Gewebeaufbereitung und Isolierung von primären Fibroblasten aus der menschlichen Vagina

Die Erforschung von Störungen, die in erster Linie Menschen weiblichen Geschlechts betreffen, ist zu wenig erforscht und unterfinanziert. Der Beckenorganprolaps ist die Erkrankung, die stark mit dem weiblichen Geschlecht verbunden ist. Es tritt auf, wenn Muskeln und Bänder schwächer werden und die Beckenorgane tiefer im Becken absinken, wodurch eine Ausbuchtung in der Vagina entsteht.

Es ist wenig über zelluläre Wechselwirkungen im Rahmen dieser Pathophysiologie bekannt, ebenso wenig wie sich Faktoren auf Gewebeebene auf den Erfolg chirurgischer Eingriffe auswirken. Die Isolierung von primären Fibroblasten aus der menschlichen Vagina kann nützlich sein, um die biologischen Mechanismen zu untersuchen, die dem Prolaps der Beckenorgane zugrunde liegen. Ein Beckenorganprolaps betrifft häufig ältere oder postmenopausale Personen.

Isolierung und Proliferation von primären Fibroblasten Die Untersuchung dieser Erkrankung ist aufgrund der reduzierten Zellpopulationen und der klonogenen Fähigkeit älterer Spender schwierig. Die meisten Arbeiten, die menschliche Vaginalproben verwenden, verwenden Gewebe von prämenopausalen Personen mit Beckenorganprolaps. Obwohl in einigen Arbeiten über die Verwendung von Proben sowohl von prämenopausalen als auch von postmenopausalen Personen berichtet wurde, wurde das Protokoll, das zur erfolgreichen Isolierung von Fibroblasten von älteren oder postmenopausalen Spendern verwendet wurde, nicht detailliert genug beschrieben.

Die Isolierung und Modellierung von Krankheiten unter Verwendung von Fibroblasten aus postmenopausalem Gewebe kann für das Verständnis der zellulären Pathophysiologie des Beckenorganprolaps unerlässlich sein, da diese Erkrankung in den zehn Jahren nach der Menopause die höchste Prävalenz bei Personen aufweist. Wir beschreiben eine Methode zur Isolierung und Kultivierung einer mit Fibroblasten angereicherten Einzelzellsuspension aus menschlichem Vaginalgewebe unter Verwendung einer Kombination aus mechanischer und enzymatischer Dissoziation. Dieser Artikel beschreibt ein zuverlässiges Protokoll zur Gewinnung postmenopausaler oder alternder humaner vaginaler Fibroblasten. Das entnommene Gewebe wurde histologisch analysiert, um das Protokoll zu validieren.

Messen und schneiden Sie das Gewebe auf eine Größe von etwa einem Quadratzentimeter zu. Stellen Sie eine präzise Messung der Biopsiegröße sicher. Bereiten Sie zwei bis drei weitere vaginale Biopsien mit einer Größe von jeweils einem Quadratzentimeter von einem einzigen Spender vor und legen Sie die Biopsien beiseite.

Nachdem Sie die Vaginalbiopsie in eine Zellkultur-Petrischale gelegt haben, zerkleinern Sie das Vaginalgewebe mit zwei sterilen Skalpellen in kleine Fragmente. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Klingen senkrecht zur Oberfläche des Gewebes stehen. Üben Sie mit zwei Skalpellen gleichmäßigen und gleichmäßigen Druck auf die Gewebeoberfläche aus.

Führen Sie eine abwechselnde Zugbewegung aus, um das Taschentuch in sehr kleine Stücke zu schneiden. Wiederholen Sie diese Zerkleinerungstechnik mit zwei Skalpellen, bis die Probe mit ein bis zwei Millimetern großen Stücken eine gleichmäßige Konsistenz hat. Geben Sie zwei bis drei Milliliter serumfreies Zellkulturmedium auf die Platte und suspendieren Sie das zerkleinerte Gewebe.

Pipettieren Sie die Lösung, die Gewebefragmente enthält, auf und ab, um eventuelle Klumpen aufzulösen. Die Lösung, die die Gewebefragmente enthält, wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen gegeben. Fügen Sie zusätzliches serumfreies Zellkulturmedium hinzu, bis das Gesamtvolumen 10 Milliliter beträgt.

Bewahren Sie Liberase zur Verwendung in 230 Mikroliter Aliquoten auf. Geben Sie 230 Mikroliter Liberace in das Röhrchen. Die Röhrchen werden drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter konstantem kräftigem Rühren mit einem Probenmischer inkubiert.

