Name: Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Lernen Sie die enzymatische Dissoziation von Skelettmuskelfasern aus sechs Hintergliedmaßenmuskeln der Maus. Diese Methode ermöglicht physiologische Experimente zur Erforschung der Erregungs-Kontraktions-Kopplung.

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Die Autoren danken Professor Robinson Ramírez von UdeA für die Hilfe mit Tieren und einigen Fotos und Carolina Palacios für die technische Unterstützung. Johan Pineda von Kaika half uns beim Aufbau der Farb- und Fluoreszenzkameras. Shyuan Ngo von der University of Queensland hat das Manuskript freundlicherweise Korrektur gelesen. Diese Studie wurde von der CODI-UdeA (2020-34909 vom 22. Februar 2021 und 2021-40170 vom 31. März 2022, SIU) und dem Planungsbüro-UdeA (E01708-K und ES03180101), Medellín, Kolumbien, an JCC finanziert. Die Geldgeber beteiligten sich nicht an der Datenerhebung und -analyse, dem Schreiben von Manuskripten oder der Einreichung von Manuskripten.

Enzymatische Isolierung und Charakterisierung von Mausmuskelfasern variabler Länge

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Als Ergänzung zu den Modellen, die für die Untersuchung der Biologie der reifen Skelettmuskulatur zur Verfügung stehen, zeigen wir hier die erfolgreiche enzymatische Dissoziation einer Reihe von Mausmuskeln mit kurzen, mittleren und langen Fasern. Diese Fasern ermöglichen den Nachweis der Generalisierbarkeit der MT-II-Kinetik der Ca2+ -Transienten im Skelettmuskel. Weiterhin wurden die Fasertypen in den intakten, ganzen Muskeln klassifiziert. Da der FDB der am häufigsten verwendete Muskel für physiologische Ex...

