Name: Identifizierung und Analyse myogener Vorläuferzellen in vivo während akuter Skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler Einzelzell-Massenzytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Analyse myogener Vorläuferzellen bei akuter Skelettmuskelverletzung mittels Einzelzell-Massenzytometrie. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung molekularer Signaturen für regenerative Therapien.

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<meta charset="utf8"></head><body>Einzelzell-CyTOF-Analyse myogener Vorläuferzellen bei der Muskelregeneration

<table><tbody><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>20 G Nadel</td><td>KDM</td><td>KD-fein 900123</td><td></td></tr><tr><td>28 G, 0,5 mL Insulinspritze&nbsp;</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>29 G, 0,3 mL Insulinspritze</td><td>BD</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Spritzen</td><td>Terumo medical</td><td>MDSS03SE</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Zellsiebe</td><td>Fisher Scientific</td><td>11587522</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polypropylen-Röhrchen&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrol-Reagenzgläser mit 35 &; Mikro; m Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritzen</td><td>Terumo medical</td><td>SS05LE1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>5-Iod-2-desoxyuridin (IdU)</td><td>Merck</td><td>I7125-5g</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD104 FITC (Klon: 346-11A)</td><td>Biolegend</td><td>123605</td><td>Stock = 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>anti-CD11b APC-Cy7 (Klon: M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101226</td><td>Bestand = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anti-CD31 APC-Cy7 (Klon: 390)</td><td>Biolegend</td><td>102440</td><td>Bestand = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anti-CD45 APC-Cy7 (Klon: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td>Bestand = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anti-CD9 APC (Klon: KMC8)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0091-82</td><td>Bestand = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (Klon: D7)</td><td>Biolegend</td><td>108126</td><td>Bestand = 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-& Alpha; 7 Integrin PE (Klon: R2F2))</td><td>UBC AbLab</td><td>67-0010-05</td><td>Bestand = 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III (4 Laser) Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>405, 488, 561 und 633 nm Laser</td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin 0,3 mg/ml</td><td>Ceva</td><td>Vnr 054594</td><td></td></tr><tr><td>CD104 (Klon: 346-11A)</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td>Dy162; Hauseigene konjugierte</td></tr><tr><td>CD106/VCAM-1 (Klon: 429 MVCAM. A)</td><td>Biolegende</td><td>105701</td><td>Er170; Hauseigene konjugierte</td></tr><tr><td>CD11b (Klon: M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td>Nd148; Hauseigenes konjugiertes</td></tr><tr><td>CD29/Integrin &beta; 1 (Klon: 9EG7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553715</td><td>Tm169; Hauseigene konjugierte</td></tr><tr><td>CD31 (Klon: MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td>Sm154; Hauseigene konjugierte</td></tr><tr><td>CD34 (Klon: RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>551387</td><td>Lu175; Hauseigene konjugierte</td></tr><tr><td>CD44 (Klon: IM7)</td><td>BD Biosciences</td><td>550538</td><td>Yb171; Inhouse-konjugiertes</td></tr><tr><td>CD45 (Klon: MEC 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>550539</td><td>Sm147; Hauseigenes konjugiertes</td></tr><tr><td>CD9 (Klon: KMC8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0091-85</td><td>Yb174; Hauseigene konjugierte</td></tr><tr><td>CD90.2/Thy1.2 (Klon: 30-H12)</td><td>BD Biosciences</td><td>553009</td><td>Nd144; Inhouse-konjugiertes</td></tr><tr><td>CD98 (Klon: H202-141)</td><td>BD Biosciences</td><td>557479</td><td>Pr141; Inhouse-conjugated</td></tr><tr><td>Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td></td></tr><tr><td>Cell-ID Intercalator-Iridium</td><td>Standard Biotools</td><td>201192B</td><td>Kationischer Nukleinsäure-Interkalator</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td>Pt195</td></tr><tr><td>Cisplatin (cis-Diammineplatin(II)-dichlorid)</td><td>Merck</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>Klar 1,5 mL Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ II</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Zählkammer</td><td>Merck</td><td>BR718620-1EA</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4/SDF1 (Klon: 2B11/CXCR4 )</td><td>BD Biosciences</td><td>551852</td><td>Gd158; Hauseigene konjugierte</td></tr><tr><td>DAPI (1 mg/ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Dark 1,5 mL Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>15386548</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Sezierschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (niedriger Glukosegehalt, mit Pyruvat)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz)</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>Na2EDTA-2H20</td></tr><tr><td>EQ Vier-Elemente-Kalibrierperlen (EQ-Kügelchen)</td><td>Standard Biotools</td><td>201078</td><td>Kalibrierkügelchen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, brasilianischen Ursprungs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5SF</td><td>Fein Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #7</td><td>Hounisen.com</td><td>1606.3350</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Helios CyTOF System</td><td>Standard</td><td>Biotools N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum, hitzeinaktiviert, neuseeländischen Ursprungs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26-050-088</td><td></td></tr><tr><td>IdU</td><td>Merck</td><td>I7125</td><td>I127</td></tr><tr><td>Iridium-Interkalator</td><td>Standard Biotools</td><td>201240</td><td>Ir191/193</td></tr><tr><td>Isofluran/Attan Vet</td><td>ScanVet</td><td>Vnr 055226</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/3900/17</td><td></td></tr><tr><td>Myf5 (Klon: C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-302</td><td>Yb173; Hauseigenes konjugiertes</td></tr><tr><td>MyoD (Klon: 5.8A)</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td>Dy164; Hauseigenes konjugiertes</td></tr><tr><td>MyoG (Klon: F5D)</td><td>BD Biosciences</td><td>556358</td><td>Gd160; Hauseigene konjugierte</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow Sterile Einwegflasche Top 0,20 &mu; M PES Filter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>595-4520</td><td></td></tr><tr><td>Notexin</td><td>Latoxan</td><td>L8104</td><td>Resuspend auf 50 & Mikro; g/ml in sterilem PBS. Halten Sie Lagerbestände (z.B. 50 &micro; l) bei -20°; C</td></tr><tr><td>Nährstoffmischung F-10 (Schinken)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31550031</td><td></td></tr><tr><td>pAkt (Klon: D9E)</td><td>Standard Biotools</td><td>3152005A</td><td>Sm152</td></tr><tr><td>Pax7 (Klon: PAX7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-81648</td><td>Eu153; Inhouse-konjugiertes</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (Pen/Streptomycin)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122 PES-Filtereinheiten</td><td></td></tr><tr><td>0,20 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>PES Spritzenfilter</td><td>Fisher</td><td>Scientific 15206869</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16% EM Grade</td><td>MP Biomedicals</td><td>219998320</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, einbasisch,&nbsp; wasserfrei (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>pRb (Klon: J112-906)</td><td>Standard Biotools</td><td>3166011A</td><td>Er166</td></tr><tr><td>pS6 Kinase (Klon: N7-548)</td><td>Standard Biotools</td><td>3172008A</td><td>Yb172</td></tr><tr><td>Sca-1 (Klon: E13-161.7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553333</td><td>Nd142; Inhouse-konjugiertes</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10553515</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat, zweibasisch, Heptahydrat (Na2HPO4-6H2O)</td><td>Merck</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Kochsalzlösung 0,9%</td><td>Fresenius</td><td>B306414/02</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 7 Integrin (Klon: 3C12)</td><td>MBL international</td><td>K0046-3</td><td>Ho165; Inhouse konjugiert</td></tr></tbody></table>