Halten Sie konstante Bewegung aufrecht. Wirbeln Sie die Röhrchen während der Inkubation in 30-Minuten-Intervallen durch. Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 3000 g. Entfernen Sie den Überstand und entsorgen Sie ihn.

Suspendieren Sie das Pellet in ein bis zwei Millilitern Zellkulturmedium mit 10 % fötalem Rinderserum, um das Liberase zu verdünnen. Pipettieren Sie kräftig, bis das Pellet wieder vollständig suspendiert ist. Die Gewebeenzymsuspension durch vorsichtiges Pipettieren der Lösung über das Zellsieb abseihen.

Ziehen Sie Zellsuspensionen aus mehreren Gewebebiopsien desselben Spenders zusammen. Drücken Sie mit dem Kolben einer sterilen Fünf-Milliliter-Spritze die Gewebeenzymsuspension über das Sieb durch. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die restlichen Gewebefragmente vollständig durchgedrückt zu sein scheinen.

Plattengezogene Zellsuspension aus mehreren Vaginalbiopsien desselben Spenders auf einer einzigen Petrischale. Nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius beobachten Sie die Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop auf die Unterseite der Platte fokussiert ist.

Eine kleine Anzahl von Fibroblasten wird an den Boden gebunden. Hier ist eine schematische Darstellung des Protokolls, in der die wichtigsten Schritte hervorgehoben sind. Abbildung zwei zeigt ein Phasenkontrastbild von suspendierten Zellen am Tag Null.

Abbildung drei ist ein Phasenkontrastbild von vaginalen primären Fibroblasten am Tag 14 der Kultur bei 100-facher Vergrößerung aus einer gezogenen Suspension von drei ein Zentimeter großen quadratischen Gewebebiopsien. Tabelle eins zeigt die Ergebnisse der Verwendung anderer Protokolle zur Isolierung vaginaler Fibroblasten in dieser aktuellen Studie. Die Fibroblasten wurden durch positive Färbung des Mentons identifiziert.

Die Immunfluoreszenzanalyse wurde an prämenopausalen und postmenopausalen Vaginalgeweben durchgeführt, die hier gezeigt werden. Die Bilder wurden mit 200-facher Vergrößerung aufgenommen. Isolierte Fibroblasten wurden auch mit Alpha-Aktin der glatten Muskulatur und F-Aktin in prämenopausalen und postmenopausalen Gewebeproben gefärbt.

Wir haben ein optimiertes und zuverlässiges Protokoll für die Isolierung von primären Fibroblasten aus der Vaginalschleimhaut bei älteren Spenderinnen entwickelt. Die Verwendung zuvor veröffentlichter Protokolle für tierisches und menschliches Gewebe zur Dissoziation von Primärzellen führte in dieser Studie nicht zur Extraktion von Fibroblasten aus menschlichen Vaginalproben. Wir stellen zwei wahrscheinliche Gründe für die Herausforderung der Zelldissoziation aus menschlichem Vaginalgewebe auf.

Die dermale Dicke der Schleimhaut ist bei älteren Spendern größer und kann im Vergleich zu der von nicht-mukosalem Gewebe und der Dichte der Fibroblasten bei älteren Personen deutlich reduziert sein. Einige wichtige Schritte sollten nicht geändert werden. Die Durchführung eines sehr rigorosen mechanischen Aufschlusses unter Verwendung der Zwei-Skalpell-Technik und das Zusammenziehen der Zellsuspensionen von drei bis vier Biopsien in voller Dicke eines einzigen Spenders.

Unser Protokoll hat einen deutlichen Vorteil. Der mechanische und enzymatische Verdau führen zu besseren Ausbeuten für postmenopausales Gewebe, haben aber keinen negativen Einfluss auf prämenopausale Proben. Wir erkennen mehrere Einschränkungen unseres Protokolls an.

Der Zugang zu menschlichem Vaginalgewebe kann in Situationen, in denen keine Vaginalprolapsoperation durchgeführt wird, eine Herausforderung darstellen, und die Notwendigkeit, Zellsuspensionen aus mehreren Gewebebiopsieproben zu ziehen, kann ebenfalls eine Einschränkung darstellen. Dieses Protokoll zur Anforderung menschlicher vaginaler Fibroblasten wird ein nützliches Werkzeug für zukünftige Untersuchungen von Beckenbodenerkrankungen sein, insbesondere bei Personen nach der Menopause, sowie eine wichtige Ergänzung für die Gesundheitsforschung von Frauen.