Induktion der Langzeitplastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in Neuronen des dorsalen lateralen Genikulatkerns
20. September 2024
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der langfristigen Plastizität der neuronalen intrinsischen Erregbarkeit in Relaisneuronen aus dem dorsalen lateralen Genikulatkern, der in ex vivo Hirnschnitten erhalten bleibt.
Unsere Forschung konzentriert sich auf die Rolle von Ionenkanälen bei der funktionellen Plastizität von Hirnerkrankungen. Insbesondere untersuchen wir hier, ob Neuronen aus dem visuellen Thalamus die Plastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit durchlaufen können. Wir haben zum ersten Mal festgestellt, dass Neuronen aus dem Nucleus geniculatus lateralis die Plastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit nach monokularer Deprivation oder nach Stimulation regionaler Inputs exprimieren.
Wir bieten eine einfache Möglichkeit, eine lang anhaltende Plastizität der neuronalen Erregbarkeit in visuellen thalamischen Neuronen der Ratte in vitro zu induzieren. Zu diesem Zweck verwenden wir elektrophysikalische Patch-Clamp-Aufzeichnungen und pharmakologische Werkzeuge an ex vivo Hirngewebe. Unsere Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, die intrinsische Plastizität anderer subkortikaler visueller Kerne des Gehirns zu erforschen.
Bereiten Sie zunächst die Präparierwerkzeuge und zwei Eisplattformen vor. Geben Sie Eis in den äußeren Tank und füllen Sie die Schneidkammer des Vibratoms mit einer eiskalten Schneidlösung. Legen Sie den Kopf der euthanasierten Ratte auf die erste vereiste Plattform und schneiden Sie mit einer kleinen Schere die Kopfhaut in kaudaler Richtung, gefolgt vom Schädel beidseitig.
Öffnen Sie mit einer stumpfen Pinzette und einem Spatel den Schädel, ziehen Sie das Gehirn schnell aus dem Schädel heraus und legen Sie es auf die zweite Eisplattform. Machen Sie einen Schnitt in der Frontalebene, um die vordere Rinde und die Riechkolben zu entfernen, gefolgt von einem zweiten Schnitt auf Höhe des Colliculus inferior, um die hintere Rinde und das Kleinhirn zu entfernen. Befestigen Sie den Gehirnblock mit der rostralen Seite nach oben auf der Platte des Vibratoms.
Gießen Sie das Gehirn während des Eingriffs regelmäßig, bis es vollständig in die Schneidekammer eingetaucht ist. Schneiden Sie mit dem Vibratom 350 Mikrometer große Scheiben, die den dorsalen lateralen Genikulatkern enthalten. Entfernen Sie dann mit einem Bleistift vorsichtig den Kortex und den Hippocampus aus dem Mittelhirn.
Entnehmen Sie zunächst die Rattenhirnschnitte, die den dorsalen lateralen Genikulatkern (dLGN) enthält, und montieren Sie sie an einem aufrechten Mikroskop in eine untergetauchte Kammer. Lege den U-förmigen Platindraht auf die Scheibe. Identifizieren Sie mit der differentiellen Interferenzkontrast-Infrarot-Videomikroskopie ein gesundes Neuron im dLGN für die Patch-Clamp-Aufnahme.
Positionieren Sie die Patch-Pipette mit dem Mikromanipulator mit konstantem Überdruck auf dem ausgewählten Neuron. Stellen Sie den Verstärker auf VC-Modus und fügen Sie eine Spannungsstufe von 10 Millivolt ein. Stellen Sie die Spannung auf minus 65 Millivolt ein.
Stellen Sie als Nächstes den Verstärker auf CC-Modus, balancieren Sie die Brücke aus, um den Zugangswiderstand zu kompensieren, und halten Sie das Neuron bei minus 65 Millivolt. Für die Datenerfassung wird eine Kontrollperiode von etwa 10 Minuten mit einem positiven Stromimpuls bei einer Frequenz von 0,1 Hertz eingestellt und die neuronale Erregbarkeit überwacht. Beobachten Sie dann den Eingangswiderstand des Neurons durchgehend mit einem kurzen negativen Stromimpuls.