Der reife Skelettmuskel von Säugetieren ist ein multifunktionales Gewebe. Es reguliert den Stoffwechsel stark, ist die Hauptquelle der Wärmeerzeugung und seine dynamischen Eigenschaften verleihen ihm eine Schlüsselrolle bei der Atmung, der Bewegung von Körpersegmenten oder der Verschiebung von einem Punkt zum anderen 1,2,3. Die Skelettmuskulatur ist auch für die Pathophysiologie vieler Krankheiten relevant, einschließlich erblicher und chronischer Erkrankungen wie Myopathien, Dystrophien oder Sarkopenie sowie vieler chronischer Erkrankungen außerhalb des Muskels, wie z. B. kardiometabolische Erkrankungen 3,4,5,6,7,8.
Die Ex-vivo-Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften reifer Skelettmuskeln im Kontext von Gesundheit und Krankheit war hauptsächlich durch zwei experimentelle Modelle möglich: ganzer Muskel und isolierte Fasern. Im 20. Jahrhundert nutzten Forscher die Eigenschaften des ganzen, intakten Musculus extensor digitorum longus (EDL), des Soleus, des Tibialis anterior und des Gastrocnemius verschiedener kleiner Spezies als zentrale Modelle, um mehr über motorische Einheiten, Fasertypen und dynamische Eigenschaften wie Kraft und Kinetik von Kontraktion und Entspannung zu erfahren 9,10,11,12,13,14,15,16. Das Aufkommen verfeinerter zellbiologischer Studien verlagerte den Bereich jedoch in Richtung der Untersuchung einzelner Muskelfasern. Pionierarbeit ermöglichte dann die Isolierung von intakten Flexor digitorum brevis (FDB)-Fasern von Ratten durch enzymatische Dissoziation für die anschließende Charakterisierung 17,18,19. Obwohl FDB-Fasern auch durch manuelle Dissektion gewonnen werden können20, haben die Leichtigkeit und der hohe Durchsatz der enzymatischen Dissoziation von murinen Muskeln sowie ihre Eignung für eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen dazu geführt, dass das letztere Modell in den letzten zwei Jahrzehnten weit verbreitet ist.
Die kurzen FDB-Fasern eignen sich für elektrophysiologische und andere biophysikalische Studien, biochemische, metabolische und pharmakologische Analysen, Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie-Experimente, Transfektion für zellbiologische Ansätze oder als Stammzellquelle in Myogenese-Studien 5,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31,32. Die ausschließliche Verwendung von FDB-Fasern in Muskelexperimenten schränkt jedoch den Umfang der Forschung ein, die sich mit Fasertypen befasst, und begrenzt die Menge an biologischem Material, das für einige methodische Techniken oder für die Gewinnung weiterer Informationen von einem Tier zur Verfügung steht. Diese Einschränkungen verhindern eine klare Korrelation zellphysiologischer Phänomene mit früheren biochemischen und dynamischen Studien, die an verschiedenen ganzen, intakten Muskeln (z. B. EDL, SOLEUS, PERONEI) durchgeführt wurden.
Durch die Überwindung dieser Einschränkungen gelang es einigen Gruppen, die längeren EDL- und Soleus-Muskeln 24,33,34,35,36,37,38,39,40 zu dissoziieren, was die Tür öffnete, um die Methode auf andere relevante Muskeln auszudehnen. Die Verwendung von EDL- und Soleus-Fasern ist jedoch immer noch selten, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an methodischen Details, um sie als intakte Fasern zu erhalten. Hier beschreiben wir detailliert, wie man Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln isoliert: drei davon bereits beschrieben (FDB, EDL und Soleus) und drei von ihnen wurden zum ersten Mal erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus [EHL], Peroneus longus [PL] und Peroneus digiti quarti [PDQA]). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass das Modell enzymatisch dissoziierter Fasern für eine Vielzahl von Studien und zukünftige Korrelationen mit bereits veröffentlichten Daten geeignet ist, wodurch die Verfügbarkeit von Modellen für Studien zur reifen Skelettmuskulatur erhöht wird.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>absolutes Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Gibco BRL</td><td>15512-015</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Panreac</td><td>141138.1610</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myosin I Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4276</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Myosin II Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8421</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-Myosin IIA Antikörper</td><td>American Type Culture Collection</td><td>SC-71</td><td>Primärer Antikörper. Abgeleitet von HB-277 Hybridom</td></tr><tr><td>Anti-Myosin IIB Antikörper</td><td>Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>BF-F3-c&nbsp;</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Bis-Acrylamid</td><td>AMRESCO</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Thermo Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Reagenz</td><td>Merck</td><td>1.10306.