Name: Induktion der Langzeitplastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in Neuronen des dorsalen lateralen Genikulatkerns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie man Langzeitplastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in Neuronen des dorsalen lateralen Genikulatkerns induziert. Diese Patch-Clamp-Methode an Rattenhirnschnitten ermöglicht die Untersuchung visueller Thalamusplastizität.

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Unterstützt von INSERM, CNRS (bis DD), AMU (bis MR), FRM (DVS20131228768 bis DD und DEQ20180839583 bis DD), NeuroSchool ("France 2030" Programm über A*Midex (Initiative d'Excellence d'Aix-Marseille Université, AMX-19-IET-004) und ANR-Finanzierung (ANR-17-EURE-0029 bis AW) und ANR (LoGiK, ANR-17-CE16-0022 bis DD, Plastinex, ANR-21-CE16-013 bis DD). Wir danken A Venture & K Milton für die hervorragende Tierpflege.

Alle Versuche wurden gemäß den europäischen und institutionellen Richtlinien durchgeführt (Richtlinie 86/609/EWG des Rates und französischer Nationaler Forschungsrat und genehmigt von der lokalen Gesundheitsbehörde (Veterinärdienste, Präfektur des Bouches-du-Rhône, Marseille)).
1. Tiere
<ol>
	<li>Führen Sie Experimente mit 19-25 Tage alten Long Evans-Ratten beiderlei Geschlechts (mit einem Gewicht zwischen 50 und 90 g) durch.</li>
	<li>Bringen Sie die Tiere in herkömmlichen Plastikkäfigen unter, zusammen mit ihrer Mutter und ihrem Wurfgeschwister. Halten Sie die Temperatur konstant mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und ad libitum Zugang zu Wasser und Lebensmitteln.</li>
</ol>
2. Akute Scheiben von Ratten-dLGN
<ol>
	<li>Bereiten Sie Lösungen für die Schneid-/Wiederherstellung und extrazelluläre Aufzeichnung vor.
	<ol>
		<li>Zur Herstellung der Schneid-/Rückgewinnungslösung 92 mM n-Methyl-D-glutamin, 30 mM NaHCO3, 25 mM D-Glucose, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, 0,5 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 20 mM Hepes, 5 mM Natriumascorbat und 3 mM Natriumpyruvat mischen und mit 95 % O2-5 % CO2 (pH 7,4) blasen. Halten Sie die Schneidlösung während des Schneidevorgangs kalt.</li>
		<li>Bereiten Sie die Aufzeichnungslösung (künstliche Zerebrospinalflüssigkeit, ACSF) vor, indem Sie 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 2,5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,8 mM NaH2PO4 und 10 mM D-Glukose mischen und dauerhaft mit 95 % O2-5 % CO2 ausgleichen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereiten Sie die Präparierwerkzeuge und zwei Eisplattformen vor (Abbildung 1A).</li>
	<li>Geben Sie Eis in den äußeren Tank und füllen Sie die Schneidkammer des Vibratoms mit einer eiskalten Schneidlösung (Abbildung 1B).</li>
	<li>Junge Long-Evans-Ratte (Alter: P19-P25) mit Isofluran (5%) tief anästhesieren. Nachdem Sie bestätigt haben, dass das Tier tief betäubt ist (indem Sie den Fuß fest einklemmen, ohne zu reagieren), euthanasieren Sie das Tier durch Enthauptung entweder mit einer Schere oder einer Guillotine (je nach Alter/Größe des Tieres) auf Höhe des Marks ein. Legen Sie den Kopf auf die erste vereiste Plattform und gießen Sie das isolierte Gewebe alle 10 s mit der sauerstoffhaltigen, eiskalten Schnittlösung. 
	HINWEIS: Anästhesie- und Euthanasieverfahren müssen in einem separaten Raum der Tiereinrichtung durchgeführt werden.</li>
	<li>Schneiden Sie die Kopfhaut in kaudaler Richtung und schneiden Sie den Schädel mit einer kleinen Schere beidseitig ein. Öffnen Sie mit einer stumpfen Pinzette den Schädel und ziehen Sie das Gehirn mit einem Spatel schnell aus dem Schädel heraus und legen Sie es auf die zweite Eisplattform. 