identifizierung und analyse myogener vorläuferzellen in vivo während akuter skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler einzelzell-massenzytometrie

Identification and Analysis of Myogenic Progenitors In Vivo During Acute Skeletal Muscle Injury by High-Dimensional Single-Cell Mass Cytometry

Hier präsentieren wir einen Überblick über den experimentellen Aufbau für die Verwendung dieses kombinierten Ansatzes, der Folgendes umfasst: (i) hochdimensionale CyTOF-Analyse eines akuten Verletzungszeitverlaufs durch Notexin-Injektion zur Untersuchung der zellulären und molekularen Dynamik von Stamm- und Vorläuferzellen im Skelettmuskel (Abbildung 1, oberes Schema); und (ii) FACS von Stamm- und Vorläuferzellen unter Verwendung von zwei Zelloberflächenmarkern, CD9 und CD104, um diese Popul...

Identifizierung und Analyse myogener Vorläuferzellen in vivo während akuter Skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler Einzelzell-Massenzytometrie

Skeletal muscle regeneration is a dynamic process driven by adult muscle stem cells and their progeny. Mostly quiescent at a steady state, adult muscle ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zur enzymatischen Dissoziation Oberfläche Kennzeichnung und Reinigung mittels Durchflusszytometrie von fibro / adipogene und myogenen Vorläuferzellen aus murinen Skelettmuskel.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll akuten Skelettmuskelregeneration in erwachsenen Mäusen und nachfolgende Manipulationen der Muskeln zu induzieren, wie Dissektion, Einfrieren, Schneiden, Routine-Färbung und myofiber Querschnittsfläche Analyse.

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Aktive Autophagie ist mit produktiven Muskelregeneration verbunden, die für die Muskelstammzell-Aktivierung (MuSC) essentiell ist. Hier stellen wir ein Protokoll für die in situ- Detektion von LC3, einen Autophagie-Marker in MyoD-positiven MuSCs von Muskelgewebeabschnitten von Kontroll- und verletzten Mäusen zur Verfügung.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Skelettartiger Muskel Differenzierung ist ein sehr dynamischer Prozess, der besonders auf nukleare Positionierung stützt. Hier beschreiben wir eine Methode um Kerne Bewegungen von live Cell Imaging während Myoblast Differenzierung und Myotube Bildung verfolgen und eine quantitative Charakterisierung der Kerne Dynamik durch Extrahieren von Informationen aus automatisches Tracking durchzuführen.

Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden.  hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Wir beschreiben eine In-vivo-Methode zur Untersuchung des funktionellen Verlustes eines bestimmten Gens in Satellitenzellen mithilfe einer Kombination aus kardiotoxinvermittelter Verletzung des Skelettmuskels und der Injektion einer selbstliefernden siRNA.

Analyse der Satellitenzellfunktion während der Skelettmuskelregeneration durch Kardiotoxinverletzung und Injektion von selbstliefernder siRNA In Vivo

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) aus dem Skelettmuskel der Ratte. Die Verwendung der Ratte in Muskelverletzungsmodellen bietet eine erhöhte Gewebeverfügbarkeit von atrophischen Muskeln für die Analyse und ein größeres Repertoire an validierten Methoden zur Beurteilung von Muskelkraft und Gang bei frei beweglichen Tieren.

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.

FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Erfahren Sie die Analyse myogener Vorläuferzellen bei akuter Skelettmuskelverletzung mittels Einzelzell-Massenzytometrie. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung molekularer Signaturen für regenerative Therapien.

Identifizierung und Analyse myogener Vorläuferzellen in vivo während akuter Skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler Einzelzell-Massenzytometrie (Video) | JoVE Journal

Identifizierung und Analyse myogener Vorläuferzellen in vivo während akuter Skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler Einzelzell-Massenzytometrie

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