Name: Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Lernen Sie die optimierte Multiplex-IHC-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe. Diese Methode reduziert Autofluoreszenz und Kanalübersprechen für präzise Bildgebung.

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Die Autoren möchten den Mitgliedern des Clinical Pathology Research Institute West China Hospital danken, die technische Leitlinien für eine qualitativ hochwertige Multiplex-Immunfluoreszenz und IHC-Verarbeitung beigesteuert haben. Dieses Protokoll wurde von der National Natural Science Foundation of China (82200078) unterstützt.

Das Protokoll ist nach den Richtlinien der Ethikkommission des West China Hospital, Sichuan University, China, genehmigt. Die Lungenkrebsgewebeproben wurden während der Operation im Zentrum für Lungenkrebs am West China Hospital entnommen, und von jedem Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.
1. Vorbereitung des Gewebeschnitts
<ol><li>FFPE-Vorbereitung<ol><li>Tauchen Sie klinisches Gewebe länger als 72 Stunden in neutrale Formalinlösung.</li>
		<li>Schließen Sie den Prozess der Dehydrierung des Gewebes mit Xylol und abgestuften alkoholischen Lösungen20 ab.</li>
		<li>Führen Sie eine manuelle Paraffineinbettung und Gewebeschnitte bei einer Schnittdicke von 4 μm durch. Verwenden Sie Adhäsionsmikroskop-Objektträger, um sicherzustellen, dass die Gewebescheiben nicht herausfallen.</li>
		<li>Die Objektträger im Backofen bei 65 °C 2 h backen, damit das Taschentuch und die Objektträger trocken sind. In einer Objektträgerbox bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbehandlung von Gewebeschnitten<ol><li>Die Gewebeobjektträger in einem Ofen bei 65 °C für 5 min vorbehandeln und dann nacheinander 2 x 15 min lang in Xylollösungen, 2 x 15 min in wasserfreie Ethanollösungen, 10 min 90%ige Ethanollösung, 10 min 85%ige Ethanollösung, 10 min 80%ige Ethanollösung und 10 min 75%ige Ethanollösung eintauchen. Anschließend werden die Objektträger 3 x 1 min lang mit sterilisiertem Wasser gewaschen. HINWEIS: Diese experimentelle Technik kann nur für FFPE-Gewebe verwendet werden, nicht für gefrorenes oder frisches Gewebe, da der mehrfache Hochtemperatur-Antigenreparaturprozess dazu führt, dass das Gewebe vom Objektträger fällt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Optimierung des Primärantikörpers
HINWEIS: Konventionelle IHC-Experimente wurden verwendet, um die Inkubationsbedingungen für einzelne Antikörper zu bestimmen, hauptsächlich einschließlich Antikörperkonzentration und Antigenreparaturbedingungen. Beachten Sie die Bedingungen in der Bedienungsanleitung für Antikörper.
<ol><li>Verwenden Sie eine Antikörperkonzentration, die etwas höher ist als der empfohlene Konzentrationsbereich und die empfohlenen Zwischenwerte.</li>
	<li>Optimieren Sie die Antigen-Retrieval-Pufferroutinen PH6 und PH9 entsprechend dem Ort der Proteinexpression. Verwenden Sie PH9 für Proteine, die im Zellkern exprimiert werden, und verwenden Sie entweder Routine (PH6 oder PH9) für andere Proteine.</li>
</ol>3. mIHC-Färbemethode
HINWEIS: Die opale mIHC-Färbung ist eine der verfügbaren mIHC-Methoden. Da in diesem experimentellen 5-Farben-Protokoll jede Gewebeprobe mit vier Antikörpern gefärbt werden muss, werden vier primäre Antikörperinkubationen, sekundäre Antikörperinkubationen und TSA-Signalamplifikations-chromogene Inkubationen sowie fünf Antigenrestaurationen benötigt. Schließlich werden eine 4'6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung und eine Anti-Fluoreszenz-Berstmittelversiegelung durchgeführt.
<ol><li>Vorbereitung des Hauptreagenzes HINWEIS: Bestimmen Sie die Menge des hinzuzufügenden Reagenzes entsprechend der Größe der Gewebeobjektträger. Verwenden Sie genügend Volumen, um den Gewebeschnitt vollständig zu bedecken (in der Regel 50-150 μl pro Objektträger). Die für das Experiment erforderlichen Arbeitslösungen werden wie folgt hergestellt:<ol><li>Arbeitslösung für Waschpuffer: 20x Waschpuffer bei 1:20 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen und bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>PH6-Puffer-Arbeitslösung: 100x PH6-Puffer bei 1:100 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Vor Gebrauch vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>PH9-Puffer-Arbeitslösung: 50x PH9-Puffer bei 1:50 mit doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Vor Gebrauch vorbereiten und bei Raumtemperatur lagern.</li>
