Name: Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung eines bovinen primären enteroiden 2D-Monolayer-Kultursystems für gastrointestinale Forschung. Dieses detaillierte Protokoll ermöglicht Ko-Kulturen mit Immunzellen und Untersuchungen zu Wirt-Pathogen-Interaktionen.

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Wir begrüßen die Nutzung der Cellular and Molecular Core Facility an der Midwestern University.

Etablierung einer 2D-Monoschicht aus 3D-Rinder-Ilealenteroidkulturen

<ol><li>Gerdts, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li>
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<li>Hamilton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vitro+enteroids+derived+from+bovine+small+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts.</a> Veterinary Research. 49 (1), 54(2018).</li>
<li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+in+farm+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+three-dimensional+%283D%29+expansion+of+bovine+intestinal+organoids%3A+An+in+vitro+model+as+a+potential+alternative+to+an+in+vivo+system%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2115(2021).</li>
<li>Töpfer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+colon+organoids%3A+From+3D+bioprinting+to+cryopreserved+multi-well+screening+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms.</a> Toxicology in Vitro. 61, 104606(2019).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
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<li>Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical%2C+biomolecular+and+biochemical+characterization+of+bovine+epithelial+intestinal+primocultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures.</a> BMC Cell Biology. 6, 42(2005).</li>
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<li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroid+monolayers+reveal+an+autonomous+WNT+and+BMP+circuit+controlling+intestinal+epithelial+growth+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization.</a> Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ein physiologisch relevantes Modell zur Untersuchung der Darmphysiologie und von Darmerkrankungen. Mehrere Forschungsgruppen haben die Generierung von bovinen enteroiden Kulturen beschrieben, einschließlich der 2D-Monolayer 16,19,20,21,22,23,24. Während die Monolayer-Generierung technisch keine offensichtliche Herausforderung darstellt, sind mehrere winzige Schritte entscheidend für die konsistente Entwicklung erfolgreicher Kulturen. Daher kann die Reproduzierbarkeit von 2D-Monoschichten mit den in der veröffentlichten Literatur kurz beschriebenen Methoden für einen Forschungsanfänger auf dem Gebiet der Organoide eine Herausforderung darstellen. Das hierin beschriebene Protokoll ist von diesen Protokollen und denen, die in anderen Spezies veröffentlicht wurden, adaptiert und bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Monolagenerzeugung auf Transwell-Einsätzen, die in hohem Maße reproduzierbar ist.
Das hierin beschriebene Protokoll kann leicht modifiziert werden, um den spezifischen Zielen des Versuchsdesigns oder der Verfügbarkeit von Reagenzien gerecht zu werden. In der Tat können nach diesem Protokoll erfolgreiche Kulturen durch Aussaat von Monoschichten bei einer niedrigeren Zelldichte (z. B. 2,5 x 104) oder in Abwesenheit von FBS erreicht werden, wie in anderen Veröffentlichungen24 beschrieben. Die Veränderung dieser Parameter kann jedoch eine erhöhte Kultur erfordern, um eine konfluente Monoschicht zu etablieren. Wenn also andere Faktoren, die für das Studiendesign wichtig sind, einschließlich der Co-Kultur mit Immunzellen, einen bestimmten Zeitverlauf für das Experiment vorgeben, kann die Aussaatdichte nach Bedarf geändert werden. Während andere Basalmembranformulierungen anstelle der in diesem Protokoll verwendeten ersetzt werden können, um 3D-Enteroide und 2D-Monoschichten zu erzeugen, erfordern diese einige Optimierungen, um das optimale Basalmembran-zu-Medien-Verhältnis zu bestimmen.
