-Isolierung von Verunreinigungen beschränkt und haben auch eine geringe Effizienz. Unsere EVtrap-Methode wird also eine effektivere Möglichkeit zur Isolierung von Elektrofahrzeugen bieten, was eine reproduzierbarere und empfindlichere Methode ermöglicht und auch der nachgelagerten Analyse zugute kommt. Wir arbeiten an zwei Dingen.
Erstens entwickeln wir die Methoden und Protokolle für die Isolierung von Elektrofahrzeugen und eine nachgelagerte Analyse, insbesondere eine auf Massensicherungen basierende Analyse, weiter. Zweitens untersuchen wir aufgrund des Vorteils der EVtrap verschiedene Anwendungen im klinischen Bereich.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die effiziente Isolierung von urinären extrazellulären Vesikeln (EVs) mithilfe funktionalisierter magnetischer Mikrokügelchen. Außerdem werden nachfolgende Analysen wie Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik detailliert, die für die Entdeckung von Biomarkern unerlässlich sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biomarker-Entdeckung
- Extrazelluläre Vesikel
Hintergrund
- Extrazelluläre Vesikel sind wichtig für flüssige Biopsien.
- Sie können Einblicke in verschiedene Erkrankungen liefern.
- Eine effiziente Isolierung ist entscheidend für klinische Anwendungen.
- Proteine und Phosphoproteine aus Körperflüssigkeiten sind potenzielle Biomarker.
Zweck der Studie
- Biomarker-Entdeckung zu beschleunigen.
- EVs effizient und selektiv zu isolieren.
- Die klinische Diagnose und Therapie zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Isolierung von urinären extrazellulären Vesikeln mittels magnetischer Kügelchen.
- Western-Blot-Analyse zur Proteinanalyse.
- Proteomik und Phosphoproteomik zur Identifizierung von Biomarkern.
- Hochdurchsatzmethoden für klinische Anwendungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von EVs aus Körperflüssigkeiten.
- Identifizierung von Proteinen und Phosphoproteinen, die mit Krankheiten assoziiert sind.
- Nachgewiesenes Potenzial für Anwendungen der Flüssigbiopsie.
- Erleichterung der Entdeckung von Biomarkern für Krebserkrankungen und die Parkinson-Krankheit.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert die Effizienz der EV-Isolierung.
- Es unterstützt die Entdeckung klinisch relevanter Biomarker.
- Potenzial zur Verbesserung diagnostischer und therapeutischer Strategien.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die effiziente und selektive Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Bioflüssigkeiten stellt einen entscheidenden Wendepunkt für die entdeckungsbasierte Identifizierung von Biomarkern mittels Proteomik in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung dar. Dieses auf chemischer Affinität basierende Protokoll unter Verwendung magnetischer Partikel ermöglicht eine hochgradig reproduzierbare und ertragreiche Isolierung von EVs und unterstützt damit direkt quantitative proteomische und phosphoproteomische Analysen, die für die frühe Erkennung von Erkrankungen und die Validierung von Zielstrukturen unerlässlich sind. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in translationalen Biomarker-Pipelines und trägt zur risikoadjustierten Weiterentwicklung von Portfoliovorhaben bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine robuste Untersuchung krankheitsrelevanter Protein- und Phosphoproteinsignaturen aus patientenstammenden Körperflüssigkeiten.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung, indem hochwertige EV-Fracht für nachgeschaltete mechanistische Studien bereitgestellt wird.
- Erleichtert die biologische Entschärfung von Risiken durch reproduzierbare und quantitative molekulare Profilierung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert standardisierte, hochreine EV-Präparationen, die für quantitative Massenspektrometrie-Workflows geeignet sind.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit von Assays, indem Kontaminationen minimiert und die EV-Ausbeute maximiert wird.
- Ermöglicht die skalierbare Herstellung von EV-Proben für Hochdurchsatz-Screenings und die Wiederverwendung von Plattformen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ergänzt translationale Biomarker-Strategien, indem molekulare Echtzeitaufnahmen aus klinischen Körperflüssigkeiten gewonnen werden.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine konsistente Analyse des EV-Proteoms und Phosphoproteoms ermöglicht wird.
- Bietet eine mechanistische Risikominimierung für Biomarker-Kandidaten vor der klinischen Entwicklung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur EV-Isolierung integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckungsforschung und translationsorientierter Forschung und verbindet die Probenvorbereitung mit der quantitativen Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Überprüfung von Hypothesen und die Aufklärung von Signalwegen durch den Zugang zu molekularen Bestandteilen aus EVs.
- Screening: Stellt reproduzierbare, quantitative EV-Proben für die Entwicklung nachgeschalteter Assays und die Bewertung von Substanzen bereit.
- Analytik: Unterstützt die hochdurchsatzfähige, statistisch belastbare Messung der Häufigkeit von Proteinen und Phosphoproteinen unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Abstimmung und Kontinuität von Biomarkern von Patientenproben bis hin zu präklinischen Modellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte, skalierbare Kapazität zur Isolierung von EVs für vielfältige Forschungs- und Entwicklungsprogramme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Biomarker-Entdeckung.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Isolierung von extrazellulären Vesikeln für Proteomik-Analysen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz durch robuste molekulare Profilierung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Biomarker- und Therapiekandidaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Proteomik, Phosphoproteomik und der Biologie extrazellulärer Vesikel für eine optimale Durchführung und Dateninterpretation.
- Benötigt Zugang zu magnetbasierten Trennsystemen und hochauflösenden Massenspektrometrie-Plattformen.
- Setzt eine standardisierte Probenvorbereitung und analytische Protokolle über mehrere Arbeitsgruppen hinweg zur Reproduzierbarkeit voraus.
- Anpassbar an verschiedene Biofluid-Typen, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für unterschiedliche Matrizes.
- Die quantitative Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit hängt von strikter Einhaltung des Protokolls und analytischer Kalibrierung ab.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:47
Extracellular Vesicle (EV) Isolation from Human Urine Samples Using the EVtrap Approach
3:39
Preparation of Dried Extracellular Vesicle (EV) Sample for Proteomics and Phosphoproteomics Analysis
6:31
Proteome/Phosphoproteome Analysis of the Extracellular Vesicle (EV) Samples Using LC‐MS/MS