Nach der Kontrollperiode werden Züge von 15 Spikes ausgelöst, die durch 15 kurze Schritte von zwei bis fünf Millisekunden Depolarisationsstrom hervorgerufen werden, die 10 Minuten lang mit 40 Hertz abgegeben werden. Wählen Sie die Amplitude des Stromimpulses, um jedes Mal ein einzelnes Aktionspotential auszulösen. Testen Sie schließlich die neuronale Erregbarkeit nach dem Induktionsprotokoll.
Die dLGN-Neuronen wurden in Ganzzellkonfiguration aufgezeichnet, und LTP-IE wurde durch Aktionspotentialfeuer bei 40 Hertz für 10 Minuten in Gegenwart von ionotropem Glutamat und GABA-Rezeptorantagonisten induziert. Eine Verdreifachung der Anzahl der Aktionspotentiale wurde 20 bis 30 Minuten nach der Induktion von LTP-IE beobachtet, ohne dass sich der Eingangswiderstand änderte.
Übersicht
Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Induktion langanhaltender Plastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in Relaisneuronen aus dem dorsolateralen Kniekern (dLGN) unter Verwendung von ex vivo Gehirnschnitten. Die zentrale Fragestellung untersucht, ob dLGN-Neuronen Veränderungen in ihrer intrinsischen Erregbarkeit nach Stimulation oder Deprivation zeigen können. Die Ergebnisse deuten auf eine signifikante Steigerung der neuronalen Erregbarkeit nach der Induktion hin.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Neuronale Plastizität
Hintergrund
- Das Verständnis der intrinsischen Plastizität ist entscheidend, um Einblicke in die Gehirnfunktion und neurologische Erkrankungen zu gewinnen.
- Schaltneurone im visuellen Thalamus könnten eine Rolle bei der sensorischen Verarbeitung und Plastizität spielen.
- Frühere Studien haben gezeigt, dass die neuronale Erregbarkeit durch Umweltfaktoren verändert werden kann.
- Der dLGN ist für die Weiterleitung visueller Informationen von zentraler Bedeutung und daher ein geeigneter Ansatzpunkt, um Plastizität zu untersuchen.
Zweck der Studie
- Um die Plastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in visuellen thalamischen Neuronen zu untersuchen.
- Um eine zuverlässige Methode zur Induktion und Messung dieser Plastizität zu etablieren.
- Um weitere Untersuchungen an verwandten subkortikalen visuellen Kernen zu ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von ex vivo-Hirnschnitten der Ratte, gezielt aus dem dLGN.
- Durchführung der Patch-Clamp-Elektrophysiologie zur Beurteilung neuronaler Eigenschaften.
- Die Induktion langanhaltender Plastizität erfolgte mittels hochfrequenter Aktionspotentiale.
- Zu den kritischen Schritten gehörten die Gewebepräparation und elektrophysiologische Ableitungen unter kontrollierten Bedingungen.
Hauptergebnisse
- Zeigte eine dreifache Zunahme der Aktionspotentiale nach dem Induktionsprotokoll.
- Es wurde keine Veränderung des Eingangswiderstands beobachtet, was auf eine spezifische Änderung der Erregbarkeit hinweist.
- Die Ergebnisse stützen die Hypothese, dass dLGN-Neuronen zu intrinsischer Plastizität fähig sind.
- Elektrophysiologische Modifikationen deuten auf mögliche Wege für weitere Untersuchungen hin.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie validiert eine Methode zur Induktion und Messung von Veränderungen der intrinsischen Erregbarkeit in dLGN-Neuronen.
- Die Ergebnisse liefern bedeutende Einblicke in neuronale Mechanismen der Plastizität mit Implikationen für das Verständnis der visuellen Verarbeitung und potenzielle therapeutische Ansatzpunkte.