		<li>Polymer HRP: Bereiten Sie diese gebrauchsfertige Lösung nur für Primärantikörper Kaninchen- und Mausursprung vor.</li>
		<li>Fluorophor-Arbeitslösung: Rekonstituieren Sie jedes Fluorophorpulver (außer Fluorophor 780) in 75 μl DMSO. Verdünnen Sie das Fluorophor vor jedem Eingriff in 1x Amplifikationsverdünnungsmittel bei 1:100. Entsorgen Sie alle nicht verwendeten Teile der Fluorophor-Arbeitslösung.</li>
		<li>Fluorophor 780 Arbeitslösung: Rekonstituieren Sie TSA-DIG in 75 μl DMSO und das Fluorophorpulver 780 in 300 μl doppelt destilliertem Wasser. Vor dem Eingriff TSA-DIG in 1x Amplifikationsverdünnungsmittel bei 1:100 und Fluorophor 780 mit Ab-Verdünnungsmittel bei 1:25 verdünnen.</li>
		<li>DAPI-Arbeitslösung: Verdünnen Sie die DAPI-Lösung bei 1:50 mit doppelt destilliertem Wasser oder PBS. Vor Gebrauch vorbereiten und bei 4 °C nicht länger als 48 h lagern. ANMERKUNG. Waschen Sie die Objektträger während dieses Multilabel-Fluoreszenzfärbeexperiments nur mit doppelt destilliertem Wasser und frisch zubereiteter Waschpuffer-Arbeitslösung. Gewebeschnitte dürfen nicht mit Leitungswasser in Berührung kommen; Verunreinigungen im Leitungswasser können an den Gewebeschnitten haften bleiben und Autofluoreszenz verursachen. Halten Sie die Proben während des gesamten Experiments von Licht fern.</li>
	</ol></li>
	<li>Antigen-Rückgewinnung<ol><li>Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox und füllen Sie sie mit PH6- oder PH9-Pufferarbeitslösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung. Anmerkungen: Geben Sie während des Erhitzungsvorgangs doppelt destilliertes Wasser in die Reparaturbox, um eine übermäßige Verdunstung zu verhindern, die zum Austrocknen der Scheiben führen kann.</li>
		<li>Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min).</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 min mit doppelt destilliertem Wasser. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger zu umschließen.</li>
	</ol></li>
	<li>Blockierend<ol><li>Tauchen Sie die Gewebeschnitte in Waschpuffer, bedecken Sie sie mit Blockierungslösung und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 10 Minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubation von primären Antikörpern<ol><li>Entfernen Sie die Blockierungslösung von den Objektträgern und bedecken Sie die Gewebeschnitte mit der primären Antikörper-Arbeitslösung. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei 37 °C im Inkubator oder über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank. HINWEIS: Lassen Sie die Objektträger nicht austrocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Einführung von Polymer HRP<ol><li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang in Waschpuffer-Arbeitslösung. Geben Sie Polymer HRP direkt tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. HINWEIS: Im Kühlschrank aufbewahrte Objektträger vor dem Waschen ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, um den primären Antikörper zu entfernen.</li>
	</ol></li>
	<li>Erzeugung von Tyramin-Signalverstärkung (TSA)<ol><li>Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung, geben Sie die Fluorophor-Arbeitslösung direkt tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung.</li>
	</ol></li>
	<li>Spezielles Verfahren für Fluorophor 780 HINWEIS: Fluorophor 780 ist schwach und wird routinemäßig an letzter Stelle im Farbanpassungsschema des gesamten Experiments platziert. Fluorophor 780 wird normalerweise nicht in diesem Versuchsprotokoll verwendet, aber aufgrund seiner Spezifität werden seine experimentellen Schritte aufgeführt.<ol><li>Einführung von TSA-DIG<ol><li>Waschen Sie den Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung, geben Sie die TSA-Drg-Arbeitslösung tropfenweise in die Gewebeschnitte und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
		</ol></li>
		<li>Mikrowellen-Behandlung<ol><li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung.</li>
			<li>Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox, füllen Sie sie mit Reparaturlösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min).</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.</li>
		</ol></li>
