Identifizierung und Analyse myogener Vorläuferzellen in vivo während akuter Skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler Einzelzell-Massenzytometrie
1. Dezember 2023
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und hochdimensionale Analyse von Muskelstamm- und Vorläuferzellen mittels Einzelzell-Massenzytometrie und deren Aufreinigung durch FACS für vertiefte Studien ihrer Funktion. Dieser Ansatz kann angewendet werden, um die Regenerationsdynamik in Krankheitsmodellen zu untersuchen und die Wirksamkeit pharmakologischer Interventionen zu testen.
Unsere Forschung untersucht die molekularen Mechanismen, die der Dysfunktion von Stammzellen bei Alterung und Krankheit zugrunde liegen. Unser Ziel ist es zu verstehen, wie Muskelstamm- und Vorläuferzellen mit anderen Zellen in der Muskelmikroumgebung interagieren, um eine effektive Regeneration zu erreichen. Wir untersuchen auch, ob eine unfruchtbare Zellkommunikation die Funktion von Muskelstammzellen im Alter und bei Krankheiten beeinflusst.
Ein großes Hindernis für die Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation innerhalb der Stammzellnische war der Mangel an Technologien, die eine Einzelzellauflösung bieten. Die Einzelzell-Massenzytometrie ermöglicht die gleichzeitige quantitative Hochdurchsatzanalyse an mehreren Zelltypen und molekularen Phänotypen in komplexen Geweben. Unser Protokoll ermöglicht die Aufreinigung und ein tiefes Profiling von seltenen Stammzellen und den Nachkommen während der Muskelregeneration unter Verwendung von Antikörpern gegen Zelloberflächenmarker und myogene Transkriptionsfaktoren.
Die Untersuchung dieser Zellen hilft uns zu verstehen, wie das Schicksal von Muskelstammzellen gesteuert wird, und die Netzwerke aufzudecken, die Zellzustandsübergänge antreiben und eine effektive Regeneration ermöglichen. Die gleichzeitige Messung von bis zu 50 Zelloberflächen- und intrazellulären Proteinen auf Einzelzellebene ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung der zellulären Funktion im Muskelgewebe. Diese Technik kann einzigartige molekulare Signaturen identifizieren und neue Mechanismen der Funktionsstörung von Muskelstammzellen bei Alterung und Krankheit aufdecken.
Dieses Protokoll ermöglicht es zu untersuchen, wie sich der Zellzustandsübergang auf die Geweberegeneration bei Gesundheit und Krankheit auswirkt. Die Signatur aktivierter Stammzellen, die wir hier vorstellen, ermöglicht es, die Ruhe von Stammzellen zu untersuchen. Früher waren sie nicht möglich.
Wir können nun aktivierte Stammzellen, CD98 High, CD44 High, ausschließlich auf der Grundlage von Zelloberflächenmarkern aufreinigen und zum ersten Mal untersuchen, wie sie wieder in den Ruhezustand zurückkehren.
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Übersicht
Diese Forschung untersucht die molekularen Mechanismen der Dysfunktion von Muskelstamm- und Vorläuferzellen im Alter und bei Krankheiten. Mithilfe der Einzelzell-Massenzytometrie und der FACS konzentriert sich die Studie darauf, wie diese Zellen innerhalb des muskulären Mikromilieus interagieren und welche Rolle sie bei den Regenerationsdynamiken spielen, und liefert dadurch Einblicke in mögliche therapeutische Ansätze.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Muskelbiologie
- Stammzellfunktion
- Regenerationsdynamik
Hintergrund
- Die Dysfunktion von Stammzellen beeinträchtigt die Geweberegeneration im Alter und bei Krankheiten.
- Eine effektive Zell-Zell-Kommunikation ist innerhalb der Stammzellnische entscheidend.
- Frühere Technologien verfügten nicht über eine Einzelzellauflösung für detaillierte Untersuchungen.
Verwendete Methoden
- Einzelzell-Massenzytometrie für die hochdimensionale Analyse.
- FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung) zur Zellreinigung.
- In-vivo-Mausmodelle für Regenerationsstudien.
Hauptergebnisse
- Identifizierung eindeutiger molekularer Signaturmuster in Muskelstammzellen.
- Erkenntnisse zum Ruhezustand und zur Reaktivierung von Stammzellen.
- Charakterisierung von Zellzustandsübergängen, die für eine effektive Regeneration entscheidend sind.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt den Nutzen fortschrittlicher Zytometrietechniken für das Verständnis der Biologie von Muskelstammzellen auf.