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Carlo Erba</td><td>428658</td><td></td></tr><tr><td>Calciumcarbonat</td><td>Merck</td><td>102066</td><td></td></tr><tr><td>Calciumdichlorid (CaCl2)</td><td>Merck</td><td>2389</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington</td><td>CLS-2/LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Consul-Mount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990440</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brillantblau R 250&nbsp;</td><td>Merck</td><td>112553</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AMRESCO</td><td>0281</td><td></td></tr><tr><td>Edetinsäure (EDTA</td>) <td>AMRESCO</td><td>0322</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1423291211</tr><tr><td>Glycin</td><td>Panreac</td><td>151340.1067</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Thermo</td><td>Scientific 6765015</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AMRESCO</td><td>0511</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AMRESCO</td><td>M136</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4, AM</td><td>Invitrogen</td><td>M14206</td><td>Nur in DMSO hergestellt. Pluronsäure ist nicht erforderlich und sollte nicht verwendet werden, um eine Verschlechterung der Fasern zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Applichem</td><td>A11080100</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Protokimica</td><td>MP10043</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>Mehrere</td><td>Mehrere</td><td>Für dieses Manuskript haben wir nur C57BL/6 Mäuse verwendet. Einige vorläufige Ergebnisse haben jedoch gezeigt, dass das Protokoll für Schweizer Webster-Mäuse gleichen Alters und Gewichts gut funktioniert.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethan-1,2-diamin (TEMED)</td><td>Promega</td><td>V3161</td><td></td></tr><tr><td>N-Benzyl-p-toluolsulfonamid (BTS)</td><td>Tocris</td><td>1870</td><td></td></tr><tr><td>Optimale Schneidverbindung (OCT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärantikörper</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11001</td><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Natriumdodecilsulfat</td><td>Panreac&nbsp;</td><td></td><td></td>1323631209</tr><tr><td>TRIS 0,5 M, pH 6,8&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>J832</td><td></td></tr><tr><td>Tris(Hydroxymethyl)aminomethan</td><td>AMRESCO</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AMRESCO</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektionskammer Maßgeschneiderte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>geladene Objektträger</td><td>Erie Scientific</td><td>5951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Experimentelle Badkammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27NE2</td><td>Schmale Badkammer mit Feldstimulation, kombiniert auf einer beheizten Plattform PH-6</td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338, 500230</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>World Precision Instruments</td><td>Vannas Schere 501778</td><td></td></tr><tr><td>Glas Pasteur Pipetten</td><td>Mehrere</td><td></td><td>feuerpolierte Spitzen</td></tr><tr><td>Glasfläschchen mit Deckel</td><td>Mehrere</td><td></td><td>2-3 mL Volumen</td></tr><tr><td>Operationsschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>501223-G</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>SL 8R</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Zeiss</td><td>Erc 5s und Axio 305</td><td>Der Axio 305, gekoppelt mit dem Stereoskop Stemi 508, wurde für die Aufnahme von Bildern während der Dissektion verwendet, während Erc 5s oder Axio 208, gekoppelt mit dem Axio Observer A1 Mikroskop, für die Aufnahme von Bildern der isolierten Fasern und der Immunfluoreszenz-Assays verwendet wurden</td></tr><tr><td>. Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td>1550A Digidata</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresekammer</td><td>Bio Rad</td><td>Mini-Protean IV</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop, gekoppelt an die Fluoreszenz</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer A1</td><td>Gekoppelt an eine geeignete Lichtquelle, Filter und Objektive für die Fluoreszenz</td></tr><tr><td>Photomultiplier</td><td>Horiba</td><td>R928 Röhre, Hamamatsu, in einem D104 Photometer, Horiba</td><td>Gekoppelt mit der lateralen Öffnung des Fluoreszenzmikroskops</td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator&nbsp;</td><td>Grass Instrumente&nbsp;</td><td>S6</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNE-22</td><td></td></tr><tr><td>Xilol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>808691</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freie Software für Elektrophoresenanalysen</td><td>University of Kentucky</td><td>GelBandFitter v1.7</td><td>http://www.gelbandfitter.org</td></tr><tr><td>Freie Software für Bildanalyse und</td><td>Morphometrie National Institutes of Health</td><td>ImageJ v1.54</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Lizenzierte Software für Ca2+ Signalerfassung und -analyse</td><td>Molecular Devices</td><td>pCLAMP v10.05</td><td>https://www.moleculardevices.com</td></tr><tr><td>Lizenzierte Software für statistische Analysen und grafische Darstellung</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2019</td><td>https://www.originlab.com/</td></tr></tbody></table>