Die Anwendung von Transwell-Einsätzen in der beschriebenen Methodik hat viele Vorteile gegenüber dem Monoschichtwachstum auf herkömmlichen Kunststoffwaren und 3D-Enteroidkulturen. Im Vergleich zu Standard-Gewebekulturplatten fördert die Verwendung von Transwells für Monolayer-Kulturen die zelluläre Differenzierung und Organisation in einer Weise, die die Ähnlichkeit mit Darmkrypten beibehält14,25. Die Darmepithelbarriere ist von entscheidender Bedeutung, um die Translokation von Toxinen und Mikroorganismen in den Körper zu verhindern und gleichzeitig die Nährstoffaufnahme zu erleichtern. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie die Barriereintegrität des Darms bei gesunden Menschen funktioniert und bei Darmerkrankungen oder als Reaktion auf Verbindungen verändert wird. Im Gegensatz zu 3D-enteroiden Kulturen ist eine objektive Beurteilung der Integrität der Darmbarriere möglich, wenn Monoschichten auf Transwells kombiniert und TEER gemessen wird, wie hiergezeigt wird 14,25. Die Erzeugung von 2D-Monolayern auf Transwells ermöglicht auch die duale Kultur mit relevanten Zelltypen wie Immun- oder Stromazellen. Auf diese Weise kann die kritische Kommunikation zwischen Darmzellen und Zellen der Gewebemikroumgebung charakterisiert werden, was mit 3D-Kulturen nicht erreicht werden kann. Die Exposition der apikalen Oberfläche der Monoschicht ermöglicht nicht nur die experimentelle Exposition gegenüber Krankheitserregern und Verbindungen und die Sammlung luminaler Produkte, sondern ermöglicht auch Studien zu anderen Aspekten der Darmphysiologie und -krankheit, einschließlich der Untersuchung der intestinalen Mikrobiota und der molekularen Absorptions- oder Transportphysiologie13. Die unabhängige Kontrolle über die apikalen und basalen Darmoberflächen ist ein deutlicher Vorteil gegenüber 3D-enteroidalen Modellen.
Durch mehrere Versuchsexperimente identifizierten wir wichtige Schritte, die zum Erfolg des Protokolls beitrugen. Während ganze Darmgewebeproben über Nacht gekühlt und am nächsten Tag verarbeitet werden können, müssen die Schritte der Gewebedissoziation und Isolierung von Kryptenfragmenten zeitnah durchgeführt werden, um den Zerfall der isolierten Kryptenfraktionen zu verhindern. Nach Abschluss der PBS-Waschvorgänge kann das Zentrifugieren der Krypten in Waschmedien dazu beitragen, den Zerfall der Krypten zu verhindern, wie in Schritt 2.3.10 beschrieben. Bei der Passage der Enteroide oder bei der Ernte für die Monolagenbildung ist es wichtig, die Enteroide von den BME-Kuppeln zu trennen. Das Waschmedium muss eiskalt sein, um die Auflösung des BME zu unterstützen. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von vorgewärmtem TrypLE und die zweimalige Filterung der Zellsuspension dazu beitragen, die für die Monolayer-Erzeugung erforderlichen Einzelzellen zu bilden. Schließlich kann das manuelle Manövrieren der Platte in Form der Zahl 8 dazu beitragen, die einzelnen Zellen gleichmäßig über den Transwell-Einsatz zu verteilen.
Eine wichtige Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die 2D-Monolagen aus enteroiden Stämmen hergestellt wurden, die von einem ausgewachsenen Holstein-Ochsen (>2 Jahre alt) erzeugt wurden. Der reifende Magen-Darm-Trakt bei Kälbern kann geringfügige Änderungen des beschriebenen Protokolls erforderlich machen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Rassespezifische Unterschiede in der Darmphysiologie von Rinderrassen sind in der Literatur beschrieben26. Es ist zwar nicht bekannt, ob sich diese Unterschiede auf die Generierung von Enteroiden und nachfolgenden Monolayern auswirken könnten, aber wir vermuten, dass alle Unterschiede nur zu geringfügigen Änderungen an unserem Protokoll führen würden. Darüber hinaus hat das 2D-Kulturmodell einige inhärente Nachteile. Im Vergleich zu 3D-enteroidalen Modellen können 2D-Kulturen einige Aspekte der Darmgewebearchitektur und der zellulären Vielfalt fehlen und Einschränkungen und Herausforderungen im Zusammenhang mit der Vermehrung von 2D-Kulturen verursachen13. Dennoch zeigen Studien, dass einige Monolagen die erwartete Kryptenorganisation emulieren können27, und einige dieser Einschränkungen könnten sogar durch die Etablierung von 2D-Kulturen mit einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche überwunden werden. Nichtsdestotrotz sollten die Grenzen dieses Modells umfassend berücksichtigt werden, um festzustellen, ob seine Anwendung für die gestellte experimentelle Frage geeignet ist.
Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes Kultursystem, das den Magen-Darm-Trakt von Rindern unter Verwendung von Enteroiden aus dem bovinen Ileum modelliert, um Monoschichten auf Transwell-Inserts zu bilden. Mit einem breiten Anwendungsspektrum von der Erforschung von Infektionskrankheiten über die Arzneimittelforschung bis hin zur regenerativen Medizin könnte dieses Hochdurchsatz-Kultursystem zu einer beispiellosen Entwicklung präventiver und therapeutischer Strategien führen, die für die Gesundheit von Mensch und Tier von gegenseitigem Nutzen sein könnten.