	HINWEIS: Die Zeit von der Enthauptung bis zur Extraktion des Gehirns sollte 2 Minuten nicht überschreiten.</li>
	<li>Machen Sie 2 Schnitte in der Frontalebene des Gehirns über das gesamte Gehirn; den ersten, um den vorderen Teil der Rinde und die Riechkolben zu entfernen (siehe Abbildung 1C) und den zweiten auf Höhe des Colliculus inferior, um den hinteren Teil der Rinde und des Kleinhirns zu entfernen.</li>
	<li>Kleben Sie den Hirnblock mit der rostralen Seite nach oben auf die Platte des Vibratoms (siehe Abbildung 1D,E). Gießen Sie das Gehirn während des gesamten Eingriffs regelmäßig (alle 10 s), bis es in die Schnittkammer des Vibratoms eingetaucht ist.</li>
	<li>Machen Sie 350 μm dünne Scheiben, die das dLGN enthalten, mit dem Vibratom (Abbildung 1G). Entfernen Sie die Großhirnrinde und den Hippocampus mit einem Bleistift aus dem Mittelhirn, indem Sie sanft an diesen Strukturen ziehen.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Scheiben mit einer gebrochenen Pasteur-Pipette, die mit einem flexiblen Gummisauger verbunden ist (Abbildung 1H).</li>
	<li>Lassen Sie die Scheiben 20-30 Minuten lang in der Wiederherstellungslösung (Abbildung 1I) erholen.</li>
</ol>
3. Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie
HINWEIS: Für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von dLGN-Relaisneuronen verwenden Sie einen speziellen Patch-Clamp-Verstärker.
<ol>
	<li>Schalten Sie die Pumpen des Rigs ein, um die extrazelluläre Aufnahmesalzlösung (siehe Zusammensetzung in Schritt 2.1) in der Aufnahmekammer zirkulieren zu lassen.</li>
	<li>Bereiten Sie die intrazelluläre Lösung vor, indem Sie 120 mM K-Gluconat, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,5 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 2 mM Na2ATP und 0,3 mM NaGTP (pH 7,4) mischen. 
	HINWEIS: Intrazelluläre Lösung kann im Voraus zubereitet und bei -80 °C eingefroren werden. Im ungefrorenen Zustand wird die Lösung bei 4 °C gehalten.</li>
	<li>Geben Sie denGABA-A-Kanalblocker, Picrotoxin (100 μM Endkonzentration) und den ionotropen Glutamatrezeptor-Antagonisten Kynurenat (2 mM, Endkonzentration) zur extrazellulären Kochsalzlösung.</li>
	<li>Bringen Sie die Scheibe in eine getauchte Kammer, die an einem aufrechten Mikroskop montiert ist. Die Kammer wird bei 30 °C temperiert und kontinuierlich mit äquilibriertem aCSF perfundiert.</li>
	<li>Platzieren Sie den U-förmigen Platindraht auf der Scheibe und positionieren Sie die Scheibe so, dass die dLGN sichtbar wird (Abbildung 2A).</li>
	<li>Bereiten Sie Patch-Pipetten aus Borosilikatglasröhrchen vor, die mit einem Abzieher gezogen werden. Stellen Sie sicher, dass die Patch-Pipetten einen Widerstand von 5-10 MΩ haben, wenn sie mit der intrazellulären Lösung gefüllt sind.</li>
	<li>Visualisieren Sie das dLGN bei hoher Vergrößerung (40x oder 60x) und wählen Sie ein Neuron für die Patch-Clamp-Aufzeichnung mit Hilfe der differentiellen Interferenzkontrast-Infrarot-Videomikroskopie (Abbildung 2B). Wählen Sie die Neuronen nach ihrem gesunden Aussehen aus (d. h. leicht geschwollen mit scharfen Membrankonturen).</li>
	<li>Positionieren Sie die Patch-Pipette mit dem Mikromanipulator mit konstantem Überdruck auf dem ausgewählten Neuron.
