Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität in einem Tumor-Sphäroid-Modell: Anwendung für die Wirkstoffforschung

Eine der wirksamsten zielgerichteten Krebstherapien basiert auf Antikörpern wie dem Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab. Die krebshemmende Wirkung von Trastuzumab beinhaltet die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) durch natürliche Killer- oder NK-Zellen. Das Verständnis von Mechanismen, die die Empfindlichkeit von Krebszellen gegenüber einer Anti-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Antikörpertherapie unter besonderer Berücksichtigung von ADCC regulieren, könnte für die Entwicklung neuartiger, effizienterer Behandlungsmodalitäten von entscheidender Bedeutung sein.

3D-Modelle wie Krebszell-Sphäroide erwiesen sich als überlegen bei der Vorhersage von Immunantworten von Tumoren auf verschiedene Krebstherapien. Daher haben wir ein ADCC-Sphäroidmodell mit der natürlichen Killerzelllinie NK92, GFP-exprimierenden JIMT-1-Mammakarzinomzellen und Trastuzumab aufgebaut. Wir haben das ADCC-Assay-System aufgebaut, indem wir die Anti-HER2-positiven JIMT-1-Brustkarzinomzellen dazu gebracht haben, dreidimensionale Cluster zu bilden, die als Sphäroide bezeichnet werden.

Die in den Experimenten verwendete JIMT-1-Zelllinie exprimiert stabil das grün fluoreszierende Protein. Wir beginnen das Experiment, indem wir die 96-Well-Platte für die Bildung von Sphäroiden vorbereiten. Um einen U-förmigen und zellabweisenden Boden zu schaffen, beschichten Sie die 96-Well-Platte mit einer Lösung von 0,5%iger Agarose in PBS.

Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für ca. 30 bis 45 Minuten. In der Zwischenzeit werden JIMT-1-Zellen für die Zellaussaat trypsinisiert und gezählt. Waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern sterilem PBS.

Geben Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA in den Kolben und stellen Sie den Kolben für 10 Minuten zurück in einen CO2-Inkubator. Klopfen Sie nach der Inkubation auf den Kolben, um zu überprüfen, ob sich JIMT-1-Zellen abgelöst haben. Stoppen Sie den Aufschluss mit zwei Millilitern JIMT-1-Medium und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau in einer Burker-Kammer und stellen Sie die Zellzahl auf 20.000 Zellen pro ml ein. Säen Sie die Zellen in die 96-Well-Platte, indem Sie 100 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung pipettieren, um Sphäroide zu bilden. Lassen Sie die Zellen während der dreitägigen Inkubationszeit bei 37 Grad in einem CO2-Inkubator verklumpen.

Überprüfen Sie regelmäßig die Größe und Form von Sphäroiden mit einem inversen Mikroskop. Am dritten Tag nach der Sphäroide-Induktion wird die 96-Well-High-Content-Screening-Platte mit einer Lösung von Pluronic F-127 in DMSO beschichtet. Die Beschichtung ist entscheidend, um das Anhaften von JIMT-1 EGFP-Sphäroiden an der Glasoberfläche oder der Platte zu verhindern.

Nach einer Inkubationszeit von 45 Minuten bei Raumtemperatur wird die Beschichtungslösung abgesaugt und die Vertiefungen zweimal mit serumfreien DMEM F12-Medien gewaschen. Die Sphäroide werden mit einer Ein-Milliliter-Pipette in dreifacher Ausführung auf die 96-Well-High-Content-Screening-Platte übertragen. Fügen Sie Sunitinib mit einer Konzentration von 40 Mikromolaren Werten in 10 Mikrolitern pro Well hinzu und pipettieren Sie frisches JIMT-1-Medium in die Kontrollwellen, um das Volumen zu erhöhen.

Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad. Während die Inkubation der vorbehandelten Sphäroide läuft, werden die NK92-Zellen aus dem Kolben in ein 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau in einer Burker-Kammer und passen Sie die Zellzahl an, um ein Effektor-Ziel-Verhältnis von 20 zu 1 zu erreichen.

Färben Sie die NK-Zellen mit einer 10-Mikromol-Lösung von CellTracker Blue und legen Sie sie für eine Stunde bei 37 Grad in einen CO2-Inkubator. Um den Überschuss des Farbstoffs zu waschen, zentrifugieren Sie die NK-Zellen zweimal bei 150 RCF für drei Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie dann die Zellen in frischem JIMT-1-Medium.

Die gefärbten NK-Zellen werden zu den Ziel-JIMT-1 EGFP-Sphäroiden hinzugefügt, indem 55 Mikroliter pro Well zusammen mit dem Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab pipettiert werden. Trastuzumab wird in JIMT-1-Medien verdünnt, um eine Konzentration von 10 Mikrogramm pro ml zu erreichen. Geben Sie die 110 Mikroliter frisches JIMT-1-Medium in die Kontrollvertiefungen und inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad.