Tiermodelle in der Forschung spielen eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses der Pathophysiologie von Krankheiten und der Dynamik der Immunantwort des Wirts während einer Infektion und unterstützen die Entwicklung neuartiger präventiver und therapeutischer Strategien 1,2,3,4. Diese Modelle unterstützen die Forschung, Entdeckung und Weiterentwicklung an Tieren und sind der Schlüssel zum Fortschritt der Forschung im Bereich der menschlichen Gesundheit. Seit Jahrzehnten untermauern Nagetiermodelle die Fortschritte in den Immunmechanismen und in der biologischen Grundlagenforschung für menschliche Krankheiten 3,5,6,7. Während Nagetiermodelle für das Screening und die frühe Entwicklungsforschung von entscheidender Bedeutung sind, bieten Großtiermodelle einen relevanteren Vergleich bei der Erforschung menschlicher Krankheiten sowohl in frühen Entdeckungs- als auch in späteren Entwicklungsstudien, einschließlich therapeutischer Wirksamkeits- und Sicherheitstests 1,3,4,5. Nutztiere bieten im Vergleich zu Nagetiermodellen klare Vorteile für eine effizientere Translation für den Menschen bei einigen Krankheiten, darunter Kryptosporidiose, Salmonellose, Tuberkulose, Respiratorisches Synzytial-Virus und Brucellose 1,7,8. In der Tat entwickeln sich diese und andere Krankheiten spontan bei Rindern, die mehrere analoge Krankheitspathogenesen und Immunprozesse wie der Mensch teilen, und als unterzüchtete Population ahmen Rinder die genetische und umweltbedingte Heterogenität nach, die die menschliche Immunantwort beeinflusst 5,8,9,10 . Der Nutzen von Rindermodellen für die Erforschung von Infektionskrankheiten kann maximiert werden, indem zunächst ein ausgeklügeltes Kultursystem eingesetzt und dann schrittweise In-vivo-Studien durchgeführt werden. Der erstmalige Einsatz eines hochkomplexen, aus Rindern gewonnenen Kultursystems kann die Anzahl der Lebendtierstudien erheblich reduzieren und gleichzeitig die Chancen auf eine erfolgreiche translationale und angewandte Forschung verbessern. Kulturmodelle sollten die Krankheitsprozesse auf Organebene rekapitulieren, um eine optimale prädiktive Validität zu erzielen und die native Gewebemikroumgebung räumlich und funktionell beizubehalten.
Die mukosale Immunantwort ist ein facettenreiches System, das aus einer hocheffizienten Barriere besteht, die aus gastrointestinalen Enterozyten und verschiedenen Populationen von Immunzellen besteht, die sich unterhalb der Schleimhautoberfläche befinden11. Dieses hochkomplexe System ist während einer Infektion entscheidend für die Aufrechterhaltung der gastrointestinalen Homöostase und die Initiierung der Immunabwehr gegen enterische Pathogene11. Die Kommunikation zwischen Enterozyten und den Zellen des angeborenen Immunsystems initiiert die Entwicklung schützender Immunantworten gegen pathogene Mikroorganismen. Daher sind Kultursysteme, die in ihrer Komplexität vergleichbar sind, für eine optimale Untersuchung von Wirt-Darmpathogen-Interaktionen notwendig und sehr effektiv für das Verständnis der enterischen Physiologie sowie der Wirkstoffforschung und -entwicklung 12,13. Organoide sind ein robustes Kultursystem, das der Architektur und Funktion des Ursprungsgewebes ähnelt14,15. Die Vielzelligkeit dieser Modelle ermöglicht die Untersuchung der Rolle verschiedener Zellpopulationen und der zellulären Interaktionen, die an der Darmgesundheit und -erkrankung beteiligt sind12,14. Allerdings sind humane Organoidmodelle in der Forschung derzeit durch die Schwierigkeit, eine ausreichende Menge und gleichbleibende Qualität menschlicher Darmepithelzellen zu erhalten, und die begrenzte Zelllebensfähigkeit in Kultur begrenzt. Immortalisierte Zelllinien können verwendet werden, um in diesen Modellen konsistent hohe Ausbeuten an homologen Kulturen zu erzielen; Transformierten Zellen fehlt jedoch von Natur aus die Diversität und funktionelle Komplexität von nicht-transformierten Epithelzellen16,17. Zu den Vorteilen der Verwendung von Kulturen aus Rindergewebe als Modell für die Untersuchung von Magen-Darm-Erkrankungen und -Physiologie gehören die Leichtigkeit, mit der Gewebeproben konsistent von gesunden Spendern gewonnen werden können, eine verbesserte Zelllebensfähigkeit und eine größere zelluläre Vielfalt, die nur mit nicht immortalisiertem Gewebe erreicht werden kann. Vergleichende Gewebetranskriptomik und Charakterisierung von intestinalen Organoiden zeigen Ähnlichkeiten in konservierten orthologen Genen und zellulären Potenzialen zwischen Mensch und Rind18. Daher kann ein aus Rinderorganoiden gewonnenes Kultursystem bei der Untersuchung menschlicher Darmerkrankungen von Vorteil sein, wobei die Ergebnisse leicht auf die Humanmedizin übertragbar sind. 