	<ol>
		<li>Stellen Sie den Verstärker auf VC-Modus und injizieren Sie eine Spannungsstufe von 5 mV. Stellen Sie die Spannung auf -65 mV ein. Lassen Sie dann den Überdruck ab, um eine Dichtung mit hohem Widerstand zu erhalten (entsprechend der Reduzierung des Stroms als Reaktion auf die Spannungsstufen). Aspirieren Sie leicht durch die Pipette, um klare Transienten zu erhalten.</li>
		<li>Stellen Sie den Verstärker auf CC-Modus, balancieren Sie die Brücke aus, um den Zugangswiderstand zu kompensieren, und halten Sie das Neuron auf -65 mV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Datenerfassung
<ol>
	<li>Erfassen Sie Signale bei 20 KHz, um die schnellen Aktionspotentiale besser zu erkennen. Stellen Sie den Tiefpassfilter für Spannungs- und Stromsignale auf 10 kHz ein.</li>
	<li>Überwachen Sie die neuronale Erregbarkeit während einer Kontrollperiode von etwa 10 Minuten, indem Sie einen positiven Stromimpuls (typischerweise ~80-250 pA während 500 ms) injizieren, der ausreicht, um 3-5 Aktionspotentiale unter Kontrollbedingungen bei einer Frequenz von 0,1 Hz hervorzurufen.</li>
	<li>Überwachen Sie den Eingangswiderstand des Neurons während des gesamten Experiments mit einem kurzen negativen Stromimpuls (typischerweise -20 pA während 100 ms). Halten Sie die Amplitude des Stromimpulses vor und nach der Induktion von LTP-IE konstant.</li>
</ol>
5. Induktion von LTP-IE
<ol>
	<li>Nach der Kontrollperiode wird LTP-IE induziert, indem Züge von 15 Spikes ausgelöst werden, die durch 15 kurze Schritte (2-5 ms) Depolarisationsstrom hervorgerufen werden, der 10 Minuten lang bei 40 Hz abgegeben wird.</li>
	<li>Wählen Sie die Amplitude des Stromimpulses, um jedes Mal ein einzelnes Aktionspotential auszulösen (d. h. 15 Aktionspotentiale pro Zug). 
	HINWEIS: Jeder Zug mit 15 Spikes wird mit einer Frequenz von 0,1 Hz ausgelöst (d. h. 60 Züge und 900 Spikes).</li>
</ol>
6. Datenanalyse
HINWEIS: Das Analyseverfahren ist vor (Kontrollbedingungen) und nach der LTP-IE-Induktion gleich.
<ol>
	<li>Berechnen Sie für jede aufgezeichnete Kurve den Eingangswiderstand (Rin) aus dem Spannungsgang bis zu dem kleinen negativen Stromimpuls, der vor dem Prüfschritt des Stroms (Rin =V-Schritt/I-Schritt) eingespeist wird. Wenn es während des Kontrollzeitraums zu einem Hoch- oder Untergang des Eingangswiderstands (mehr als 10 %) kommt, ist der Versuch zu verwerfen.</li>
	<li>Wählen Sie aufgezeichnete Kurven basierend auf dem Membranpotential vor jeder aktuellen Injektion aus. Behalten Sie nur die Spuren mit einem Ruhemembranpotential von -67 bis -63 mV.</li>
	<li>Quantifizieren Sie LTP-IE über einen Zeitraum von 10 Minuten, 20 Minuten nach Beginn der Nachinduktionsphase, indem Sie die Anzahl der AP messen, die durch jeden Stromimpuls hervorgerufen werden, und indem Sie jede Minute mit einer hausgemachten Routine in einer Datenanalysesoftware mitteln. Erkennen von Spitzen, wenn das Spannungssignal 0 mV überschreitet. 