- Die Ergebnisse sind relevant für die Entwicklung therapeutischer Strategien gegen altersbedingte Muskeldegeneration.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die hochdimensionale Einzelzell-Massenzytometrie ermöglicht die präzise Identifizierung und Charakterisierung myogener Vorläuferzellen und Stammzellen während einer akuten Verletzung des Skelettmuskels und schließt damit eine entscheidende Wissenslücke im Verständnis regenerativer Dynamiken. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung und der mechanistischen Risikominimierung für Portfolios im Bereich Muskelerkrankungen und regenerative Medizin. Der Ansatz unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem er quantitative, reproduzierbare zelluläre Erkenntnisse liefert, die für die frühe Entdeckungsforschung und die translationale Forschung relevant sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Aufklärung zellulärer und molekularer Dynamiken während der Muskelregeneration.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Identifizierung aktivierter Stamm- und Vorläuferzellzustände mittels multiplexierter Marker.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung, indem Zellzustandsübergänge und Funktionsstörungssignaturen in Krankheitsmodellen aufgedeckt werden.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit für die Portfolioauswahl, indem seltene Zellpopulationen und ihr Aktivierungsstatus quantifiziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Analyse vor, indem definierte Stamm- und Vorläuferpopulationen mittels FACS isoliert werden.
- Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch quantitative, hochdimensionale Proteinmessungen mit Einzelzellauflösung.
- Unterstützt die Skalierbarkeit für die Bildschirmanalyse, indem gleichzeitige Analysen von bis zu 50 Markern pro Zelle ermöglicht werden.
- Liefert zuverlässige quantitative Ergebnisse für die Bewertung von Verbindungen in krankheitsrelevanten Systemen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Analyse der Dynamik von Stamm- und Vorläuferzellen in vivo nach Verletzung oder pharmakologischer Intervention und ist somit an krankheitsrelevanten Modellen ausgerichtet.
- Unterstützt die translationale Entdeckung von Biomarkern, indem molekulare Signaturprofile mit regenerativen Ergebnissen verknüpft werden.
- Erleichtert die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem funktionelle Untersuchungen isolierter Zellpopulationen ermöglicht werden.
- Reduziert das Risiko beim präklinischen Vorgehen, indem mechanistische Einblicke in die Dysfunktion von Stammzellen im Alter und bei Erkrankungen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode umfasst den gesamten Prozess von der frühen Entdeckung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Forschung und unterstützt die Hypothesenprüfung, die Aufklärung von Signalwegen sowie die biologische Risikominderung in Studien zur Muskelregeneration.
- Entdeckungsbiologie: Die quantitative Charakterisierung von Stamm- und Vorläuferzellen verdeutlicht regenerative Signalwege und Zellschicksalentscheidungen.
- Screening: Die hochdimensionale Markeranalyse gewährleistet die Einsatzbereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays für nachgeschaltete Anwendungen.
- Analytik: Multiplex-Proteinmessungen und Clusteralgorithmen ermöglichen einen robusten Vergleich zellulärer Zustände und Bedingungen.
- Translationale Forschung: Die Anwendung in vivo in Krankheitsmodellen unterstützt die Abstimmung von Biomarkern und die translationale Kontinuität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Plattform ist für vielfältige regenerative Studien und Krankheitsmodelle anpassbar und fördert eine breite Wiederverwendung in Forschung und Entwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Target-Validierung.
- Operativer Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare und skalierbare Einzelzell-Analysen seltener Zellpopulationen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management durch Quantifizierung regenerativer Zelldynamiken.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung regenerativer und krankheitsmodifizierender Programme.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Einzelzell-Cytometrie, FACS und der Analyse hochdimensionaler Daten.
- Setzt Zugang zu Massen-Cytometrie-Geräten und einer leistungsfähigen computergestützten Infrastruktur voraus.
- Erfordert die standardisierte Abstimmung von Antikörpanelen und Gating-Strategien über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Die Übertragung auf verschiedene Modelle von Muskelverletzungen oder -erkrankungen kann eine Optimierung der Markerpanele erfordern.
- Die Durchsatzleistung und Empfindlichkeit sind durch die Kapazität des Geräts und die Seltenheit bestimmter Zellpopulationen begrenzt.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:59
Induction of Acute Injury by Notexin Injection in the Mouse Skeletal Muscle
3:36
Dissection of the Mouse Skeletal Muscle After Notexin Injury and Cell Dissociation Procedure for Single‐Cell Analysis
5:17
Live/Dead Staining of Skeletal Muscle Cells,Isolated from Notexin‐Injured Mice,with Cisplatin and Paraformaldehyde Fixation
7:38
Skeletal Muscle Cells Preparation for Loading into Mass Cytometer and CyTOF Data Analysis