Das hierin beschriebene Protokoll beschreibt eine effektive Plattform zur Bewertung von Wirtsreaktionen auf enterische Krankheitserreger oder Verbindungen und die Darmphysiologie unter Verwendung eines aus Rinderenteroiden gewonnenen 2D-Primärzellkultursystems. Im Gegensatz zu 3D-Organoiden ermöglichen 2D-Kultursysteme, die auf Transwell-Inserts erzeugt werden, eine duale Kultur von Darmzellen mit Immun- oder Stromazellen, was eine Untersuchung der Dynamik auf Gewebeebene ermöglicht. Mit Anwendungen in der biomedizinischen Forschung, der pharmazeutischen Entwicklung und der Wirksamkeitsprüfung kann dieses physiologisch relevante Modell der Gesundheit und dem Fortschritt von Rindern und Menschen gleichermaßen zugute kommen.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL Pipettenspitze&nbsp;</td><td>MidSci</td><td>PR-200RK-S</td><td></td></tr><tr><td>1 & Mikro; m PET 24-Well-Zellkultureinsätze&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353104</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Pipettenspitze&nbsp;</td><td>MidSci</td><td>PR-1250RK-S</td> 22 G Nadel <td></td></tr><tr><td></td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Kulturgefäß&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M-Zell-Sieb&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Pipettenspitze</td><td>Fisher scientific</td><td>30075307</td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Spritze</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309647</td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin -18 (C-04)</td><td>Abcam</td><td>AB668-1001</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement ohne Vitamin A&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12-587-010</td><td></td></tr><tr><td>Belysa Software</td><td>Luminex</td><td>40-122</td><td>Software zur Anpassung von Immunoassay-Kurven&nbsp;</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Caspofunginacetat</td><td>Selleckchem</td><td>S3073</td><td></td></tr><tr><td>Zelllifter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>Chromogranin-A (E-5)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271738</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-C</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Neptune scientific</td><td>3471.X</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Ultimatrix RGF BME&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>BME001-05</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)-Lösung</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERR0861</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F-12 1.1 Medium (mit L-Glutamin, ohne HEPES)</td><td>Cytiva</td><td>SH30271.01</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3195</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>MT35070CV</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Glasmikroskop-Objektträger&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-07</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid-Differenzierungsmedium (Mensch)</td><td>StemCell Technologies</td><td>100-0214</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid-Wachstumsmedium (Mensch)</td><td>StemCell Technologies</td><td>0-6010</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700&nbsp;</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299 (Galunisertib)</td><td>Selleckchem</td><td>S2230</td><td></td></tr><tr><td>MAGPIX System</td><td>Luminex</td><td>Magpix System Kompaktes</td><td>Multiplexgerät</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX Rinderzytokin/Chemokin-Magnetbead-Panel</td><td>MilliporeSigma</td><td>BCYT1-33K</td><td>Bead-basierter Multiplex-Assay&nbsp;</td></tr><tr><td>Herr Frosty Behälter&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2103</td><td></td></tr><tr><td>NutriFreeze D10 Kryokonservierungsmedien&nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>05-713-1B</td><td></td></tr><tr><td>Orbitale Schüttelplattform</td><td>Thermo Fisher</td><td>88880021</td><td></td></tr><tr><td>Pam3Csk4</td><td>invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm Dichtungsfolie</td><td>dot scientific inc.</td><td></td><td></td>#HS234526C</tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%ige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-FITC&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>5782/12U</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Glas Antifading</td><td>Invitrogen</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human-Lyzozym (EC3.2.1.17)</td><td>Agilent Technologies</td><td>A009902-2</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (FHPI)</td><td>Selleckchem</td><td>S1077</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad</td><td>Thermo Fisher</td><td>MaxQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>VWR</td><td>BDH7465-2</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Teknova</td><td>S6525</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau Farbstoff&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE-Expression-Enzym&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>zwischen 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr><tr><td>Voltohmmeter&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>Millicell ERS-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen monolayer-kultursystems für anwendungen in der translationalen biomedizinischen forschung