intakte kurze, mittlere und lange skelettmuskelfasern, die durch enzymatische dissoziation von sechs hintergliedmaßenmuskeln von mäusen gewonnen wurden: jenseits des flexor digitorum brevis

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von Mausmuskeln gewonnen werden, sind ein nützliches Modell für physiologische Experimente. Die meisten Arbeiten befassen sich jedoch mit den kurzen Fasern des Flexor digitorum brevis (FDB), was den Umfang der Ergebnisse einschränkt, die sich mit Fasertypen befassen, die Menge des verfügbaren biologischen Materials begrenzt und eine klare Verbindung zwischen zellphysiologischen Phänomenen und früheren biochemischen und dynamischen Erkenntnissen in anderen Muskeln verhindert.
In diesem Artikel wird beschrieben, wie intakte Fasern aus sechs Muskeln mit unterschiedlichen Fasertypprofilen und -längen gewonnen werden können. Anhand von erwachsenen C57BL/6-Mäusen zeigen wir das Muskeldissektions- und Faserisolationsprotokoll und demonstrieren die Eignung der Fasern für Ca2+ transiente Studien und ihre morphometrische Charakterisierung. Die faserartige Zusammensetzung der Muskeln wird ebenfalls vorgestellt. Bei der Dissoziation wurden alle Muskeln intakte, lebende Fasern, die sich länger als 24 Stunden schnell zusammenzogen. FDB ergab kurze (<1 mm), Peroneus digiti quarti (PDQA) und Peroneus longus (PL) ergaben intermediäre (1-3 mm), während Extensor digitorum longus (EDL), Extensor hallucis longus (EHL) und Soleus-Muskeln lange (3-6 mm) Fasern freisetzten.
Bei der Aufzeichnung mit dem schnellen Farbstoff Mag-Fluo-4 zeigten Ca2+ -Transienten von PDQA-, PL- und EHL-Fasern eine schnelle, schmale Kinetik, die an die Morphologie des Typs II (MT-II) erinnert, von der bekannt ist, dass sie den Fasern vom Typ IIX und IIB entspricht. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass diese Muskeln über 90% Typ-II-Fasern aufweisen, verglichen mit FDB (~80%) und Soleus (~65%). Über FDB hinaus zeigen wir zum ersten Mal die Dissoziation mehrerer Muskeln, die Fasern ergeben, die einen Längenbereich zwischen 1 und 6 mm umfassen. Diese Fasern sind lebensfähig und liefern schnelle Ca2+ -Transienten, was darauf hindeutet, dass das MT-II unabhängig von ihrer Muskelquelle auf IIX- und IIB-Fast-Fasern verallgemeinert werden kann. Diese Ergebnisse erhöhen die Verfügbarkeit von Modellen für Studien zur reifen Skelettmuskulatur.

Sarkoplasmatische Ca2+ -Konzentration während eines Zuckens Um die Durchführbarkeit physiologischer Experimente in der Menge dissoziierter Fasern zu demonstrieren und unsere bisherigen Erkenntnisse über die Erregungs-Kontraktions-Kopplung (ECC) und die Fasertypen zu erweitern, wurden Ca2+-Transienten in Fasern aller Muskeln erfasst. Erstens zeigten FDB (n = 5) und EDL (n = 7) eineCa-2+-Kinetik, die als Morphologietyp II (MT-II) bekannt ist. Dies sind schnelle, stacheli...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung enzymatisch dissoziierter Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Muskeln erwachsener Mäuse: drei davon bereits beschrieben (Flexor digitorum brevis, Extensor digitorum longus, soleus) und drei von ihnen erstmals erfolgreich dissoziiert (Extensor hallucis longus, Peroneus longus, Peroneus digiti quarti).

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

In dieser Studie beschreiben wir eine Methode, um Fasern unterschiedlicher Länge und Art aus sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen zu isolieren. Außerdem haben wir die Eignung der Fasern für physiologische Experimente getestet, die sich mit der Untersuchung des Erregungs-Kontraktions-Kopplungsmechanismus befassen. Jahrelang war es eine Herausforderung, lange Muskelfasern zu erhalten, was den Umfang vieler Studien auf diesem Gebiet einschränkte.Nun zeigen wir, dass es möglich ist, magere Fasern mit Mausflexoren, Extensoren und Evertoren mit Längen von bis zu sechs Millimetern zu erhalten. Beispielsweise konnten wir anhand von Fasern aus sechs verschiedenen Muskeln zeigen, dass die als Morphologie Typ II bekannte transiente Kalziumkinetik unabhängig von der Lage oder Funktion ihrer Muskelquelle auf Typ IIB und IIX verallgemeinert werden kann. Wir glauben, dass das Modell der enzymatisch isolierten Fasern für eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen mit unterschiedlichen Technologien geeignet ist, die es uns ermöglichen, mechanistische Fragen im Bereich der Biochemie, Physiologie, Biophysik, Zellbiologie und Molekularbiologie zu beantworten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Myo-mechanischen Analyse von isolierten Skelettmuskel