- Zukünftige Forschung könnte diese Methoden auf andere subkortikale Regionen ausdehnen, um Plastizität zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Plastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit im dorsolateralen Geniculum (dLGN) stellt einen entscheidenden Wendepunkt für das Verständnis der sensorischen Verarbeitung und adaptiver neuronaler Schaltkreise dar. Eine zuverlässige Induktion und Quantifizierung der Langzeit-Potenzierung der intrinsischen Erregbarkeit (LTP-IE) in dLGN-Relaisneuronen ermöglicht die mechanistische Entlastung von Risiken und die Validierung von Zielstrukturen für die frühe Phase der ZNS-Wirkstoffforschung. Diese Fähigkeit stärkt das Vorhersagevertrauen in translative Neurowissenschafts-Portfolios, die auf die Modulation visueller und thalamischer Signalwege abzielen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Ionenkanalfunktion und Plastizitätsmechanismen in thalamischen Relaisneuronen.
- Unterstützt die biologische Ent风险bewertung, indem intrinsische Erregbarkeitsänderungen unabhängig von synaptischen Eingängen isoliert werden.
- Erleichtert die funktionelle Target-Validierung für ZNS-Wege, die an sensorischer Anpassung und Plastizität beteiligt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes ex-vivo-System zur Quantifizierung von Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit mittels Patch-Clamp-Elektrophysiologie.
- Etabliert reproduzierbare Induktionsprotokolle für die LTP-IE und unterstützt die Standardisierung von Assays sowie den Vergleich zwischen verschiedenen Laboren.
- Ermöglicht die quantitative Messung der Aktionspotentialausschüttung als Endpunkt für die Untersuchung von Modulatoren der intrinsischen Plastizität.
Translationale und präklinische Forschung
- Ergänzt krankheitsrelevante Modelle der sensorischen Verarbeitung und thalamischer Dysfunktion.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der mechanistischen Entdeckung zur präklinischen Validierung von ZNS-Zielen, die die neuronale Erregbarkeit beeinflussen.
- Bietet eine Plattform zur Bewertung translationaler Biomarker der intrinsischen Plastizität in visuellen Bahnen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll verortet Studien zur plastischen intrinsischen Erregbarkeit im Schnittpunkt zwischen früher Entdeckungsforschung und präklinischer CNS-Forschung und verbindet die mechanistische Zielvalidierung mit der Entwicklung translationsorientierter Modelle.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung von Ionenkanal- und neuronalen Plastizitätsmechanismen in thalamischen Relaiszellen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Erregbarkeitsmesswerte, die für die Bewertung von Substanzen geeignet sind.
- Analytik: Stellt Aktionspotenzialfrequenz und Eingangswiderstand als robuste, vergleichbare Parameter für die Beurteilung von Bedingungen bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet Befunde zur intrinsischen Plastizität mit krankheitsrelevanten sensorischen und thalamischen Modellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare ex-vivo-Assay-Plattform zur Untersuchung zentralnervöser Zielstrukturen und Signalwege.
Operative und unternehmensweite Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Validierung zentralnervöser Zielstrukturen und der mechanistischen Entschärfung von Risiken.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Induktion und Messung der plastischen neuronalen Erregbarkeit für skalierbare Forschungs- und Entwicklungsabläufe.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von ZNS-Programmen, die auf thalamische und sensorische Signalwege abzielen.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Entdeckungs- und präklinischen ZNS-Aktiva.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Patch-Clamp-Elektrophysiologie und der ex vivo-Hirnschnittpräparation.
- Setzt Zugang zu fortschrittlicher Mikroskopie und elektrophysiologischer Aufzeichnungstechnik voraus.
- Erfordert eine strikte, übergreifende Standardisierung der Induktionsprotokolle und der Datenanalyse zwischen den Forschungsteams.
- Die Anpassung an andere Hirnregionen oder Arten kann eine Optimierung der Protokolle erfordern.
- Die Interpretation ist auf ex vivo-Bedingungen beschränkt und erfasst möglicherweise nicht die volle Komplexität in vivo.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:09
Obtaining Acute Slices of Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus for Intrinsic Plasticity Studies
2:34
Whole-Cell Patch-Clamp Electrophysiology for Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability Induction in Rat Dorsal Lateral Geniculate Nucleus
4:25
Representative Results