	HINWEIS: LTP-IE wird ausgedrückt als die Anzahl der Aktionspotentiale, die durch die Stromimpulsinjektion nach dem Induktionsprotokoll im Vergleich zu vorher (%) ausgelöst werden. Die Analyse wurde bei -10-0 min für den Ausgangswert und +20/+30 min für den Test durchgeführt.</li>
</ol>

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<li>Chrobok, L., Palus-Chramiec, K., Chrzanowska, A., Kepczynski, M., Lewandowski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+excitatory+actions+of+orexins+upon+thalamo-cortical+neurons+in+dorsal+lateral+geniculate+nucleus+-+implications+for+vision+modulation+by+arousal%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiple excitatory actions of orexins upon thalamo-cortical neurons in dorsal lateral geniculate nucleus - implications for vision modulation by arousal.</a> Sci Rep. 7 (1), 7713(2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Wir berichten hier über die Induktion von LTP-IE in dLGN-Neuronen, die in akuten Hirnschnitten durch Stimulation des aufgezeichneten Neurons am Leben erhalten wurden, um Aktionspotentiale bei einer Frequenz von 40 Hz für 10 min hervorzurufen. Dieses Protokoll ist in jedem neurophysiologischen Labor einfach zu implementieren, da es eine minimale Anzahl von Geräten erfordert (Slicer, Mikroskop, 1 Verstärker, 1 Erfassungsplatine und Computer). Es müssen jedoch einige kritische Schritte beachtet werden, um wertvolle Daten zu sammeln. Der erste kritische Schritt innerhalb des Protokolls ist die Qualität des Hirngewebes. Ein gesunder Thalamusschnitt enthält viele Neuronen von der Oberfläche bis zur Mitte des Schnitts (~150 μm). Gesunde Neuronen erscheinen leicht geschwollen, während absterbende Neuronen normalerweise geschrumpft sind. Der zweite kritische Schritt ist die Stabilität der Aufzeichnung während der Baseline. Die Anzahl der Aktionspotentiale sollte stabil sein, ohne dass es zu einem Auf- oder Abbau kommt. Darüber hinaus sollte der Eingangswiderstand, der mit einem kurzen Impuls eines Hyperpolarisationsstroms getestet wird, keine Änderung von mehr als 10 % aufweisen. Schließlich muss der Haltestrom innerhalb von +/- 10 pA stabil sein. Ein solches Induktionsprotokoll wurde erstmals zur Induktion von LTP-IE in visuellen kortikalen Neuronen verwendet19,20. Wir zeigen hier, dass dieses Protokoll auch eine intrinsische Potenzierung in thalamischen Relaisneuronen des visuellen Systems induzieren kann26. Die Induktion von Spikes mit Gleichstrominjektion soll die retinale Eingangsstimulation nachahmen, die normalerweise dLGN-Neuronen antreibt, da die Stimulation einer einzelnen Netzhautfaser normalerweise ein exzitatorisches postsynaptisches Potential (EPSP) hervorruft, das in der Lage ist, ein Aktionspotential im dLGN-Neuron27,28 auszulösen. Die Expressionsmechanismen von LTP-IE in dLGN-Neuronen wurden in der Originalpublikation26 untersucht und zeigten, dass Kv1-Kanäle nach Induktion von LTP-IE herunterreguliert werden. Somit ist die Herunterregulierung der Kv1-Kanäle sowohl für LTP-IE in den schnell spikenden kortikalen Interneuronen16 und dLGN-Neuronen26 als auch für die homöostatische Plastizität in der CA3-Regionverantwortlich 29,30. Der Signalweg unterscheidet sich jedoch, da die Proteinkinase A (PKA) an dLGN-Neuronen beteiligt ist, während eine wichtige Rolle für mTOR in Fast-Spiking-Interneuronen vermutet wird.
Das vorliegende Protokoll liefert reproduzierbare Ergebnisse unter den hier verwendeten Versuchsbedingungen: 3 mM Ca2+, 2 mM Mg2+, Picrotoxin und Kynurenat, 10 min Stimulation bei 40 Hz bei Ratten im Alter von 19-25 Tagen26. Tatsächlich ermöglicht dieses Protokoll im Durchschnitt eine 2-fache Steigerung der Erregbarkeit. Das Ausmaß der erhöhten Erregbarkeit nimmt mit der Dauer der Stimulation, der Häufigkeit der Stimulation oder dem Alter des Tieresab 26. Vor der Augenöffnung kann kein LTP-IE beobachtet werden. Die Frequenz, die verwendet wird, um eine lang anhaltende Plastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit zu induzieren, entspricht dem Gammaband der Gehirnschwingungen, von dem bekannt ist, dass es die Bindungsfrequenz für die Sinneswahrnehmung31 ist und die Plastizität im visuellen Systemfördert 32.