Wir beschreiben ein Verfahren zur direkten Messung der Muskelkraft, Muskelkraft, kontraktile Kinetik und Ermüdbarkeit der isolierten Skelettmuskulatur in...

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

Dieses Video zeigt die Isolierung einzelner Myofasern aus entnommenem Maus-Musculus Extensor Digitorum Longus (EDL). Die isolierten Myofasern können kultiviert werden, um die Aktivität von Myofaser-assoziierten Muskelstammzellen zu untersuchen.

Myofaserisolierung: Eine Technik zur Gewinnung einzelner Myofasern aus entnommenen Mausmuskeln Extensor Digitorum longus (EDL)

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Durchführung von Kleinwinkel-Röntgenbeugungsexperimenten mit intakten Mausskelettmuskeln. Mit der breiten Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen für menschliche Krankheiten kann diese experimentelle Plattform ein nützliches Prüffeld für die Aufklärung der strukturellen Grundlagen genetischer Muskelerkrankungen bilden.

Röntgenbeugung von intakten Murine Skelettmuskel als Werkzeug zur Untersuchung der strukturellen Basis von Muskelerkrankungen

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Die Funktion der Skelettmuskulatur kann durch die Quantifizierung der Kontraktilität isolierter Muskelfasern beurteilt werden, wobei traditionell mühsame Ansätze mit niedrigem Durchsatz verwendet werden. Hier beschreiben wir eine optikbasierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung der Kontraktilität von Hydrogel-eingebetteten Muskelfasern. Dieser Ansatz hat Anwendungen für das Wirkstoffscreening und die therapeutische Entwicklung.

Hochdurchsatz-Kontraktionsmessungen von Hydrogel-eingebetteten intakten Muskelfasern der Maus mit einem optikbasierten System

Dieses Protokoll zielt darauf ab, interstitielle extrazelluläre Vesikel (SkM-EVs) der Skelettmuskulatur aus Muskelgewebe von Nagetieren durch mechanische Ablösung, enzymatische Dissoziation, Filtration und differentielle Ultrazentrifugation zu isolieren und zu reinigen. Es zeugt von Beständigkeit und Zuverlässigkeit. Die isolierten SkM-EVs liefern Einblicke in die Muskelhomöostase und -krankheiten, mit potenziellen Anwendungen als diagnostische Biomarker oder therapeutische Vehikel.

Enzymatische Isolierung von interstitiellen extrazellulären Vesikeln der Skelettmuskulatur

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakter einzelner Muskelfasern aus dem oxidativen Soleus und die Einrichtung hochgereinigter Myoblastkulturen, die aus diesen Fasern gewonnen wurden. Das optimierte Verfahren liefert zuverlässig etwa 300–500 intakte Myofasern pro Maus, was nachgelagerte molekulare und zelluläre Analysen ermöglicht.

Einzelfaser-Isolationstest zur Beurteilung des oxidativen Myofaserverhaltens

Lernen Sie die enzymatische Dissoziation von Skelettmuskelfasern aus sechs Hintergliedmaßenmuskeln der Maus. Diese Methode ermöglicht physiologische Experimente zur Erforschung der Erregungs-Kontraktions-Kopplung.

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis (Video) | JoVE Journal

Intakte kurze, mittlere und lange Skelettmuskelfasern, die durch enzymatische Dissoziation von sechs Hintergliedmaßenmuskeln von Mäusen gewonnen wurden: Jenseits des Flexor Digitorum brevis

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