		<li>Signalerzeugung mit Fluorophor 780<ol><li>Tauchen Sie die Schnitte in Waschpuffer, bedecken Sie sie mit der Arbeitslösung Fluorophor 780 und inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit Waschpuffer-Arbeitslösung. HINWEIS: Führen Sie nach diesem Schritt keine Mikrowellenbehandlung durch.</li>
		</ol></li>
		<li>Verwenden Sie Fluorophor 780 als letzten Schritt des gesamten Arbeitsablaufs und färben Sie die Kerne dann direkt mit der DAPI-Arbeitslösung. HINWEIS: Überspringen Sie Schritt 3.7, wenn Sie kein Fluorophor 780 verwenden.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikrowellen-Behandlung HINWEIS: Dieser Mikrowellenschritt entfernt den primär-sekundären HRP-Komplex und setzt Antigene erneut frei, was die Einführung des nächsten primären Antikörpers ermöglicht.<ol><li>Legen Sie die Objektträger in eine Färbe- und Reparaturbox, füllen Sie sie mit PH6- oder PH9-Pufferarbeitslösung, decken Sie sie mit dem Deckel ab und erhitzen Sie sie 2 x 8 Minuten lang in der Mikrowelle bei 100 % Leistung.</li>
		<li>Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren (30-60 min). Waschen Sie die Objektträger 3 x 1 min mit doppelt destilliertem Wasser.</li>
		<li>Tauchen Sie die Objektträger 2 Minuten lang in die Arbeitslösung des Waschpuffers. Führen Sie die nächste Antikörperinkubation durch.</li>
	</ol></li>
	<li>Nächste Antikörper-Inkubation<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.8 (außer Schritt 3.7).</li>
	</ol></li>
	<li>Zellkernfärbung und Gewebeversiegelung<ol><li>Decken Sie die Gewebeschnitte mit der DAPI-Arbeitslösung ab und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger 3 x 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.</li>
		<li>Entfernen Sie Wassertropfen von den Objektträgern, fügen Sie jedem Objektträger 10-20 μl Anti-Fluoreszenz-Quencher hinzu und versiegeln Sie die Objektträger mit einem Mikroskop-Deckglas.</li>
		<li>Lagern Sie die fertigen Objektträger bei 4 °C lichtgeschützt länger als 1 Monat. HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Richten Sie die Negativkontrolle ein
<ol><li>Verarbeiten Sie die Negativkontrollobjektträger wie die gewebehaltigen Objektträger, jedoch ohne Zusatz von Reagenzien wie Primärantikörpern, Sekundärantikörpern, TSA-Reagenzien und DAPI, die zum Entfernen der Gewebeautofluoreszenz beim Scannen des Films verwendet werden.</li>
</ol>5. Vollautomatisches Scannen von Gewebeobjektträgern
HINWEIS: Das für die spektrale Bildgebung verwendete Gerät ist ein vollautomatischer multispektraler Gewebequantifizierungsanalysator, und die Bildgebung und Analysevisualisierung von 5-Farben-Objektträgern kann mit dem referenzierten System durchgeführt werden (siehe Materialtabelle). Das System verwendet multispektrale Bildgebung zur quantitativen Entmischung mehrerer Fluorophore und Gewebeautofluoreszenz.
<ol><li>Stellen Sie die Belichtungszeit und das Scanprogramm für jeden Fluoreszenzkanal manuell ein und bestätigen Sie, dass das Gerät die vollautomatische Belichtung und das Scannen der Gewebeobjektträger abgeschlossen hat. HINWEIS: Die Objektträgeroberfläche muss sauber und frei von Wasserfilm sein. Seien Sie vorsichtig mit der Menge an Versiegelung: Zu viel führt dazu, dass das Deckglas verrutscht und das Instrument einen Fehler meldet.</li>
</ol>6. Analyse der Fluoreszenz
<ol><li>Doppelklicken Sie auf die Software (siehe Materialtabelle), ziehen Sie die mehrfarbige Fluoreszenzbilddatei aus dem Originalscan in die Software und stellen Sie den Bildtyp auf Fluoreszenz ein.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Helligkeit und Kontrast und überprüfen Sie die Kanäle auf dem Bedienfeld. Klicken Sie nach außen und dann auf den Kanal , um den gewünschten Fluoreszenzkanal auszuwählen. Ziehen Sie die Min-Anzeige und die Max-Anzeige , um die Helligkeit und den Kontrast der einzelnen Kanäle anzupassen.</li>
	<li>Bestimmen Sie nach der Analyse die zu speichernde Ansicht, klicken Sie auf Folienübersicht anzeigen und Cursorposition anzeigen , um diese beiden Inhalte zu entfernen, behalten Sie die Maßstabsleiste bei und klicken Sie auf Datei | Snapshot exportieren | Aktueller Viewer-Inhalt zum Exportieren einer PNG-Datei. HINWEIS: Jeder Fluoreszenzkanal und eine zusammengeführte Abbildung müssen für zukünftige Analysen exportiert werden.</li>
	<li>Zur weiteren Analyse der Zielzellpositivität verwenden Sie die Zellidentifikations- und Segmentierungssoftware21 (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