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoide Zellkultursysteme können die in Geweben beobachtete Komplexität rekapitulieren, was sie für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von Medikamenten und das Bioengineering von Geweben nützlich macht. Die Anwendung dieser Modelle aus den beschriebenen Gründen kann jedoch aufgrund der dreidimensionalen (3D) Natur dieser Modelle eingeschränkt sein. Zum Beispiel ist die Verwendung von 3D-enteroiden Kultursystemen zur Untersuchung von Verdauungserkrankungen aufgrund der Unzugänglichkeit des Darmlumens und seiner sekretierten Substanzen eine Herausforderung. In der Tat erfordert die Stimulation von 3D-Organoiden mit Krankheitserregern entweder eine luminale Mikroinjektion, eine mechanische Störung der 3D-Struktur oder die Erzeugung von apikalen Enteroiden. Darüber hinaus können diese Organoide nicht mit Immun- und Stromazellen kokultiviert werden, was eine eingehende mechanistische Analyse der pathophysiologischen Dynamik einschränkt. Um dies zu umgehen, haben wir ein zweidimensionales (2D) enteroidabgeleitetes Monolayer-Kultursystem für bovine Primärzellen optimiert, das eine Co-Kultur mit anderen relevanten Zelltypen ermöglicht. Ileumkrypten, die von gesunden erwachsenen Rindern isoliert wurden, wurden kultiviert, um 3D-Organoide zu erzeugen, die für die zukünftige Verwendung kryokonserviert wurden. Eine 2D-Monoschicht wurde aus wiederbelebten 3D-Enteroiden hergestellt, die durchgelassen und aufgebrochen wurden, um Einzelzellen zu erhalten, die auf mit Basalmembranextrakt beschichteten Transwell-Zellkultureinsätzen ausgesät wurden, wodurch ihre apikale Oberfläche freigelegt wurde. Die intestinale Monolayer-Polarität, die zelluläre Differenzierung und die Barrierefunktion wurden mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands charakterisiert. Die Stimulation der apikalen Oberfläche der Monoschicht zeigte die erwartete Funktionalität der Monoschicht, die durch die Zytokinsekretion sowohl aus apikalen als auch aus basalen Kompartimenten demonstriert wurde. Das beschriebene 2D-Enteroid-abgeleitete Monolayer-Modell ist vielversprechend für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen und der Darmphysiologie, der Arzneimittelentwicklung und der regenerativen Medizin.