Wenn jedoch eine niedrigere Kalziumkonzentration verwendet wurde (d. h. 1,5 mM Ca2+), muss das Protokoll wahrscheinlich überarbeitet werden, da es zuvor für die synaptische Plastizität gezeigt wurde33. In diesem Fall muss die Frequenz der Stimulation wahrscheinlich auf 60-80 Hz erhöht werden. Es wird angenommen, dass die Inzidenz von GABA-Rezeptorblockern (Picrotoxin von Gabazin), die in dem vorliegenden Protokoll zur Induktion von LTP-IE verwendet werden, begrenzt ist, da Spikes durch Gleichstrominjektion hervorgerufen werden. Nichtsdestotrotz würde in der in vivo-Situation , in der Aktionspotentiale in dLGN-Neuronen durch retinale Stimulation hervorgerufen werden, der rekrutierte GABAerge Input34 wahrscheinlich die Spike-Schwelle erhöhen. Daher wären wahrscheinlich stärkere retinale Eingaben notwendig, um LTP-IE in dLGN-Neuronen auszulösen. Neuromodulatorsysteme, die während der Erregung aktiv sind, wie z. B. Orexin, können jedoch die Schwelle senken35.
Die Induktion einer lang anhaltenden intrinsischen Plastizität in dLGN-Relaisneuronen kann entweder durch visuelle Deprivation, Stimulation von retinalen Eingaben zur Evokation von Aktionspotentialen oder direkt durch Auslösen von Aktionspotentialen durch Strominjektion in die aufgezeichneten Neuronenerreicht werden 26. Dieses letzte Protokoll ist bei weitem das einfachste Verfahren, weil es schnell zu implementieren ist und gleichwertige Ergebnisse wie das synaptische Simulationsverfahren26 liefert.
Es wurde gezeigt, dass dieses Protokoll LTP-IE sowohl in den visuellen kortikalen Pyramidenneuronen19 als auch in den thalamischen Relaisneuronen26 induziert. Es könnte wahrscheinlich auch zur Induktion einer lang anhaltenden Plastizität der neuronalen Erregbarkeit in anderen subkortikalen visuellen Kernen, einschließlich des ventralen LGN (vLGN) oder des Colliculus superior (SC), verwendet werden.

Das übergeordnete Ziel dieser Methodenarbeit ist es, eine einfache Möglichkeit zu bieten, eine lang anhaltende Plastizität der neuronalen Erregbarkeit in visuellen thalamischen Neuronen der Ratte in vitro zu induzieren, indem der Standard-Stromklemmenmodus der Patch-Clamp-Technik verwendet wird1,2. Der Grund für die Entwicklung dieser Technik ist ihre Einfachheit und Reproduzierbarkeit. Der Vorteil gegenüber alternativen Techniken, wie z.B. der Stimulation von synaptischen Inputs, gepaart oder nicht mit postsynaptischen Aktionspotentialen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt abgegeben werden, ist ihre Zuverlässigkeit.
Plastizität im visuellen System wird traditionell ausschließlich auf kortikaler Ebene exprimiert, während der dorsale laterale Genikulatkern (dLGN), eine primäre Empfängerstruktur von retinalen Eingaben auf thalamischer Ebene, traditionell nur als Relais visueller Informationen angesehen wird3. Diese anfängliche Schlussfolgerung wurde jedoch durch neuere Arbeiten in Frage gestellt, die darauf hinweisen, dass diese vereinfachende Sichtweise nicht gilt4,5,6. So werden funktionelle Defizite in der visuellen Reaktion bereits bei amblyopen Patienten im Stadium der LGN7 beobachtet. Darüber hinaus erhält ein großer Teil der dLGN-Relaisneuronen in einem gegebenen monokularen Gebiet Eingaben von jedem Auge, was auf eine potenzielle Binokularität für einen großen Teil der dLGN-Neuronen hinweist8,9,10. Darüber hinaus führt monokulare Deprivation zu einer signifikanten Verschiebung der okulären Dominanz in dLGN-Neuronen5,11,12.