Entschlüsselung der Tumormikroumgebung mit mIHC beim Plattenepithelkarzinom der Lunge

<ol><li>Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+fluorescent+in+situ+hybridization+and+immunohistochemical+detection+with+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).</li>
<li>Lovisa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+induces+cell+cycle+arrest+and+parenchymal+damage+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis.</a> Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).</li>
<li>Nghiem, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+with+pembrolizumab+in+advanced+Merkel-cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma.</a> The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).</li>
<li>Zaretsky, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+associated+with+acquired+resistance+to+PD-1+blockade+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneous+immune+landscape+between+lung+adenocarcinoma+and+squamous+carcinoma+revealed+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289(2022).</li>
<li>Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+direct+and+indirect+immunofluorescence+method+for+determination+of+somatic+cell+count%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Papers%22%5BJournal%5D)">Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count.</a> Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).</li>
<li>Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+immunostaining+approaches+to+study+early+male+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development.</a> Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tim-3+expression+on+tumor-infiltrating+PD-1%2BCD8%2B+T+cells+correlates+with+poor+clinical+outcome+in+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).</li>
<li>Badoual, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-expressing+tumor-infiltrating+T+cells+are+a+favorable+prognostic+biomarker+in+HPV-associated+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer.</a> Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).</li>
<li>Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyramide+signal+amplification+for+antibody-overlay+lectin+microarray%3A+a+strategy+to+improve+the+sensitivity+of+targeted+glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling.</a> Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).</li>
<li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multiplex+immunofluorescence+panel+for+immuno-oncology+studies+on+formalin-fixed+carcinoma+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390(2019).</li>
<li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization%2C+design+and+avoiding+pitfalls+in+manual+multiplex+fluorescent+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915(2019).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
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<li>Lu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biomarker+modalities+for+predicting+response+to+PD-1%2FPD-L1+checkpoint+blockade%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis.</a> JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).</li>
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<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4%2C+Experimental+Pathology+Techniques+of+Respiratory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Atlas+of+Experimental+Pathology+Techniques%22%5BJournal%5D)">Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System.</a> Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).</li>
<li>Wilson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+the+statistical+analysis+of+multiplex+immunofluorescence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data.</a> Cancers. 13 (12), 3031(2021).</li>
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</ol>

Alle Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

mIHC ist eine unverzichtbare experimentelle Technik im Bereich der wissenschaftlichen Forschung für die quantitative und räumliche Analyse mehrerer Proteinmarker auf Einzelzellebene in einem einzigen Gewebeschnitt, die intuitive und genaue Daten für die Untersuchung der Krankheitspathologie liefert, indem sie sich auf die detaillierte Gewebestruktur und die zellulären Interaktionen im Kontext des ursprünglichen Gewebes konzentriert. Die weit verbreitete Einführung der mIHC-Technologie erfordert optimierte und effektive V...