Der erste Schritt bei der Erzeugung von 2D-Enteroid-abgeleiteten Monolayern besteht darin, den entnommenen Schnitt des Darmgewebes (Abbildung 1A) für die Gewebedissoziation vorzubereiten. Dazu wird das anhaftende Fett und das Mesenterium aus dem Gewebe entfernt (Abbildung 1B), gefolgt von einem Längsschnitt des Gewebes, um die Lumenoberfläche freizulegen, so dass die Schleimschicht des Darms durch sanftes Abkratzen mit einem Glasobjektträger entfernt werden kann. Der entnommene Darmschnitt wird dann in immer kleinere Gewebeabschnitte geschnitten (Abbildung 1C), um die Dissoziation zu erleichtern. Die Krypten werden dann mit einer Reihe von Waschungen, die aus Chelatpuffern (Abbildung 1D,E) und PBS bestehen, vom darunter liegenden submukösen Gewebe dissoziiert. Die isolierten Darmkrypten (Abbildung 1F) werden dann in Basalmembran-Matrixkuppeln eingebettet (Abbildung 2A) und mehrere Tage lang kultiviert, um 3D-Enteroide zu erzeugen. Aus einem 10-Zoll-Schnitt des bovinen Ileums können etwa 900.000 Krypten isoliert und für die Enteroidbildung verwendet werden. Bereits nach wenigen Stunden in Kultur beginnen sich die plattierten Krypten zu verlängern und entwickeln sich zu Enterosphären (Abbildung 2B). Nach 2 Tagen kann ein gut definiertes Lumen beobachtet werden (Abbildung 2C), wobei Knospenstrukturen bereits am 4. Tag in Kultur festgestellt werden (Abbildung 2D). Am 7. Tag haben sich reife Enteroide entwickelt (Abbildung 2E). Die Immunfluoreszenzfärbung von 7 Tage alten 3D-Enteroiden zeigt das Vorhandensein verschiedener Zelllinien. Die konfokale Mikroskopie von Enteroiden zeigt die Lokalisierung der DAPI-Kernfärbung, des E-Cadherin-Proteins an der Adhärenzverbindung, der Chromogranin-A (Chr-A)-Färbung, die das Vorhandensein von enteroendokrinen Zellen zeigt, des Lysozyms (LYZ), das Paneth-Zellen demonstriert, und des Zytokeratin-18 (CK-18), das Enterozytenzellen repräsentiert (Abbildung 3). Nach 7-10 Tagen in Kultur sollten die Enteroide durchgelassen werden, um eine weitere Ausdehnung zu ermöglichen und eine Überfüllung zu verhindern. Die optimale Zeit bis zur Passage von Enteroiden wurde auf 7-10 Tage nach der anfänglichen Isolierung der Primärkrypte festgelegt und hängt letztendlich von der Gesundheit und Wachstumsrate der Enteroide in Kultur ab. Die optimale Aussaatdichte, um die gewünschte enteroide Morphologie und Lebensfähigkeit zu erreichen, wie in Abbildung 2E dargestellt, beträgt 400 Krypten pro Kuppel. Enteroide können leicht kryokonserviert werden, und die aufgetauten enteroiden Fragmente erholen sich nach zwei Passagen nach dem Auftauen vollständig für experimentelle Zwecke. Bemerkenswert ist, dass vor der Kryokonservierung mindestens zwei Passagen der primären Kryptenkultur empfohlen werden.
Um eine 2D-Enteroid-abgeleitete Monoschicht herzustellen, werden die 3D-Enteroide geerntet und in einer Reihe von Schritten in Gegenwart einer Dissoziationslösung (Abbildung 4A) mechanisch in einzelne Zellen zerrieben. Diese Einzelzellen können dann auf einen Transwell-Einsatz gesät werden, der mit einer Basalmembran-Matrix-Nährmedienlösung vorbeschichtet wurde. Im Durchschnitt können vier Transwells aus vier 3D-enteroiden Kuppeln ausgesät werden. Die Anzahl der verarbeiteten 3D-Enteroide hängt somit von der Anzahl der Transwells ab, die für das Experiment benötigt werden. Die Beschichtung einzelner Zellen mit einer Aussaatdichte von 1 x 105 und deren anfängliche Kultivierung in Gegenwart von 20 % FBS (Abbildung 4B-D) kann in weniger als 1 Woche eine konfluente Monoschicht erzeugen. Die fortschreitende Konfluenz der 2D-Monoschicht in Kultur kann im Laufe der Zeit mit Hilfe der Lichtmikroskopie überwacht werden (Abbildung 4E,F). Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) können die Konfluenz bestätigen und die Integrität der Epithelbarriere im Laufe der Zeit und als Reaktion auf experimentelle Stimulation charakterisieren (Abbildung 5A). Im Durchschnitt hat eine etwa 100% konfluente Monolage nach sieben Tagen in Kultur einen entsprechenden TEER-Wert von ~1500 Ω·cm2. Eine longitudinale Bewertung der 2D-enteroiden Monolayer-TEER-Werte zeigt einen stetigen Anstieg der TEER-Werte über sieben Tage und erreicht einen maximalen Durchschnittswert von 1546 Ω·cm2, bevor er mit dem niedrigsten Wert von 11,5 Ω·cm2 am zwölften Tag abnimmt (Abbildung 5B). Die immunfluoreszierende Markierung differenzierter Monoschichten zeigt, dass mit diesem Protokoll intakte, organisierte, polarisierte Darmepithelschichten gebildet werden (Abbildung 6). Die konfokale Mikroskopie der gefärbten 2D-Monoschicht zeigt die Lokalisierung der DAPI-Kernfärbung, der E-Cadherin- und der F-Aktin-Färbung (Abbildung 6A-D). Die Fluoreszenzmikroskopie der 2D-Monoschicht zeigt Kennzeichen differenzierter Darmepithelzellen, wobei die Chromogranin-A (Chr-A)-Färbung das Vorhandensein von enteroendokrinen Zellen, Lysozym (LYZ) Paneth-Zellen und Cytokeratin-18 (CK-18) auf Enterozytenzelllinien hinweisen (Abbildung 6E-L). Die Z-Stack-Modellierung zeigt die erwartete Polarisation der 2D-Monolayer-Kultur mit charakteristischer Ablagerung von F-Aktin, das in den Mikrovilli gefunden wird, die den apikalen Aspekt der differenzierten Enterozyten abdecken, und E-Cadherin, einem Protein, das sich an den Adhärenzverbindungen befindet, die zwischen Epithelzellen verteilt sind (Abbildung 6M).