Infolgedessen beträgt das Gesamtvolumen der für das ADCC hinzugefügten Behandlung 110 Mikroliter und die endgültige Sunitinib-Konzentration 20 Mikromol pro Liter. Um den apoptotischen Zelltod nach den Behandlungen zu erkennen und zu messen, färben Sie die Sphäroide eine Stunde lang mit einem Annexin V Alexa Fluor 647-Konjugat in JIMT-1-Medien. Nachdem die Versuchsschritte abgeschlossen sind, überführen Sie die Platte in das High-Content-Analysegerät.

Die Platte wird 24 Stunden nach der Zugabe der NK-Faktoren zu den Zielzellen abgebildet. Für die Bildgebung verwenden wir den High-Content-Analysator und eine Bildanalysesoftware. Wählen Sie den Typ der Mikroplatte aus der Liste der Platten mit der Option Plattentyp aus.

Verwenden Sie eine 96-Well-Screening-Platte mit hohem Inhalt. Wählen Sie zwei Peak-Autofokus als Assays aus, die in Platten mit einem 10-fach-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,3 durchgeführt werden, wobei Sie die Autofokus- bzw. Objektivoptionen verwenden. Wählen Sie den konfokalen Modus mit der Option OptiMode und wenden Sie Binning 2 auf die Option Binning an.

Wählen Sie für die Bildgebung von Sphäroiden die entsprechenden Kanäle mit der Option Kanalauswahl aus. Um die EGFP-transfundierten JIMT-1-Zellen zu detektieren, wählen Sie EGFP mit einer Integrationszeit von 200 Millisekunden, einer Laserleistung von 50 %, einer Stapelhöhe von zwei Mikrometern, einer Anregung von 488 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 500 bis 550 Nanometern. Und um apoptotische Zellen zu erkennen, verwenden Sie die Alexa 647 mit einer Integrationszeit von 100 Millisekunden, einer Laserleistung von 50 %, einer Stapelhöhe von 10 Mikrometern, einer Anregung von 640 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 650 und 760 Nanometern.

Um die NK-Zellen in den Sphäroiden sichtbar zu machen, wählen Sie den folgenden Kanal: DAPI mit 100 Millisekunden Integrationszeit, 50 % Laserleistung, zwei Mikrometer Stapelhöhe, 405 Nanometer Anregung und 435, 418 Nanometer Emissionswellenlänge. Wählen Sie in der Option Layoutauswahl die Option Z-Stapel aus, da sich die Zellen in den Sphäroiden in der Regel auf verschiedenen Brennebenen des Mikroskops befinden. 10 Ebenen mit einem Abstand von 10 Mikrometern reichen aus, um den gesamten Sphäroidbereich abzudecken.

Legen Sie die Werte der ersten und letzten Ebene auf 0 Mikrometer bzw. 90 Mikrometer fest. Vor Beginn der Messung können mit der Snapshot-Funktion Beispielbilder aufgenommen werden, um die korrekten Einstellungen zu überprüfen. Legen Sie die Anzahl der Wells und Felder für die Bildgebung mit der Option "Definiertes Layout" fest.

Identifizieren Sie die Sphäroide anhand der EGFP-Fluoreszenz oder der JIMT-1-Zellen, indem Sie die Option "Feiner Texturbereich" verwenden, und filtern Sie sie nach Größe heraus. Entfernen Sie Rahmenobjekte mithilfe des Moduls "Population auswählen". Da die Annexin-positiven Zellen auf den peripheren Sphäroiden erscheinen, ist die Annexin-Intensität im apoptotischen Ring zu messen.

Legen Sie im Modul "Region auswählen" den äußeren Rand auf minus 90 fest. Die Intensitätswerte des Annexins werden als mittlere Intensität angegeben. Wie die Annexin-V-Färbung zeigte, führte die Zugabe von NK-Zellen und Trastuzumab zu den JIMT-1-Zellen zum Zelltod in den Tumorsphäroide.

Annexin-positive apoptotische Zellen bildeten sich in der peripheren Zone der Sphäroide. In Abwesenheit von Trastuzumab lösten NK-Zellen jedoch keine Apoptose der Tumorzellen aus. Um zwischen den direkten und ADCC-vermittelten Effekten von Trastuzumab zu unterscheiden, wurde Trastuzumab-Fab2 ohne FC-Region-Bindungsfähigkeit in dieser Studie als Negativkontrolle verwendet.

Da Trastuzumab-Fab2 in diesem Modell unwirksam war, ist es wahrscheinlich, dass der Tumorzelltod über ADCC vermittelt wird. Darüber hinaus reduzierte die Vorbehandlung mit Sunitinib die Annexin-V-Färbung in den Sphäroiden, was die Sunitinib-induzierte ADCC-Resistenz bestätigte und die Verhinderung des apoptotischen Zelltods in JIMT-1-Sphäroiden zeigte, die mit NK-Zellen und Trastuzumab koinkubiert wurden. Diese Daten bestätigten die zytoprotektive Wirkung von Sunitinib im ADCC-Modell und mahnen zur Vorsicht hinsichtlich möglicher Kombinationen von ADCC-basierten Immuntherapien und Sunitinib.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser HCS-Assay für die Identifizierung von ADCC-verstärkenden Verbindungen geeignet sein könnte.