Die mehr als 20-jährige Tyramin-Signalamplifikation (TSA) ist eine Klasse von Assay-Techniken, die Meerrettichperoxidase (HRP) für die In-situ-Markierung von Zielantigenen mit hoher Dichte verwenden und in enzymgebundenen Immunosorbent-Assays (ELISAs), In-situ-Hybridisierung (ISH), Immunhistochemie (IHC) und anderen Techniken zum Nachweis biologischer Antigene weit verbreitet sind. Erhebliche Verbesserung der Empfindlichkeit des detektierten Signals1. Die polychromatische Opalfärbung auf Basis der TSA-Technologie wurde kürzlich entwickelt und in mehreren Studien weit verbreitet 2,3,4,5. Die traditionelle Immunfluoreszenzfärbung (IF) bietet Forschern ein einfaches Werkzeug zum Nachweis und Vergleich der Verteilung von Proteinen in den Zellen und Geweben verschiedener Modellorganismen. Es basiert auf einer Antikörper-/Antigen-spezifischen Bindung und umfasst direkte und indirekte Ansätze6. Bei der direkten Immunfärbung wird ein Fluorophor-konjugierter Primärantikörper gegen das interessierende Antigen verwendet, was eine direkte Fluoreszenzdetektion mit einem Fluoreszenzmikroskop ermöglicht. Der indirekte Immunfärbeansatz beinhaltet die Anwendung eines Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpers gegen den nicht konjugierten Primärantikörper 6,7.
Herkömmliche Immunfluoreszenz-Färbemethoden können nur ein, zwei oder in einigen Fällen drei Antigene in Geweben färben, was eine große Einschränkung bei der Gewinnung der reichhaltigen Informationen in Gewebeschnitten darstellt. Die Interpretation quantitativer Ergebnisse hängt oft von visueller Beobachtung und genauer Quantifizierung durch Bildgebungssoftware wie ImageJ ab. Es gibt technische Einschränkungen, wie z. B. die Einschränkung der Antikörperspezies, schwache fluoreszierende Markierungssignale und die Farbüberlappung von Fluoreszenzfarbstoffen (Tabelle 1). Die Opal-Multiplex-IHC-Technik (mIHC) basiert auf der TSA-Ableitung, die die Multiplex-Färbung und differentielle Markierung von mehr als 7-9 Antigenen auf demselben Gewebeschnitt ohne Einschränkung der Herkunft des Primärantikörpers ermöglicht, aber eine hohe Spezifität des entsprechenden Antikörpers gegen das Antigen erfordert. Das Färbeverfahren ähnelt dem der normalen Immunfluoreszenzfärbung, mit zwei Unterschieden: Bei jeder Färberunde wird nur ein Antikörper verwendet und ein Antikörper-Elutionsschritt hinzugefügt. Antikörper, die durch nichtkovalente Bindungen an das Antigen gebunden sind, können durch Mikrowellenelution entfernt werden, aber das TSA-Fluoreszenzsignal, das durch kovalente Bindungen an die Oberfläche des Antigens gebunden ist, bleibt erhalten.
Aktivierte Tyramin (T)-Moleküle, die mit dem Farbstoff markiert sind, sind am Zielantigen stark angereichert, was eine effiziente Verstärkung des Fluoreszenzsignals ermöglicht. Dies ermöglicht die direkte Markierung des Antigens ohne Antikörperinterferenz, und dann kann nach mehreren Färbezyklen eine mehrfarbige Markierung erreicht werden 8,9,10 (Abbildung 1). Obwohl diese Technologie zuverlässige und genaue Bilder für die Untersuchung von Krankheiten liefert, kann die Erstellung einer nützlichen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie (mfIHC)-Färbestrategie aufgrund der Notwendigkeit umfangreicher Optimierungen und Designs zeitaufwändig und anspruchsvoll sein. Daher wurde dieses Multiplex-Panel-Protokoll in einem automatisierten IHC-Färbegerät mit einer kürzeren Färbezeit als das manuelle Protokoll optimiert. Dieser Ansatz kann von jedem Forscher für immunonkologische Studien an humanen formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben direkt angewendet und angepasst werden11. Darüber hinaus werden die Methoden zur Objektträgervorbereitung, Antikörperoptimierung und Multiplex-Design hilfreich sein, um robuste Bilder zu erhalten, die genaue zelluläre Interaktionen in situ darstellen, und um die Optimierungszeit für die manuelle Analyse zu verkürzen12.
Das mfIHC umfasst hauptsächlich die Bilderfassung und Datenanalyse. In Bezug auf die Bildaufnahme müssen mehrfarbig markierte, komplex gefärbte Proben mit professionellen spektralen Bildgebungsgeräten detektiert werden, um die verschiedenen gemischten Farbsignale zu identifizieren und Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis ohne Störungen durch Gewebeautofluoreszenz zu erhalten. Zu den aktuellen Geräten für die spektrale Bildgebung gehören hauptsächlich spektrale konfokale Mikroskope und multispektrale Gewebebildgebungssysteme. Das multispektrale Gewebebildgebungssystem ist ein professionelles Bildgebungssystem, das für die quantitative Analyse von Gewebeschnitten entwickelt wurde, und sein wichtigstes Merkmal ist die Erfassung von Bildspektralinformationen, die sowohl morphologische Struktur- als auch optische Kartierungsinformationen biologischer Gewebeproben liefern13,14. Jedes Pixel im Spektralbild enthält eine vollständige Spektralkurve, und jeder Farbstoff (einschließlich Autofluoreszenz) hat sein entsprechendes charakteristisches Spektrum, das die vollständige Aufzeichnung und genaue Identifizierung von gemischten und überlappenden Multilabel-Signalen ermöglicht.
In Bezug auf die Datenanalyse sind mehrfarbig markierte Proben aufgrund der morphologischen Struktur und der Bestandteile der Gewebeproben äußerst komplex. Gewöhnliche Software kann verschiedene Gewebetypen nicht automatisch identifizieren. Daher wird eine intelligente quantitative Gewebeanalysesoftware für die quantitative Analyse der Antigenexpression in bestimmten Regionen verwendet 15,16,17,18.
Vor allem hat die Multilabel-Immunfluoreszenzfärbung in Kombination mit multispektraler Bildgebung und quantitativer Pathologie-Analysetechnologie die Vorteile einer großen Anzahl von Nachweiszielen, einer effektiven Färbung und einer genauen Analyse und kann daher die Genauigkeit der histomorphologischen Analyse erheblich verbessern, die räumliche Beziehung zwischen Proteinen mit zellulärer Auflösung aufdecken und dazu beitragen, reichhaltigere und zuverlässigere Informationen aus Gewebeschnittproben zu gewinnen19 (Tabelle 1).