Die Funktionalität der Monoschicht kann durch apikale Stimulation mit verschiedenen Komponenten, einschließlich Toll-like-Rezeptor (TLR)-Liganden oder Pathogenen, beurteilt werden, gefolgt von der Zytokinquantifizierung von Zellkulturüberständen, die aus den apikalen und basalen Kompartimenten gewonnen wurden. Wenn der apikale Aspekt der Monoschicht am Tag 4 der Kultur für 24 Stunden mit dem TLR 1/2-Agonisten Pam3csk4 stimuliert wird, wird im Vergleich zu den unbehandelten Monolayern eine erhöhte Zytokinproduktion in beiden Kompartimenten beobachtet (Abbildung 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig1.jpg"> Abbildung 1: Isolierung der Darmkrypte von Rindern von gesunden erwachsenen Rindern. Bilder, die die Gewebeverarbeitung von (A) ganzem ausgewachsenem Rinder-Ileum, (B) entfettetem Ileum, (C) Ileum, das in 6,3 cm (2,5 Zoll) große Stücke in PBS auf Eis geschnitten wurde, (D) ilealen Gewebeschnitten in Dissoziationspuffer #1 bei 4 °C und (E) in Dissoziationspuffer 2 in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C und (F) isolierten Ileumkryptenfragmenten veranschaulichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig2.jpg"> Abbildung 2: Primäre 3D-ileale enteroide Entwicklung von Rindern in der Basalmembranmatrix. Repräsentative Bilder von (A) 3D-Enteroidkuppeln, die in einer 6-Well-Gewebekulturplatte erstellt wurden, und (B-E) 3D-Enteroidentwicklung von den Tagen 0, 2, 4 und 7 in Kultur. Maßstabsleiste = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig3.jpg"> Abbildung 3: Dreidimensionale intestinale Enteroide zeigen die Färbung der Epithelzelllinie. Repräsentative Bilder von 3D-Enteroiden nach 7 Tagen in Kultur zeigen das Vorhandensein von Kernfärbung, F-Aktin, Zytokeratin-18 (CK-18), Chromogranin-A (Chr-A), Ecadherin (E-cad), Lysozym (Lyz) und Überlagerung von Bildern (Merge). Maßstabsleiste 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig4.jpg"> Abbildung 4: Etablierung einer 2D-Enteroid-abgeleiteten Monoschicht aus ilealen Enteroiden. Repräsentative Bilder von (A) 3D-Enteroidfragmenten in Dissoziationslösung zur Vorbereitung für das Monolayer-Seeding, Einzelzellen, die auf einem Transwell-Insert mit einer Seeding-Dichte von 1 x 105 plattiert wurden, die am Tag 0 mit (B) Licht, (C) Phasenkontrast und (D) Hellfeldmikroskopie abgebildet wurden, und Monolayer-Entwicklung auf Transwell-Inserts, die am fünften Tag mit (E) Phasenkontrast und (F) Hellfeldmikroskopie. 40-fache Vergrößerung und Maßstabsleiste = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig5.jpg"> Abbildung 5: Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) der 2D-enteroidabgeleiteten Monoschicht auf Transwell-Einsätzen. (A) Schematische Darstellung der TEER-Messungen der 2D-Monoschicht der Darmepithelzellen (IEC) mit den STX2-Essstäbchenelektroden eines Voltohmmeters, (B) Längsschnittüberwachung von 2D-Monolayer-TEER-Messungen über 12 Tage in Zellkultur. Jeder Datenpunkt stellt einen durchschnittlichen TEER-Wert und einen Standardmittelwert (SEM) dar, der aus zwei technischen Replikaten ermittelt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig6.jpg"> Abbildung 6: Differenzierte 2D-enteroide Monoschichten auf Transwell-Inserts entwickeln sich zu polarisierten Darmepithelschichten. (A-M) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder einer 2D-Enteroid-abgeleiteten Monoschicht auf dem Transwell-Insert nach 5 Tagen in Kultur, die den (A) Zellkern (blau), (B) E-Cadherin (Rot), (C) F-Aktin (grün) und (D) Overlay der 3 Bilder (Merge), (E,I) Kernfärbung, (F) Chromogranin-A, (J) Cytokeratin-18, (G,K) Lysozym und (H,L) Merge der Bilder zeigen. (M) Z-Stapel-Modellierung, die die Verteilung der gleichen Epithelzell-Markerproteine des 2D-Monolayer-Blattes zeigt. Die Bilder wurden von 2 biologischen Replikaten erhalten. Maßstabsleiste = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig7.jpg"> Abbildung 7: Bovine primäre 2D-enteroide Monolayer auf Transwell-Inserts sind funktionell aktiv. Apikale und basale Zellkultur-Zytokinsekretion von (A) IL-1α und (B) IL-8 durch 2D-Monolayer auf Transwell-Inserts nach 5 Tagen in Kultur, die 24 h lang unbehandelt oder mit Pam3csk4 stimuliert wurden. Die Daten sind repräsentativ für die durchschnittlichen Zytokinspiegel und SEM von Monoschichten, die aus gefrorenen Kryptenbeständen eines Tierversuchs und drei unabhängigen Experimenten stammen. Die Zytokine wurden mit dem Bead-basierten Multiplex-Assay (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert und auf einer kompakten Multiplexeinheit (Table of Materials) und einer Immunoassay-Kurvenanpassungssoftware (Table of Materials) analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Stamm- und Endkonzentration der Reagenzien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um die Tabelle herunterzuladen.</a>