Unter den Mechanismen der funktionellen Plastizität, die bei der Verschiebung der okulären Dominanz auftreten können, ist die Plastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit ein potenzieller Kandidat. In der Tat exprimieren viele Gehirnregionen, einschließlich visueller Areale, intrinsische Plastizität, die verschiedenen Verhaltensaufgaben folgt13,14. Langfristige intrinsische Plastizität wurde in zentralen Neuronen nach Stimulation afferenter Glutamat-Inputs berichtet15,16,17,18, Spiking Activity19,20, sensorische Stimulation21 oder nach Aktivität oder sensorischer Deprivation20,22,23. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Induktion der Langzeitpotenzierung der intrinsischen Erregbarkeit (LTP-IE) in dLGN-Relaisneuronen nach Spike-Aktivität bei einer Frequenz von 40 Hz ermöglicht. Die Feuerfrequenz von 40 Hz entspricht einer Frequenz, die bei den meisten dLGN-Neuronen in vivo bei visueller Stimulation beobachtet wird24,25.

<table><tbody><tr><td>Automatisiertes Vibrationsklingen-Mikrotom</td><td>Leica</td><td>VT-1200S</td><td>Vibratom/Slicer</td></tr><tr><td>Borosilikatglasröhre</td><td>Phymep</td><td>B-15086-10</td><td></td></tr><tr><td>Controller Typ V</td><td>Luigs& Neumann</td><td>Typ V</td><td>Temperaturregler</td></tr><tr><td>Igor-Software</td><td>Wavemetrics-Analysesoftware</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarot-Videomikroskopie</td><td>Olympus</td><td>XM-10 Kamera</td><td></td></tr><tr><td>Kynurenate</td><td>Merk/Sigma</td><td>K3375</td><td>AMPA/NMDA-Rezeptorblocker</td></tr><tr><td>Rauscharmes Datenerfassungssystem</td><td>Axon - Molekulare Bauelemente</td><td>Digidata 1440A</td><td>Analog/Digital-Schnittstelle</td></tr><tr><td>Mikromanipulatoren</td><td>Luigs& Neumann</td><td>LN Mini25</td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 200B</td><td>Axon - Molekulare Geräte</td><td>N/A</td><td>Patch-Clamp-Verstärker</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Axon - Molekulare Geräte</td><td>N/A</td><td>Patch-Clamp-Verstärker</td></tr><tr><td>PC-100 Abzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>Mikropipetten-Abzieher</td></tr><tr><td>PClamp10</td><td>Axon - Molekulare Geräte</td><td>N/A</td><td>Patch-Clamp-Aufnahmesoftware</td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>AbCam</td><td>ab120315</td><td>GABAA-Rezeptorblocker</td></tr><tr><td>Slice Mini-Kammer&nbsp;</td><td>Luigs& Neumann</td><td>LN Chambre Slice mini I-II</td><td>Untergetauchtes</td></tr><tr><td>Kammermikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51 WI</td><td></td></tr></tbody></table>

induktion der langzeitplastizität der intrinsischen neuronalen erregbarkeit in neuronen des dorsalen lateralen genikulatkerns

Inducing Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability in Neurons of the Dorsal Lateral Geniculate Nucleus

Der dorsale laterale Genikulatkern (dLGN) wurde lange Zeit als grundlegendes Relais für visuelle Informationen angesehen, die von der Netzhaut zu den kortikalen Bereichen gelangen, aber neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die funktionelle Plastizität von dLGN-Hauptzellen weitgehend unterschätzt wird. Die zellulären Mechanismen, die diese Veränderungen unterstützen, sind jedoch noch nicht vollständig erforscht. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Induktion der Langzeitpotenzierung der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit (LTP-IE) in dorsalen dLGN-Relaiszellen aus akuten Hirnschnitten junger Ratten. Die intrinsische Plastizität wird im Allgemeinen parallel zur synaptischen Plastizität induziert. In dLGN-Neuronen wird LTP-IE jedoch zuverlässig durch Spike-Aktivität bei einer Frequenz von 40 Hz für 10 Minuten induziert. LTP-IE in dLGN-Relaisneuronen ist langanhaltend, da es bis zu 40 Minuten nach dem Induktionsprotokoll verfolgt werden kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Studie den ersten Beweis für die Induktion von intrinsischer Plastizität in dLGN-Relaiszellen liefern, was auf die Rolle von thalamischen Neuronen bei der aktivitätsabhängigen visuellen Plastizität hinweist.