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Abcam</td><td>ab237709</td><td>Primärer Antikörper, 1/100, PH9</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Abcam</td><td>ab955</td><td>Primärer Antikörper, 1/300, PH9</td></tr><tr><td>Anti-CK5/6</td><td>Millipore</td><td>MAB1620</td><td>Primärer Antikörper, 1/150, PH9</td></tr><tr><td>Anti-HMGCS1</td><td>GeneTex</td><td>GTX112346</td><td>Primärer Antikörper, 1/300, PH6</td></tr><tr><td>Tierisches Nicht-Immun-Serum</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>SP KIT-B3</td><td>Antigen-Blockierung</td></tr><tr><td>Fluormount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Anti-Fluoreszenz-Burst</td></tr><tr><td>Opal PolarisTM 7-Farben-Handbuch IHC Kit</td><td>Akoya</td><td>NEL861001KT</td><td>Opal mIHC Staining</td></tr><tr><td>Wash Buffer</td><td>Dako</td><td>K8000/K8002/K8007/K8023</td><td>Waschen der Gewebeobjektträger</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALO</td><td></td><td></td><td>intelligente quantitative Gewebeanalysesoftware, kostenpflichtige Software</td></tr><tr><td>inForm</td><td></td><td></td><td>intelligente quantitative Gewebeanalysesoftware, kostenpflichtige Software</td></tr><tr><td>PerkinElmer Vectra</td><td></td><td></td><td>multispektrale Gewebebildgebungssysteme, vollautomatisches Scannen von Gewebeobjektträgern.</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>intelligente quantitative Gewebeanalysesoftware, Open-Source-Software, die in diesem Experiment verwendet wird.</td></tr></tbody></table>