Enteroide entwickeln sich zu einem neuen Modell für die Untersuchung der Gewebephysiologie und Pathophysiologie, der Arzneimittelentwicklung und der regenerativen Medizin. Hier beschreiben wir ein bovines primäres 2D-enteroides Kultursystem, das eine Co-Kultivierung mit relevanten Gewebezelltypen ermöglicht. Dieses Modell bietet einen translationalen Vorteil für die gastrointestinale Forschungsmodellierung.

Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

Unser Labor konzentriert sich auf die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen und der Immunzelldynamik, die nach einer Infektion auftritt. Durch die Verwendung eines robusten Zellkulturmodells hoffen wir, die komplexen Wechselwirkungen, die in vivo auf Gewebeebene auftreten, genauer widerzuspiegeln. Einem Teil der veröffentlichten Literatur, die die Intergeneration bei Rindern beschreibt, fehlen die notwendigen Details, damit das Protokoll leicht reproduzierbar ist, was seine Anwendung durch unerfahrene Forscher schwierig macht.Der Vorteil unseres Modells besteht darin, dass wir ein äußerst detailliertes Protokoll bereitstellen, das von unerfahrenen Forschern erfolgreich angewendet werden kann. Die Herstellung von Transwell-Monolayern ermöglicht die Co-Kultur mit Immunzellen und ermöglicht so Einblicke in die Interaktion mit Gewebepathogenen bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung einer In-vivo-ähnlichen Organisation. Dieses vielseitige Modell ist wertvoll für die Untersuchung zahlreicher Rinderkrankheiten mit einer Komplexität, die über Einzelzellmodelle hinausgeht.Unser Labor wird dieses Modell verwenden, um die Immunfaktoren zu untersuchen, die die Anfälligkeit für eine Kryptosporidium-Infektion beeinflussen. Es wird den Vergleich zwischen erwachsenen Rindern und Kälbern erleichtern und gleichzeitig die Gewebearchitektur in der Mikroumgebung der Immunzellen erhalten. Die Erkenntnisse aus dieser Arbeit haben ein direktes translationales Potenzial für die menschliche Gesundheit.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man murine primäre epitheliale Dickdarmmonoschichten direkt aus Darmkrypten erzeugt. Wir bieten experimentelle Ansätze zur Erzeugung konfluenter Monoschichten auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für die Kratzwundeheilung und biochemische Studien sowie spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Diese Studie stellt ein Protokoll zur Generierung von 2D-Monoschichten des Rinderdarms aus Organoiden vor, das einen verbesserten Zugang zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen bietet. Es umfasst Methoden zur Bewertung der Membranintegrität und -funktionalität und entwickelt In-vitro-Modelle weiter, die die Magen-Darm-Physiologie von Rindern nachahmen. Dieser Ansatz verspricht erhebliche biomedizinische und landwirtschaftliche Vorteile, einschließlich verbesserter Behandlungsstrategien.

Fortschritte in der Rinder-Organoid-Technologie unter Verwendung von Dünn- und Dickdarm-Monolayer-Grenzflächen

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Diese Studie beschreibt Diagnose der Aviären Influenza bei Wildvögeln mit einem tragbaren rRT-PCR-System. Die Methode nutzt die Vorteile der gefriergetrockneten Reagenzien auf Wildvögel in einem Nicht-Labor-Einstellung, die typisch für einen Ausbruch Szenario Bildschirm. Verwenden von molekularen Werkzeugen bietet genaue und empfindliche Alternativen für eine schnelle Diagnose.

Schnelle Diagnose der Aviären Influenza Virus bei Wildvögeln: Verwendung eines tragbaren rRT-PCR und gefriergetrocknet Reagenzien in das Feld

Das Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Modellsystem zur Untersuchung Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Latenz und Reaktivierung. Der Test verwendet homogene sympathischen Neuronen Kulturen und ermöglicht die molekulare Analyse der Virus-Neuron-Wechselwirkungen unter Verwendung einer Vielzahl von Anwendungen, wie RNA-Interferenz und Expression von rekombinanten Proteinen.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Wir beschreiben ein Verfahren zur genetischen Veränderung primären humanen T-Zellen mit einem Transgen unter Verwendung des...

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Dieses Protokoll beschreibt den in vitro - Vergleich von zwei wichtigen funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindungs und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) Induktion. Die Verfahren wurden für eine Seite-an-Seite-Vergleich zwischen Referenz Rituximab und einem Rituximab biosimilar eingesetzt. Diese Assays kann während der Biosimilar Entwicklung oder als Qualitätskontrolle in der Produktion eingesetzt werden.

In - vitro - Methoden zum Vergleich der Zielbindungs und CDC Induktion zwischen Therapeutische Antikörper: Anwendungen in Biosimilarity Analyse

Die Elektroporation der nächsten Generation ist eine effiziente Methode zur Transfektion menschlicher Th17-Zellen mit kleinen RNAs, um die Genexpression und das Zellverhalten zu verändern.

Kleine RNA Transfektion in primären humanen Th17-Zellen durch Next Generation Elektroporation

Erfahren Sie die Erstellung eines bovinen primären enteroiden 2D-Monolayer-Kultursystems für gastrointestinale Forschung. Dieses detaillierte Protokoll ermöglicht Ko-Kulturen mit Immunzellen und Untersuchungen zu Wirt-Pathogen-Interaktionen.

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Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung

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