dLGN-Neuronen wurden im Ganzzell-Konfiguration aufgezeichnet, und die LTP-IE wurde durch Aktionspotentiale mit einer Frequenz von 40 Hz über 10 min in Gegenwart von ionotropen Glutamat- und GABA-Rezeptorantagonisten induziert (Abbildung 3A). Eine dreifache Zunahme der Anzahl an Aktionspotentialen wurde 20–30 min nach der Induktion beobachtet (Abbildung 3B), ohne dass sich der Eingangswiderstand, Rin, veränderte (Abbildung 3C). Dieses Protokoll induzierte zuverlässig LTP-IE in dLGN-Neuronen (Abbildung 3D)26. Diese Ergebnisse zeigen, wie effizient das hier beschriebene Protokoll zur Induktion einer langanhaltenden Plastizität der neuronalen Erregbarkeit in dLGN-Neuronen in vitro ist.
<img alt="Gewebepräparation und -schnitt für die Mikroskopie; Mikrotom-Einstellung und laufendes Schneiden; Experimentsschritte." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Methode zur Gewinnung von Gehirnschnitten, die den dLGN enthalten. (A) Werkzeuge, die zur Entnahme des Gehirns benötigt werden. (B) Schneideapparat. (C) Schnitt des Gehirns in frontalen Ebenen. (D) Kleben auf der Platte. (E) Positionierung des Gehirns auf der Platte. (F) Gehirn auf der Platte fixiert. (G) Schneiden. (H) Entnahme des Schnitts. (J) Schnitte in der Reinkubationslösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Mikroskopaufnahme des Maus-dLGN und vLGN, zelluläres Detail. Maßstabsbalken: 150 µm, 10 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2: Ansicht des Schnitts mit dem dLGN und Visualisierung von Neuronen unter dem Mikroskop. (A) Übersichtsaufnahme mit dem 4x-Objektiv des Schnitts, der das dLGN und das vLGN enthält, im Aufzeichnungsgefäß durch einen Nylonfaden fixiert. (B) Aufnahme mit dem 40x-Objektiv von dLGN-Neuronen in der kontralateralen Region des dLGN, markiert durch das gestrichelte Rechteck in Panel A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig02large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzusehen.</a>
<img alt="Elektrophysiologieergebnisse im dLGN zeigen Änderungen der Aktionspotentiale; Graphik und Datenanalyse der neuronalen Antwort." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65950/65950fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3: Induktion von LTP-IE in einem dLGN-Neuron. (A) Aufzeichnungskonfiguration und Induktionsstimulus. Der zur Induktion von LTP-IE verwendete Stimulus bestand aus 15 Impulsen von jeweils ~1 nA, um durch jeden depolarisierenden Stromimpuls ein Aktionspotential auszulösen.B) Zeitlicher Verlauf der LTP-IE. Oben: repräsentative Spuren vor (schwarz) und nach (rot) der Induktion der LTP-IE. Unten: zeitlicher Verlauf der normalisierten Anzahl von Aktionspotentialen pro depolarisierendem Reiz in Abhängigkeit von der Zeit. Beachten Sie die erhöhte Spikanzahl, die über die Zeit keine Abnahme zeigt &gt;40 min. (C) Stabilität des Eingangswiderstands. Abweichung des durch einen negativen Stromschritt hervorgerufenen Potentials vor (schwarz) und nach (rot) der Induktion von LTP-IE. Der Eingangswiderstand wird mit fester Latenz gemessen (symbolisiert durch *). (D) Links: Gruppendaten von 8 dLGN-Neuronen, die die Reproduzierbarkeit von LTP-IE zeigen. Rechts: Gruppendaten von 8 dLGN-Neuronen, die das Fehlen von Rin Änderung. Panel B wird mit Genehmigung von Duménieu et al. wiederverwendet.26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/65950fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Zusatzdatei 1: Igor LTP-IE-Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65950/Supplementary%20File%201-Igor%20LTP-IE%20analysis.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induktion der langfristigen Plastizität der neuronalen intrinsischen Erregbarkeit in Relaisneuronen aus dem dorsalen lateralen Genikulatkern, der in ex vivo Hirnschnitten erhalten bleibt.

Induktion der Langzeitplastizität der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit in Neuronen des dorsalen lateralen Genikulatkerns

The dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) has long been held to act as a basic relay for visual information traveling from the retina to cortical ...

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