multiplex-immunhistochemie-färbung für paraffineingebettetes lungenkrebsgewebe

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

Lungenkrebs ist weltweit die Hauptursache für bösartige tumorbedingte Morbidität und Mortalität, und die komplexe Tumormikroumgebung gilt als die häufigste Todesursache bei Lungenkrebspatienten. Die Komplexität der Tumormikroumgebung erfordert effektive Methoden, um Zell-Zell-Beziehungen in Tumorgeweben zu verstehen. Die Multiplex-Immunhistochemie (mIHC)-Technik ist zu einem Schlüsselwerkzeug geworden, um die Beziehung zwischen der Expression von Proteinen vor und hinter Signalwegen in Tumorgeweben abzuleiten und klinische Diagnosen und Behandlungspläne zu entwickeln. mIHC ist eine Multi-Label-Immunfluoreszenz-Färbemethode, die auf der Tyramine Signal Amplification (TSA)-Technologie basiert und mehrere Zielmoleküle gleichzeitig auf derselben Gewebeschnittprobe nachweisen kann, um unterschiedliche Protein-Co-Expressions- und Co-Lokalisierungsanalysen zu erreichen. In diesem experimentellen Protokoll wurden paraffineingebettete Gewebeschnitte von Lungenplattenepithelkarzinomen klinischen Ursprungs einer immunhistochemischen Multiplex-Färbung unterzogen. Durch die Optimierung des experimentellen Protokolls wurde eine immunhistochemische Multiplex-Färbung von markierten Zielzellen und Proteinen erreicht, wodurch das Problem der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels im Lungengewebe gelöst wurde. Darüber hinaus wird die immunhistochemische Multiplex-Färbung häufig bei der experimentellen Validierung von tumorbezogenen Hochdurchsatzsequenzierungen, einschließlich Einzelzellsequenzierung, Proteomik und Geweberaumsequenzierung, eingesetzt und liefert intuitive und visuelle Validierungsergebnisse für die Pathologie.

Wir haben das Matching-Schema von CD8-Primärantikörpern und Fluorophoren optimiert. Beide Sätze von Fluoreszenzergebnissen entsprachen genau den gleichen Antikörper-Inkubationsbedingungen in der Versuchsgruppe, mit Ausnahme der Änderung des Antikörper-angepassten Fluorophors. Wie in Abbildung 2 gezeigt, gab es einen signifikanten Unterschied in der Kanalanpassung von CD8+ T-Zellen mit Fluorophor 480 und Fluorophor 690. Der Kanal mit Fluorophor 690 zeigt einen extrem starken fluoreszierenden ...

Dieses experimentelle Protokoll beschreibt und optimiert eine Multiplex-Immunhistochemie (IHC)-Färbemethode, hauptsächlich durch die Optimierung der Inkubationsbedingungen von Einzelkanal-Antikörpern und die Anpassung der Einstellungen von Antikörpern und Kanälen, um die Probleme der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels in Lungenkrebsgeweben klinischen Ursprungs zu lösen.

Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Optimierung des mIHC-Protokolls für Paraffinschnitte aus klinischen Quellen. Unser Ziel war es, Probleme mit Autofluoreszenz und Autofluoreszenzkanal-Crosstalk im Lungengewebe effektiv anzugehen. Die aktuellen experimentellen Herausforderungen, mit denen wir konfrontiert sind, umfassen die Behandlung der Probleme der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels im Lungengewebe, wobei eine erfolgreiche mehrfarbige Fluoreszenzlokalisierung für markierte Zielzellen und Proteine erforderlich ist.Unsere hocheffiziente In-situ-Markierungsmethode für mehrere Antigene, die weniger als drei Stunden pro Antikörper benötigt, integriert nahtlos ein multispektrales Bildgebungssystem und eine spezialisierte Pathologiesoftware. Dieses optimierte mIHC-Protokoll lässt sich leicht für den Einsatz in anderen Forschungslabors anpassen.

multiplex-immunohistochemistry-staining-for-paraffin-embedded-lung

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Immunhistochemie ist eine leistungsfähige Labortechnik zur Bewertung der Proteinlokalisierung und -expression in Geweben. Aktuelle halbautomatische Methoden zur Quantifizierung führen zu Subjektivität und führen oft zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Darin beschreiben wir Methoden zur Multiplex-Immunhistochemie und zur objektiven Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung.

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Ein detailliertes Protokoll für ein sechs-Marker multiplex Immunfluoreszenz-Panel optimiert und durchgeführt ist, mit Hilfe einer automatisierten Stainer für konsistentere Ergebnisse und eine kürzere Verfahrensdauer. Dieser Ansatz kann direkt von jedem Labor für Immuno-onkologischen Studien angepasst werden.

Automatisierte Multiplex Immunfluoreszenz Panel für Immuno-Onkologie-Studien auf Formalin fixiert Karzinom Gewebeproben

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex-fluoreszierende immunhistochemische Färbung und imaging für die gleichzeitige Lokalisierung von mehreren Krebs-assoziierte Antigene in Lymphom. Dieses Protokoll kann für die NS1 Analyse von Biomarkern in allen Gewebeschnitte erweitert werden.

Gemultiplexten fluoreszierende immunhistochemische Färbung, Bildverarbeitung und Analyse in histologischen Proben des Lymphoms

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur manuellen Tyramid-Signalverstärkung (TSA) Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) in Kombination mit Bildanalyse und räumlicher Analyse beschrieben. Dieses Protokoll kann mit formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Schnitten für die Färbung von zwei bis sechs Antigenen pro Objektträger verwendet werden, je nachdem, welcher Objektträgerscanner im Labor verfügbar ist.

Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie die Immunzellcharakterisierung der Tumormikroumgebung mittels Multiplex-Immunhistochemie durchgeführt wird.

Immunhistochemische Multiplex-Analyse der räumlichen Immunzelllandschaft der Tumormikroumgebung

Die zyklische Multiplex-Immunhistochemie ermöglicht den gleichzeitigen In-situ-Nachweis mehrerer Marker durch wiederholte Antigen-Antikörper-Inkubation, Bildscannen sowie Bildausrichtung und -integration. Hier stellen wir das Operationsprotokoll zur Identifizierung von Immunzellsubstraten mit dieser Technologie in Lungenkrebs- und gepaarten Hirnmetastasenproben vor.

Zyklische Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie

Multiparameter-Fluoreszenz-Immunhistochemie kann verwendet werden, um die Anzahl, die relative Verteilung und die Lokalisierung von Immunzellpopulationen in der Tumor-Mikroumgebung zu bestimmen. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung dieser Technik zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei oropharyngealen Krebs.

Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben

Einem Tiermodell wird benötigt, um die Rolle der zirkulierende Tumorzellen (CTC) bei der Förderung der Lunge Kolonisation in Krebsmetastasen zu entschlüsseln. Hier wir etabliert und erfolgreich durchgeführt eine in Vivo assay, speziell Test das Erfordernis der Polymeren Fibronektin (PolyFN) Montage auf CTCs zur Besiedlung der Lunge.

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Derzeit ist immunofluorescent Flecken auf festen Zellen die Methode der Wahl zur Bestimmung der Ausdruck proteingehalte wenn morphologische Informationen auch notwendig ist. Dieses Protokoll enthaltenen bietet für ein alternatives Verfahren zur Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken.

Bestimmung der Proteinexpressionsgrad in kultivierten Zellen von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken

Hier stellen wir ein Protokoll der elastischen Färbung vor, um elastische Fasern in pT3N0M0 Magenkrebsgeweben auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Abschnitten zu identifizieren. Anschließend beschreiben wir eine Methode, um zu bestimmen, ob Tumorzellen über die elastische Lamina hinaus eindringen.

Elastische Färbung auf Paraffin-eingebetteten Dias von pT3N0M0 Magenkrebsgewebe

Lernen Sie die optimierte Multiplex-IHC-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe. Diese Methode reduziert Autofluoreszenz und Kanalübersprechen für präzise Bildgebung.

Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe

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